一种稳定的脂肪酶试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104215632 A (43)申请公布日 2014.12.17 CN 104215632 A (21)申请号 201410433105.6 (22)申请日 2014.08.28 G01N 21/78(2006.01) (71)申请人 宁波瑞源生物科技有限公司 地址 315000 浙江省宁波市江北区兴甬路 88 号 (72)发明人 谢蒙 张闻 周海滨 王建飞 (74)专利代理机构 宁波市鄞州盛飞专利代理事 务所 ( 普通合伙 ) 33243 代理人 张向飞 (54) 发明名称 一种稳定的脂肪酶试剂盒 (57) 摘要 本发明公开的稳定的脂肪酶试剂盒， 包括 试 剂 R1。

2、 ： 缓 冲 液 10-200mmol/L ； 脱 氧 胆 酸 钠 0.05-5g/L ； 牛磺脱氧胆酸钠 0.05-10g/L ； 辅脂 肪 酶 0.1-5mg/L ； 氯 化 钙 1-20mmol/L ； 防 腐 剂 0.01-1； 表面活性剂 0.01-1； 试剂 R2 ： 酒石酸 10-200mmol/L ； 牛黄脱氧胆酸钠 0.1-10g/L ； 防腐 剂 0.01-1； 助溶剂 0.01-2； 乳化剂 0.01-2； 稳定剂 0.01-2； 6- 甲基试卤灵 0.1-0.5mmol/L。 本发明的试剂盒， 灵敏度高， 误差小， 质量稳定， 便 于保存， 对底物有很强的保护作用， 提。

3、高了试剂的 稳定性， 检测效果好， 有较大的临床应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书13页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104215632 A CN 104215632 A 1/1 页 2 1. 一种稳定的脂肪酶试剂盒， 其特征在于 ： 所述稳定的脂肪酶试剂盒包括 2. 根据权利要求 1 所述的稳定的脂肪酶试剂盒， 其特征在于 ： 所述缓冲液为 tris 缓冲 液、 Good s 缓冲液、 mops 缓冲液、 hepes 缓冲液中的一种。 3. 根据权利。

4、要求 1 所述的稳定的脂肪酶试剂盒， 其特征在于 ： 所述防腐剂为叠氮钠、 proclin300、 mit 中的一种。 4. 根据权利要求 1 所述的稳定的脂肪酶试剂盒， 其特征在于 ： 所述表面活性剂为 TritonX-100、 吐温 80、 brij-35、 二月桂甘油硫酸酯中的一种。 5. 根据权利要求 1 所述的稳定的脂肪酶试剂盒， 其特征在于 ： 所述助溶剂为丙酮、 甲 醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇中的一种。 6. 根据权利要求 1 所述的稳定的脂肪酶试剂盒， 其特征在于 ： 所述乳化剂为二月桂甘 油硫酸酯、 TritonX-100、 Triton-114、 吐温 80、 brij-3。

5、5 中的一种。 7.根据权利要求1所述的稳定的脂肪酶试剂盒， 其特征在于 ： 所述稳定剂为DMSO、 甘露 醇、 巯基乙酸中的一种。 8. 根据权利要求 1 所述的稳定的脂肪酶试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂 R2 采用如下 方法配置， 依次将酒石酸、 牛黄脱氧胆酸钠、 防腐剂、 乳化剂、 稳定剂加入水中溶解， 加热到 37即可。 权 利 要 求 书 CN 104215632 A 2 1/13 页 3 一种稳定的脂肪酶试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种生物检测试剂， 特别是一种稳定的脂肪酶试剂盒。 0002 举例说明本申请中部分符号的含义 ： 0003 防腐剂 0.01-1表示每 1。

6、00 毫升溶液中添加防腐剂 0.01-1g。 0004 本申请中类似之处， 均表示此类含义， 另有说明的除外。 背景技术 0005 脂肪酶 (Lipase EC3.1.1.3.， LPS， 甘油酯水解酶 ) 是一类水解油酯的酶类。脂 肪酶的水解底物一般是天然油脂， 其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键。它 不同于其它水解酶， 脂肪酶催化作用系统是一种非均相体系， 水溶性的酶催化作用发 生在水不溶性底物和水的界面上， 这种界面上的催化作用机制不甚清楚， 不能简单用 Michaelis2Menten学说解释酶与底物间的反应机制。 有人提出了脂肪酶在油-水界面上定 位的假设， 提出了 “超底物。

