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1、10申请公布号CN104245727A43申请公布日20141224CN104245727A21申请号201380020491X22申请日2013041612002678620120417EPC07K14/78520060171申请人奇斯药制品公司地址意大利帕尔马72发明人A莫扎拉利S拉博尼B皮奥塞利74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人韩威威54发明名称制备表面活性肽的方法57摘要基于SPC肽和麦芽糖结合蛋白的融合蛋白的异源表达制备表面活性蛋白C肽SPC肽的方法；该方法中使用的基因构建体，载体和宿主细胞。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日201410。
2、1786PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0578792013041687PCT国际申请的公布数据WO2013/156464EN2013102451INTCL权利要求书1页说明书6页序列表3页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表3页附图3页10申请公布号CN104245727ACN104245727A1/1页21一种表达盒，其包含编码SPC肽、MBP蛋白和位于其间并携带蛋白酶切割位点的接头肽的多核苷酸序列，所述编码多核苷酸序列与适合于在原核细胞中表达的启动子序列可操作连接。2根据权利要求1的表达盒，其中所述SPC肽是SEQIDNO1。
3、所示的SPC33LEU。3根据权利要求12的表达盒，其中所述MBP蛋白如SEQIDNO2所示。4根据权利要求12的表达盒，其中所述编码SPC肽的多核苷酸序列是SEQIDNO3。5根据权利要求1和3的表达盒，其中所述编码MBP的多核苷酸序列是SEQIDNO4。6根据权利要求15的表达盒，其中所述携带蛋白酶切割位点的接头肽及其编码序列分别如SEQIDNO5和6所示。7根据权利要求16的表达盒，其中所述编码MBP的序列和编码SPC的序列分别位于N和C末端。8根据权利要求1的表达盒，其中所述启动子是诱导型TAC启动子。9含有根据权利要求18的表达盒的表达载体。10根据权利要求9的表达载体，其是质粒。1。
4、1根据权利要求10的表达载体，其是基于PBR32的质粒。12一种制备SPC肽的方法，其包括以下步骤I提供携带编码融合蛋白的表达盒的载体，所述表达盒如权利要求18所定义；II将所述载体导入到原核细胞中，并在允许表达所述融合蛋白的条件下维持所述细胞；III纯化所述融合蛋白；IV用适当的蛋白酶切割所述融合蛋白并分离所述SPC肽。13根据权利要求12的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌细菌细胞。14根据权利要求1213的方法，其中所述融合蛋白的纯化使用MBP配体连接树脂通过亲和层析进行。15根据权利要求1214的方法，其中肠激酶蛋白酶被用于所述融合蛋白的切割。权利要求书CN104245727A1/6页3。
5、制备表面活性肽的方法0001本发明提供基于重组DNA技术制备表面活性物质蛋白C肽SPC肽的方法。本发明还提供用于该方法的基因构建体、载体和宿主细胞。0002发明背景0003肺表面活性物质减少肺泡内侧的气液交界面上的表面张力，防止肺在呼气结束时塌缩。0004表面活性物质缺乏是早产儿的一种病症，引起呼吸窘迫综合征RDS，可以用从动物肺提取的天然表面活性物质对这种病症进行有效治疗参见FUJIWARA,T和ROBERTSONB1992于ROBERTSON,B,VANGOLDE,LMG和BATENBURG,B编著PULMONARYSURFACTANTFROMMOLECULARBIOLOGYTOCLINI。
