一种测定环吡酮胺的方法.pdf

本发明公开了一种测定环吡酮胺的方法。本方法选用C18亲水填料的色谱柱，利用β-环糊精对环吡酮胺的包合作用，以β-环糊精水溶液和乙腈的混合溶液作为流动相，采用紫外检测器，可用于环吡酮胺乳膏中有效成分环吡酮胺的定量测定。本发明具有检测限低，线性范围宽，其线性范围很好的覆盖了环吡酮胺的用药浓度范围，因此可以很好的用于药物生产过程中环吡酮胺的快速检测及临床用药监测。

1.  一种测定环吡酮胺的方法，其步骤是：
a.环吡酮胺标准品溶液的制备
用乙腈作为溶剂配制环吡酮胺标准品贮备液：移取一定体积的贮备液，用乙腈稀释至若干份不同浓度的溶液，然后将上述标准溶液置于紫外灯下照射，制得标准溶液；
b.样品的预处理
准确称取适量环吡酮胺乳膏，置于10mL容量瓶中，加入无水乙醇7mL，超声20min后用无水乙醇定容，继续超声5min，用0.45μm有机微孔滤膜过滤，移取1.0mL滤液于10mL容量瓶中，用乙腈定容摇匀，然后将上述标准溶液置于紫外灯下照射，进样前用0.45μm有机膜过滤；
c.液相色谱的测定
采用C18亲水填料的色谱柱，以pH一定的β-环糊精水溶液为水相与有机相乙腈混合作为流动相，流动相流速为1mL/min，柱温为30～50℃，紫外检测波长为298±5nm；进样量为20μL，分别进样标准溶液和样品溶液，采用峰面积对浓度绘制工作曲线，得到线性回归方程为：y＝ax+b，利用样品溶液峰面积A结合上述工作曲线计算出环吡酮胺软膏中环吡酮胺的百分含量，计算公式如下：
样品溶液浓度：c=A-ba(ppm)---(1)]]>
(1)式中：A是样品溶液峰面积；a、b分别是线性回归方程为：y＝ax+b中的斜率和截距；
环吡酮胺软膏中环吡酮胺的百分含量：w=100cM×100%---(2)]]>
(2)式中c是样品溶液浓度；M是环吡酮胺乳膏质量。

一种测定环吡酮胺的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种测定环吡酮胺的方法，更具体的说是一种通过环糊精包合环吡酮胺来测定环吡酮胺乳膏中环吡酮胺的高效液相色谱方法。
背景技术
环吡酮胺又名环吡司胺、环匹罗司胺。分子式为C₁₄H₂₄N₂O₃，其结构式如下：