7、” 的模型， 该模型能解释脂肪酶的一些行为， 但还需要进一步的实 验证明和修正。此外， 脂肪酶兼具有逆向催化甘油和游离脂肪酸合成甘油脂活性。脂肪酶 在临床的意义 ： 正常人血液 LPS 含量极少， 但在急性胰腺炎时， 2 12h 血液 LPS 显著升高， 24h至峰值， 可达正常值上限的10倍， 甚至50倍， 至4872h可能恢复正常， 但随后又可持 续升高 8 15 天。由于血液 LPS 在急性胰腺炎时活性升高的时间早， 上升的幅度的大， 持 续的时间长， 故其诊断价值优于淀粉酶。临床观察发现， 凡血液 AMY 升高的病例， 其 LPS 均 升高 ； 而 LPS 升高者 AMY 不一定升高，。

8、 约有 2/3AMY 正常的胰腺炎病人， 其 LPS 正常 ； 非胰腺 炎的急腹症有血液 AMY 升高而 LPS 不升高。酗酒、 乙醇性胰腺炎、 慢性胰腺炎、 胰腺癌、 肝胆 疾患等血液 LPS 可有不同程度的升高。迄今测定 LPS 的方法可分为 3 类 ： 测定产物 ( 游 离脂肪酸 ) 的增加 ( 如滴定法、 比色法、 分光光度法、 荧光法和 pH 电极法等 ) ； 测定底物 的减少量 ( 如比浊法、 扩散法等 ) ； 测定 LPS 的实际质量 ( 双抗体夹心免疫分析法、 乳胶 凝集法)。 目前在国内大多实验室主要以滴定法、 比浊法和分光光度法为主。 分光光度法目 前有两类比较常用 ： 酶。

9、偶联显色比色法， 多用1， 2-甘油二酯为底物， 在LPS和单酸甘油酯 脂肪酶的催化下， 水解生成甘油和脂肪酸， 甘油通过甘油激酶作用生成 3- 磷酸甘油， 再通 过甘油磷酸氧化酶 / 过氧化物酶体系和 4-AAP 色素原体系产生紫红色。于 550nm 波长连续 监测吸光度的变化即可计算 LPS 活性。此类方法特异性高， 通过双试剂也基本可解决内源 性甘油的干扰问题。 1， 2-o- 二月桂外消旋甘油 -3- 戊酸 -(6- 甲基试卤灵 ) 酯设计的连 续监测法。该底物在碱性环境中， 在 LPS 和辅脂肪酶作用下， 水解生成 1， 2-0- 二月桂基甘 油和戊二酸 -6 - 甲基试卤灵。后者不。

10、稳定， 可自发分解生成戊二酸和甲基试卤灵。甲基试 卤灵在 581nm 波长处有吸收峰， 连续监测其吸光度变化可定量测定 LPS 活性。此法具有简 便、 快速、 灵敏、 稳定和抗干扰能力强等特点。但是酶偶联显色法， 工具酶的价格昂贵， 而且 酶来源少且不稳定， 很少有厂家用这种方法。底物水解法， 底物极不稳定， 试剂的本底升高 的极快， 造成试剂要每天定标。浪费试剂也浪费校准品。而且会造成结果的不准确。因此 亟待寻求更好的检测方法。并且现有的试剂不便于保存， 极易发生水解、 破乳， 并且长期放 说 明 书 CN 104215632 A 3 2/13 页 4 置会发生沉淀， 质量不稳定， 不便于保。

11、存， 成本高昂。 发明内容 0006 为解决上述问题， 本发明公开了一种稳定的脂肪酶试剂盒， 有效解决了试剂稳定 性， 降低了脂肪酶检测试剂的使用成本， 提高了使用便利性， 提高了检测效率和检测精度。 0007 本发明公开的稳定的脂肪酶试剂盒包括 0008 0009 作为一种优选， 缓冲液为 tris 缓冲液、 Good s 缓冲液、 mops 缓冲液、 hepes 缓冲 液中的一种。 0010 作为一种优选， 防腐剂为叠氮钠、 proclin300、 mit 中的一种。 0011 作为一种优选， 表面活性剂为 TritonX-100、 吐温 80、 brij-35、 二月桂甘油硫酸酯 中的一。