6、CALPRACTICEAMSTERDAM,ELSEVIER,PP561592。0005这些表面活性物质制剂的主要成分是磷脂如1,2二棕榈酰SN甘油3磷酸胆碱DPPC、磷脂酰甘油PG和疏水表面活性蛋白B和CSPB和SPC。0006蛋白SPB和SPC仅构成表面活性物质质量的大约12，但是与纯的脂类制剂相比，仍然能极大地改善表面活性参见CURSTEDT,TETAL1987EURJBIOCHEM168,255262；。0007SPC是脂蛋白，由35个氨基酸残基组成，在残基934之间具有螺旋域参见JOHANSSON,JETAL1994BIOCHEMISTRY33,60156023。0008该螺旋主要由缬。
7、氨酰残基组成，镶嵌在脂双层中，其方向与脂酰链平行参见VANDENBUSSCHE,ETAL1992EURJBIOCHEM203,201209。0009两个棕榈酰基团与该肽的N末端部分的位置5和6的半胱氨酸残基共价连接参见CURSTEDT,TETAL1990PROCNATLACADSCIUSA87,29852989。0010位置11和12上的两个保守的带正电荷残基，可能与脂膜的带负电荷的头部基团相互作用，从而增加其刚性。0011趋向C末端，脂肽相互作用的刚性减少，因为它仅含有小的疏水性残基，使得这部分在磷脂双层中可能更具有柔性。0012由于从动物组织中获得的表面活性物质制剂可能表现出某些缺点，如它。
8、们获得的量有限以及它们可能含有致病原以及诱导免疫反应，已经尝试创造通常由合成脂类和合成的SPC和/或SPB蛋白类似物组成的人工表面活性物质。0013但是，对于合成的SPC蛋白而言，先前的工作已证明它可能不能像天然肽那样折叠成最佳表面活性所需要的螺旋构象参见JOHANSSON,JETAL1995BIOCHEMJ307,535541，因此可能不能与表面活性脂类正确地相互作用。0014为了避免这个问题，已进行了几种尝试来改变序列，例如将天然SPC中所有的螺旋VAL残基替换成LEU，LEU强烈地有助于形成螺旋构象。相应的跨膜类似物，SPCLEU当与适当的磷脂混合物组合时，在气液交界面上表现出良好的延展。
9、。0015WO2008/044109公开了SPC蛋白的肽类似物，被称为SPC33LEU，其具有下述的单字母氨基酸序列说明书CN104245727A2/6页40016IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGLSEQIDNO1。0017该肽可以通过合成方法来制备。传统的合成方法在例如SCHROEDERETAL,THEPEPTIDES,VOL1,ACADEMICPRESS,1965；BODANSZKYETAL,PEPTIDESYNTHESIS,INTERSCIENCEPUBLISHER,1996；BARAMYMERRIELD,THEPEPTIDES；ANALYSIS,SYNT。
10、HESIS,BIOLOGY,VOL2,CHAPTER1,ACADEMICPRESS,1980中描述。0018所述技术包括在固相中、溶液中进行肽合成，有机化学合成方法，或它们的任何组合。0019通过传统技术进行的合成肽如肽SPC33LEU的产生受到它们的高疏水特性的影响，从而限制了它们的水溶性。0020所述缺点通过本发明的方法被克服。0021定义0022术语“SPC肽”指天然表面活性蛋白SPC的结构类似物肽，包括具有与天然蛋白相比，一个或多个氨基酸被取代和/或缺失的氨基酸序列的肽，只要所述肽在和脂类载体的混合物中表现出类似的肺表面活性。0023发明描述0024本发明的目的是用于SPC肽生物合成的。
11、重组方法，其克服了传统技术的缺陷，并能够以令人满意的产率获得高纯产物。本发明的方法基于融合蛋白的表达，其中SPC肽通过携带蛋白酶切割位点的接头的插入，与麦芽糖结合蛋白MBP融合。0025在一个实施方案中，本发明提供含有编码SPC肽、MBP蛋白和携带蛋白酶切割位点的位于SPC肽和MBP蛋白之间的接头肽的多核苷酸序列的表达盒，所述编码多核苷酸序列与适合于在原核细胞中表达的启动子序列可操作连接。0026在一个实施方案中，SPC肽是SPC33LEUSEQIDNO1，编码序列是SEQIDNO3。在另一个实施方案中，MBP确定为SEQIDNO2，其编码序列是SEQIDNO4。与野生型MBPWTMBP即由大。