分子量为268.36，具有低毒性和强力的血清渗透的特点，它对皮肤真菌、白色念珠菌等有强力的灭菌作用，在治疗真菌引起的皮肤角质化疾病上有较好的效果。其浓度为4～8μg/ml时可抑制皮肤真菌和酵母菌，较高浓度(16～78μg/ml)时对大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌等也有抑制作用(引自文献1：United States Pharmacopoeia 28-NF23，United States Pharmacopoeia Convention，Inc.，Rockville，MD，2005，p.470.)。由此可知，环吡酮胺的浓度对于抑制表皮或黏膜的浅表真菌和白色念珠菌感染是非常重要的。目前定量检测环比酮胺浓度的方法有如下几种：
分光光度法测定环吡酮胺虽然是最常用的检测技术(引自文献2：艾玉锁，环吡酮胺乳膏含量的分光光度法测定；西北药学杂志.19905(1)2～3)，但由于其在精确定量和在同类化合物中特异性测定环吡酮胺的不足，该方法不能应用于稳定性研究及药物生产过程中的质量控制。另有文献(引自文献3：Escarrone，A.L.V.et al LC-UV method with pre-columnderivatization for the determination of ciclopirox olamine in raw material andtopical solution Chromatographia 200867(11-12)967-971)介绍，使用高效液相色谱柱前衍生的办法定量检测环吡酮胺，必须经过复杂的柱前衍生步骤，但衍生化过程使得其它组分不稳定，并不适用于药物生产过程中的快速检测。
美国药典(USP)有一种用高效液相色谱法检测环吡酮胺的方法(引自文献1：United States Pharmacopoeia 28-NF23，United States PharmacopoeiaConvention，Inc.，Rockville，MD，2005，p.470.)，在其条件下，由于伯羟基基团与金属盐离子的强烈螯合效应，环吡酮胺的物质峰有严重的拖尾现象。为了降低螯合效应，在实验前，先用水∶乙腈∶冰醋酸∶乙酰丙酮(500∶500∶1∶1)的混合洗脱液，冲洗色谱柱至少15h，再用流动相冲洗至少5h。但是，即使经过了如此长时间的冲洗，这个方法仍然不能成功的检测环吡酮胺。
发明内容
在上述前人工作的基础上，本发明的目的在于提供一种测定环吡酮胺的方法。该方法利用β-环糊精的包合作用，将β-环糊精添加到高效液相色谱的流动相中，使其与环吡酮胺形成特殊的包合物，降低其在色谱柱上的吸附作用，利用紫外检测器检测环吡酮胺。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种测定环吡酮胺的方法，其步骤是：
a.环吡酮胺标准品溶液的制备
用乙腈作为溶剂配制环吡酮胺标准品贮备液：移取一定体积的贮备液，用乙腈稀释至若干份不同浓度的溶液，然后将上述标准溶液置于紫外灯下照射，制得标准溶液；
b.样品的预处理
准确称取适量环吡酮胺乳膏，置于10mL容量瓶中，加入无水乙醇7mL，超声20min后用无水乙醇定容，继续超声5min，用0.45μm有机微孔滤膜过滤，移取1.0mL滤液于10mL容量瓶中，用乙腈定容摇匀，然后将上述标准溶液置于紫外灯下照射，进样前用0.45μm有机膜过滤；
c.液相色谱的测定
采用C18亲水填料的色谱柱，以pH一定的β-环糊精水溶液为水相与有机相乙腈混合作为流动相，流动相流速为1mL/min，柱温为30～50℃，紫外检测波长为298±5nm；进样量为20μL，分别进样标准溶液和样品溶液，采用峰面积对浓度绘制工作曲线，得到线性回归方程为：y＝ax+b，利用样品溶液峰面积A结合上述工作曲线计算出环吡酮胺软膏中环吡酮胺的含量，计算公式如下：
样品溶液浓度：c=A-ba(ppm)---(1)]]>
(1)式中：A是样品溶液峰面积；a、b分别是线性回归方程为：y＝ax+b中的斜率和截距；
环吡酮胺软膏中环吡酮胺的百分含量：w=100cM×100%---(2)]]>
(2)式中c是样品溶液浓度；M是环吡酮胺乳膏质量；
本发明的优点：该发明作为一种测定环吡酮胺方法，将β-环糊精添加到流动相中，利用β-环糊精对环吡酮胺的包合作用，克服了环吡酮胺在色谱柱上强烈吸附不能够被洗脱导致其无法定量测定的缺点，从而找到一种有效测定环吡酮胺的方法。该发明具有检测限低(检测限可达到0.01ppm)，线性范围宽(0.31～75.00ppm)，回收率为95.9％，RSD＝4.38％，其线性范围很好的覆盖了环吡酮胺的用药浓度范围(4～8μg/ml)，因此可以很好的用于药物生产过程中环吡酮胺的快速检测及临床用药监测。
附图说明
图1是β-环糊精包合环吡酮胺结构示意图。
图2是环吡酮胺纯品标准色谱图。
图3是环吡酮胺标准工作曲线。
图4是环吡酮胺乳膏实际样品色谱图，1为样品1的峰，2为样品2的峰。
具体实施方法
本发明采用Varian高效液相色谱(包括ProStar 210泵，7725i进样阀为20μL进样环，紫外检测器为ProStar325，色谱数据分析系统为StarWS)和AE.LICHROM C18 5μm 150×4.6mm色谱柱；
一种测定环吡酮胺的方法，其实施过程分为以下四个步骤：
a.环吡酮胺标准品溶液的制备
取5.0mg环吡酮胺标准品，用乙腈定容于5mL容量瓶中，制得1mg/mL的贮备液；分别移取体积为1.55μL、3.15μL、6.25μL、12.50μL、25.00μL、50.00μL、100.00μL、250.005μL、375.00μL的贮备液，用乙腈稀释至浓度分别为0.31ppm、0.63ppm、1.25ppm、2.50ppm、5.00ppm、10.00ppm、20.00ppm、50.00ppm、75.00ppm的溶液。然后将上述标准溶液置于紫外灯下照射24小时，制得标准溶液。
b.样品的预处理
准确称取环吡酮胺乳膏0.10g、0.20g(湖北科田药业有限公司生产)，分别标记为样品1、样品2；然后分别置于10mL容量瓶中，加入无水乙醇7mL，超声20min后用无水乙醇定容，继续超声5min，用0.45μm有机微孔滤膜过滤，移取1.0mL滤液于待用的10mL容量瓶中，用乙腈定容并摇匀，然后将上述定容溶液置于紫外灯下照射24小时，进样前将溶液用0.45μm有机膜过滤。
c.工作曲线的绘制
本发明的工作曲线的绘制，采用C18亲水填料的色谱柱，以pH＝4.0的13.2mmol/L的β-环糊精水溶液∶乙腈＝50∶50(V/V)为流动相，流动相流速为1mL/min，柱温为40℃，紫外检测波长为298nm；依次进样a步骤中制备好的一定浓度标准环吡酮胺标准溶液20μL，β-环糊精与环吡酮胺形成包合物，被流动相洗脱，然后采用峰面积对浓度绘制工作曲线，线性回归方程为：y＝9.6519x+2.3721，线性范围为0.31～75.00ppm，线性相关系数R²＝0.9994，工作曲线见图3。
d.样品的测定
取20μL处理好的环吡酮胺乳膏样品进样，在上述c步骤条件下进行测定。根据公式(1)、公式(2)，用峰面积结合上述工作曲线计算出环吡酮胺软膏中环吡酮胺的百分含量。
由图4样品色谱图可知，谱图中样品峰1与样品峰2的面积之比等于b步骤中样品1与样品2的质量比，可见在0.31～75.00ppm的线性范围内，环吡酮胺的定量测定是准确的；进而结合样品1和样品2的质量计算出环吡酮胺软膏中环吡酮胺的百分含量均为1％，与该软膏的产品说明书是一致的。