12、种。 0012 作为一种优选， 助溶剂为丙酮、 甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇中的一种。 0013 作为一种优选， 乳化剂为二月桂甘油硫酸酯、 TritonX-100、 Triton-114、 吐温 80、 brij-35 中的一种。 0014 作为一种优选， 稳定剂为 DMSO、 甘露醇、 巯基乙酸中的一种。 0015 作为一种优选， 试剂 R2 采用如下方法配置， 依次将酒石酸、 牛黄脱氧胆酸钠、 防腐 剂、 乳化剂、 稳定剂加入水中溶解， 加热到 37即可， 其中水为去离子水或二次蒸馏水。 0016 本发明试剂盒检测机理为 ： 0017 说 明 书 CN 104215632 A 4 3/1。

13、3 页 5 0018 0019 本发明经过研究实验， 在试剂盒中加入乳化剂二月桂甘油硫酸酯和稳定剂 DMSO， 并且在37的环境下， 加入底物。 这样的配制方法， 未见文献报道。 得到的溶液澄清并且稳 定， 相关性也极好。 附图说明 0020 图 1、 本发明公开的稳定的脂肪酶试剂盒的实施例 1 与与罗氏试剂的相关性图。 具体实施方式 0021 下面结合附图和具体实施方式， 进一步阐明本发明， 应理解下述具体实施方式仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 0022 本发明公开的稳定的脂肪酶试剂盒包括 0023 0024 0025 作为一种优选， 缓冲液为 tris 缓冲液、 Good s。

14、 缓冲液、 mops 缓冲液、 hepes 缓冲 说 明 书 CN 104215632 A 5 4/13 页 6 液中的一种。 0026 作为一种优选， 防腐剂为叠氮钠、 proclin300、 mit 中的一种。 0027 作为一种优选， 表面活性剂为 TritonX-100、 吐温 80、 brij-35、 二月桂甘油硫酸酯 中的一种。 0028 作为一种优选， 助溶剂为丙酮、 甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇中的一种。 0029 作为一种优选， 乳化剂为二月桂甘油硫酸酯、 TritonX-100、 Triton-114、 吐温 80、 brij-35 中的一种。 0030 作为一种优选， 稳。

15、定剂为 DMSO、 甘露醇、 巯基乙酸中的一种。 0031 作为一种优选， 试剂 R2 采用如下方法配置， 依次将酒石酸、 牛黄脱氧胆酸钠、 防腐 剂、 乳化剂、 稳定剂加入水中溶解， 加热到 37。底物用助溶剂溶解后， 加入到上述溶液中， 并搅拌 30 分钟。加热的目的是为了得到稳定的， 澄清的乳液。 0032 实施例 0033 测试条件与方法 0034 波长580nm校正类型线性 添加量 ( 样本 /R1/R2， 1)4/200/50血清 +R1 时间3 5min 方法速率法加入 R2 后反应时间4min 校正方法两点定标反应方向向上 0035 0036 0037 0038 本发明关于试剂。

16、 R2 的配置均采用以下步骤 ： 0039 依次将酒石酸、 牛黄脱氧胆酸钠、 防腐剂、 乳化剂、 稳定剂加入水中溶解， 加热到 说 明 书 CN 104215632 A 6 5/13 页 7 37即可， 底物用助溶剂溶解后， 加入到上述溶液中， 并搅拌 30 分钟。以下所有实施例中同 样适用。 0040 实施例 1 0041 0042 在 LPS 测试中， 本发明实施例 1 与罗氏试剂测试的相关性实验 ： 0043 样本编号 罗氏试剂实施例 1 19.89.6 232.631.6 317.517.6 434.135.1 0044 563.163 643.442.9 733.833.8 说 明 。

17、书 CN 104215632 A 7 6/13 页 8 849.849.5 936.435.7 1025.526.1 1119.619.4 1285.687.1 1322.522.9 1447.946.1 1528.728.5 1677.476.9 1744.643.8 1816.916.7 1955.455.2 2046.845.2 2144.544.1 2244.944.5 2351.351.1 2436.436.1 2531.231 2642.141.1 2733.331 2845.644.2 2928.927.9 3037.436.5 0045 稳定性沉淀情况 ： 本发明实施例 1 试。

18、剂与对照试剂 ( 市售如罗氏试剂 ) 在 2-8 储存 12 个月时， 对两种试剂中沉淀含量观察结果。 说 明 书 CN 104215632 A 8 7/13 页 9 0046 时间对照试剂本发明实施例 1 1 个月无沉淀无沉淀 2 个月无沉淀无沉淀 3 个月无沉淀无沉淀 4 个月有少量沉淀无沉淀 5 个月有少量沉淀无沉淀 6 个月有少量沉淀无沉淀 7 个月有少量沉淀无沉淀 8 个月有少量沉淀无沉淀 9 个月有少量沉淀无沉淀 10 个月 较多沉淀无沉淀 11 个月 较多沉淀无沉淀 12 个月 较多沉淀无沉淀 0047 稳定性灵敏度变化 ： 本发明实施例1试剂与对照试剂(市售如罗氏试剂)在2-8。