12、肠杆菌天然产生的MBP相比，麦芽糖结合蛋白SEQIDNO2具有使与直链淀粉的亲和力提高以及使SPC肽更好地折叠的突变。提高的直链淀粉亲和力对于由细菌细胞产生的融合蛋白的纯化来说很重要，如下面所讨论的。0027MBP和SPC编码序列优选分别位于表达盒的N和C末端。发现这样有利于融合SPC肽的正确折叠。0028在另一个实施方案中，接头肽为1050个、优选2040个氨基酸长，并且含有被肠激酶识别的蛋白水解位点。后者是特异性丝氨酸蛋白酶，在赖氨酸后的特定切割位点进行切割。此外，接头的编码序列可以含有适合于基因构建体的克隆和处理的一个或多个内切酶限制性位点。在优选的实施方案中，接头肽和其编码序列分别被确。
13、定为SEQIDNO5和6。0029根据本发明，可以使用任何适合于在原核细胞中调节异源蛋白表达的启动子。优选使用诱导型启动子，特别是TAC启动子，其被异丙基D1硫代半麦芽糖苷IPTG激活。0030表达盒可以进一步包括调节重组蛋白表达的组分，如转录增强子，终止子、起始子和其它基因控制元件或给重组蛋白赋予结合亲和力或抗原性的元件。0031在另一个实施方案中，本发明涉及含有上述表达盒的表达载体。优选载体是质粒，说明书CN104245727A3/6页5更优选是基于PBR32的质粒，其可以另外含有选择标记例如抗生素抗性编码序列，将重组蛋白导向分泌途径的分泌信号和允许插入异源序列的合适的限制性位点。0032。
14、在又一个实施方案中，本发明提供SPC肽的制备方法，其包括下述步骤0033I提供携带表达盒的载体，其中所述表达盒含有编码融合蛋白的多核苷酸序列，所述融合蛋白由SPC肽、MBP和位于其间并携带蛋白酶切割位点的接头肽组成，如上述所定义的；0034II将所述载体引入到原核细胞中，并在允许表达融合蛋白的条件下维持所述细胞；0035III纯化融合蛋白；0036IV用适当的蛋白酶切割融合蛋白并分离SPC蛋白。0037细菌细胞特别是大肠杆菌细胞被方便地用于SPC肽的表达。特别优选含有通过表型选择从而耐受毒性蛋白的基因突变的大肠杆菌株。0038表达融合蛋白后，使细胞破裂并离心细胞裂解物以分离包含融合蛋白的细胞级。
15、分。0039融合蛋白的纯化优选使用MBP配体结合树脂通过亲和层析的方式进行。优选地，粗细胞提取物被加载到含有用直链淀粉衍生化的琼脂糖树脂的柱上，并用含有合适量麦芽糖的缓冲液洗脱以从树脂上移除融合蛋白。0040对融合蛋白的最后切割释放SPC肽，其随后用传统技术分离。优选使用肠激酶蛋白酶切割融合蛋白的接头区域，如果存在合适的蛋白酶切割位点的话。0041与类似的重组系统中测试的其它蛋白标签不同，MBP证明用于表达和后续纯化与之融合的SPC肽是特别有效的。0042实验部分0043MBP融合蛋白的克隆策略0044SPC33LEU在细菌中以与麦芽糖结合蛋白MBP的融合蛋白的形式表达。表达载体PMALC5E。
16、NEWENGLANDBIOLABS编码MBP并为编码SPC33LEU的DNA片段的框内克隆提供5AVAI和3BAMHI切割位点。表达载体含有氨苄青霉素抗性基因并衍生自PBR322。MBP和SPC33LEU通过肽接头被连接在一起，所述肽接头含有被肠激酶识别的蛋白水解位点，所述肠激酶是一种在赖氨酸后特定切割位点ASPASPASPASPLYS进行切割的特异性丝氨酸蛋白酶。市售的MBP接头序列由前面加上甲硫氨酸并且最后4个氨基酸被由PMALC5E多接头编码的21个残基加上C末端甘氨酸取代的来自大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白组成。0045原始的商业多接头被改造以包含几个新的内切酶限制性位点SEQIDNO5和6。
17、。0046SPC33LEU核苷酸序列在基因合成服务提供的合适的穿梭载体中被合成和克隆。由基因合成服务按照大肠杆菌密码子使用频率优化核苷酸序列。密码子优化仅仅改变核酸序列而不改变编码的氨基酸序列。基因设计和优化策略使用专有的软件WOA04/059556和WOA06/013103RAABD,GRAFM,NOTKAF,T和WAGNERR“THEGENEOPTIMIZERALGORITHMUSINGASLIDINGWINDOWAPPROACHTOCOPEWITHTHEVASTSEQUENCESPACEINMULTIPARAMETER说明书CN104245727A4/6页6DNASEQUENCEOPTI。
18、MIZATION”SYSTSYNTHBIOL2010；4215225；MAERTENSB,SPRIESTERSBACHA,VONGROLLU,ROTHU,KUBICEKJ,GERRITSM,GRAFM,LISSM,DAUBERTD,WAGNERR,和SCHAFERF“GENEOPTIMIZATIONMECHANISMSAMULTIGENESTUDYREVEALSAHIGHSUCCESSRATEOFFULLLENGTHHUMANPROTEINSEXPRESSEDINESCHERICHIACOLI”PROTEINSCIENCE2010；1913121326。优化参数包括密码子使用，DNA基序如核糖。
19、体进入位点，GC含量和反向重复的避免。序列编码用于后续亚克隆的IAVAI特异性5，IIBAMHI特异性3末端，IIISPC33LEU序列之前的肠激酶切割位点，并提供TAA终止密码子以终止核糖体翻译。AVAI和BAMHI是限制性内切酶。AVAI识别双链核苷酸序列CYCGRG其中YT/C，且RA/G并在C1之后进行切割。BAMHI识别序列GGATCC，并在G1之后进行切割。两种酶都产生粘性末端。优化的基因然后由合成寡核苷酸组装从头基因合成，并使用SI和SI克隆位点克隆到PMAT载体中。最终的构建体通过测序验证。0047表达SPC33LEU的质粒的制备、DNA扩增、质粒分离、纯化和在电转化感受态大肠。
20、杆菌细胞中的转化，使用通常在SAMBROOKANDRUSSEL,MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL,CSHLPRESS2001中所讨论的重组DNA技术的传统方法进行。0048对于亚克隆，用AVAI和BAMHI消化SPC33LEU序列以产生突出的单链末端。在载体的AVAI/BAMHI消化、去磷酸化、通过琼脂糖凝胶电泳纯化所需载体DNA片段、以及SPC33LEU片段和载体片段通过粘性末端杂交之后，发生向载体中的整合。随后通过使用T4DNA连接酶NEWENGLANDBIOLAB连接，将两个片段共价连接，然后转化到细菌宿主细胞中。含质粒细胞的选择通过接种到含氨苄青霉素的。
21、LB琼脂平板上来进行。从获得的AMP抗性菌落中分离质粒DNA并用合适的限制性酶分析。选择具有所期望的DNA限制性片段模式的菌落。由BMRGENOMICSPADUA大学对质粒序列进行的完整测序证实SPC33LEU序列的正确插入。0049生产菌株0050用于表达SPC33LEU的生产菌株大肠杆菌C41DE3和C43DE3，衍生自大肠杆菌BL21DE3并可以从LUCIGEN购买。这些菌株据报道能有效过表达病毒、真细菌、古细菌、植物、酵母、果蝇或哺乳动物来源的毒性和膜蛋白，因为这些菌株具有至少一个未表征的UNCHARACTERIZED突变，阻止了与多个重组毒性蛋白表达相关的细胞死亡。0051蛋白表达0。