19、 储存 12 个月时， 对两种试剂的灵敏度进行观察。 0048 时间对照试剂本发明实施例 1 0 个月480510 1 个月480510 3 个月465509 6 个月451493 12 个月420486 0049 综上所述可见， 本实施例试剂， 对 LPS 测定响应精确， 灵敏度高， 与市售试剂相比 具有更高的响应精度和相关性， 并且具有良好稳定性， 在长期保存中不易产生沉淀， 同时有 效抑制了试剂中活性成分在储存中的衰减， 从而有效地保证了试剂的使用稳定性， 延长了 试剂的使用寿命和有效期， 使得使用更为方便灵活， 降低 LPS 测试成本， 便于推广。 说 明 书 CN 104215632。

20、 A 9 8/13 页 10 0050 实施例 2 0051 0052 实施例 3 0053 0054 说 明 书 CN 104215632 A 10 9/13 页 11 0055 实施例 4 0056 0057 实施例 5 0058 说 明 书 CN 104215632 A 11 10/13 页 12 0059 0060 实施例 6 0061 0062 实施例 7 0063 说 明 书 CN 104215632 A 12 11/13 页 13 0064 0065 实施例 8 0066 0067 实施例 9 说 明 书 CN 104215632 A 13 12/13 页 14 0068 006。

21、9 0070 实施例 10-18 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 缓冲液为 Good s 缓冲液。 0071 实施例 19-27 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 缓冲液为 mops 缓冲液。 0072 实施例 28-36 与实施例 1-9 的唯一区别仪在于 ： 缓冲液为 hepes 缓冲液。 0073 实施例 37-45 与实施例 19 的唯一区别仅在于 ： 防腐剂为 proclin300。 0074 实施例46-54与实施例1-9的唯一区别仅在于 ： 防腐剂为mit(甲基异噻唑啉酮)。 0075 实施例 55-63 与实施例 19 的唯一区别仅在于 ： 表面活性剂为吐温 80。

22、。 0076 实施例 64-72 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 表面活性剂为 brij-35。 0077 实施例 73-81 与实施例 19 的唯一区别仅在于 ： 表面活性剂为二月桂甘油硫酸酯。 0078 实施例 81-90 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 助溶剂为丙酮。 0079 实施例 91-99 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 助溶剂为乙醇。 0080 实施例 100-108 与实施例 19 的唯一区别仅在于 ： 助溶剂为丙醇。 0081 实施例 109-117 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 助溶剂为丁醇。 0082 实施例 118-126 与实施例 。

23、1-9 的唯一区别仅在于 ： 乳化剂为 TritonX-100。 0083 实施例 127-135 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 乳化剂为 Triton-114。 0084 实施例 136-144 与实施例 1-9 的唯一区别仪在于 ： 乳化剂为吐温 80。 0085 实施例 145-153 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 乳化剂为 brij-35。 0086 实施例 154-162 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 稳定剂为甘露醇。 0087 实施例 163-171 与实施例 1-9 的唯一区别仅在于 ： 稳定剂为巯基乙酸。 0088 本处实施例对本发明要求保护的技术。

24、范围中点值未穷尽之处， 同样都在本发明要 求保护的范围内。 说 明 书 CN 104215632 A 14 13/13 页 15 0089 鉴于本发明方案实施例众多， 各实施例实验数据庞大众多， 不适合于此处逐一列 举说明， 但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近， 故而此处不对各个实 施例的验证内容进行逐一说明， 仅以实施例 1 作为代表说明本发明申请优异之处。通过试 剂测试均能证明本发明所有列举或未列举实施例， 在对 LPS 测试精度、 响应效率、 响应相关 性、 测量范围均优于现有的技术方便， 同时在经过长期保存后均无沉淀产生， 同时有效活性 成分衰减少， 本发明技术方案的试剂盒均具有良好的质量稳定性和品质保证。 0090 本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段， 还包括 由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式， 应当指 出， 对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干 改进和润饰， 这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 104215632 A 15 1/1 页 16 图 1 说 明 书 附 图 CN 104215632 A 16 。