22、052重组质粒允许在TAC启动子的控制下表达融合蛋白MBPSPC33LEU。在用异丙基D1硫代半乳糖苷IPTG诱导后，重组融合蛋白在宿主细胞中以可溶形式产生。0053用接种在LB平板上的甘油培养物接种1ML预培养物或起子培养物LURIABERTANI培养基10G/L胰蛋白胨，5G/L酵母提取物，和10G/LNACL，在存在10MM葡萄糖的条件下，并在强氨苄青霉素选择压力下在37温育，摇动过夜。使用该培养物接种5ML培养物。使细菌继续生长，直至其达到600NM处约06的光密度。然后通过加入IPTG诱导培养物。诱导之后继续生长45个小时，直至在4离心收获细胞。将湿生物质重悬于20MMNH4HCO3。
23、缓冲液，PH75中。在冰上通过超声使细胞悬液破裂。细菌裂解后，在12LAEMMLI还原的SDSPAGE凝胶上检查表达混合物，以评价总蛋白含量。将新条带做为融合蛋白的鉴别使用兔抗MBP抗血清NEB进行免疫印迹来证实。在半干装置中在硝酸纤维素说明书CN104245727A5/6页7膜上进行印迹，在10V进行40分钟。含有3脱脂牛奶的PH80TRIS缓冲液被用作封闭缓冲液。在封闭缓冲液中按110,000稀释初级抗体并在室温温育1小时。抗兔IGG过氧化物酶缀合物被用作二级抗体与辣根过氧化物酶底物，3,3,5,5四甲基联苯胺TMB结合，以进行检测所有免疫印迹试剂购自SIGMAALDRICH。诱导之后，通。
24、过SDSPAGE和免疫印迹检测到具有融合蛋白的正确分子量的新的主要条带，所述融合蛋白相应于MBP和SPC33LEU片段的组合。0054融合蛋白的纯化0055使用MBP亲和层析帮助融合蛋白从表达混合物分离。粗细胞提取物被加载到含有用直链淀粉衍生化的琼脂糖树脂的柱PMAL蛋白融合和表达系统，NEWENGLANDBIOLABS上。融合蛋白由于MBP与直链淀粉的亲和力而与柱结合，并用含有10MM麦芽糖的20MMNH4HCO3缓冲液，PH75洗脱。含有感兴趣的融合蛋白的洗脱液在12LAEMMLI还原的SDSPAGE凝胶上进行分析，并用抗MBP血清通过免疫印迹进行鉴别。0056MBPSPC33LEU融合蛋。
25、白的产量是每升培养物5080MG。0057后续的用肠激酶分离MBP和SPC33LEU的切割发生在MBPSPC33LEU的LYS393和ILE394之间。ILE394相应于SPC33LEU肽的第一个氨基酸。0058融合蛋白的切割0059为了在LYS393连接氨基酸处进行融合蛋白的切割，向溶液中加入每MG融合蛋白002单位的肠激酶。向切割溶液中加入1V/WTRITONX100以保持被切割的消化疏水性产物SPC33LEU的溶解性。溶液在室温温和搅拌16小时。0060蛋白产物SPC33LEU的质谱表征0061应用两种不同的程序以表征MBPSPC33LEU融合蛋白的消化产物。MALDIMS高分辨率方法的。
26、目的在于确定产物的单一同位素分子量并评价正确序列的表达盒肠激酶对融合蛋白的正确切割。选择HPLCESMS作为初步评价重组产物相对于参考标准的杂质分布，以及评价批次的重复性的方法。0062附图描述0063图1MALDI光谱分析揭示SPC33LEU存在于消化后的溶液中。计算的单一同位素质量为359452DA，其相对于由氨基酸序列计算得到的理论单一同位素质量差异在22PPM以内。0064图2MBP接头MW平均43206DA的存在通过低分辨率MALDIMS方法测定。没有观察到可检测量的MBP接头SPC33LEU，表明所应用的蛋白水解反应条件导致定量过程。0065图3对杂质的初步评价也通过MALDIMS。
27、和HPLCESIMS在两个独立获得的批次标记为批次1和批次2之间进行。它们显示出相当的纯度水平。通过LCMS进行的产品SPC33LEU的定量是相对于SPC33LEU参考标准进行的。独立获得的两个批次被测定，并且蛋白产量被测定表。0066表0067说明书CN104245727A6/6页8说明书CN104245727A1/3页900010002序列表CN104245727A2/3页100003序列表CN104245727A103/3页11序列表CN104245727A111/3页12图1说明书附图CN104245727A122/3页13图2说明书附图CN104245727A133/3页14图3说明书附图CN104245727A14。