检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104101712 A (43)申请公布日 2014.10.15 CN 104101712 A (21)申请号 201310123319.9 (22)申请日 2013.04.10 G01N 33/68(2006.01) (71)申请人 北京勤邦生物技术有限公司 地址 102206 北京市昌平区回龙观国际信息 产业基地高新四街 8 号 (72)发明人 何方洋 万宇平 罗晓琴 杨学林 冯静 贾芳芳 杨烁 齐向武 (54) 发明名称 检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其应用 (57) 摘要 本发明提供了一种检测吡虫啉的酶联免疫试 剂盒， 它包括 ： 包被有包被原的酶标板、 特异性。

2、抗 体、 酶标记物、 吡虫啉标准品溶液、 底物显色液、 终 止液、 洗涤液、 复溶液， 所述包被原为吡虫啉偶联 抗原， 所述酶标记物为酶标记抗抗体。 本发明还公 开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测吡虫啉的 方法， 它包括 ： 首先进行样品前处理， 然后用试剂 盒进行检测， 最后分析检测结果。 本发明提供的酶 联免疫试剂盒可用于检测蔬菜、 水果中吡虫啉的 含量， 其操作简便、 费用低廉、 灵敏度高、 能够现场 监控且适合大量样本的筛查。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页。

3、 附图2页 (10)申请公布号 CN 104101712 A CN 104101712 A 1/1 页 2 1. 一种检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒， 其特征在于包括 ： 包被有包被原的酶标板、 特 异性抗体、 酶标记物、 吡虫啉标准品溶液、 底物显色液、 终止液、 洗涤液、 复溶液， 所述包被原 为吡虫啉偶联抗原， 所述酶标记物为酶标记抗抗体。 2. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于所述吡虫啉偶联抗原是由吡虫啉半抗原与 载体蛋白偶联得到， 所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、 甲状腺蛋白、 牛血清白蛋白、 兔血清蛋 白、 人血清蛋白、 卵清蛋白、 血蓝蛋白或纤维蛋白原。 3. 如权利要求 2 。

4、所述的试剂盒， 其特征在于所述吡虫啉半抗原是由氧化还原反应得 到， 分子结构式为 ： 。 4. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于所述吡虫啉特异性抗体是以吡虫啉偶联抗 原作为免疫原制备获得， 所述吡虫啉特异性抗体可为吡虫啉单克隆抗体或吡虫啉多克隆抗 体。 5. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗 体。 6. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶 或细菌提取碱性磷酸酯酶， 当标记酶为辣根过氧化物酶时， 底物显色液 A 液为过氧化氢或 过氧化脲， 底物显色液 B 液为邻苯二胺或四甲基联苯胺， 终止液为 1。

5、2mol/L 的硫酸或盐酸 缓冲液 ； 当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时， 底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液， 终止液 为 12mol/L 氢氧化钠。 7.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于所述洗涤液为pH值为7.4， 含有0.5%1.0% 吐温 -20、 0.01 0.03叠氮化钠防腐剂、 0.10.3mol/L 的磷酸盐缓冲液 ； 所述复溶液为 pH 值为 7.0、 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲液， 所述百分比为重量体积百分比。 8.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于所述吡虫啉标准品溶液的浓度分别为0g/ L、 4g/L、 12g/L、 36g/L、 108g/L、 324g/L。。

6、 9. 一种检测样品中吡虫啉含量的方法， 包括步骤 ： （1） 样品前处理 ； （2） 用权利要求 18 任一项所述的试剂盒进行检测 ； （3） 分析检测结果。 权 利 要 求 书 CN 104101712 A 2 1/6 页 3 检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其应用 技术领域 0001 本发明涉及酶联免疫检测技术， 具体涉及一种用于检测吡虫啉的酶联免疫试剂 盒， 其特别适于蔬菜、 水果样本中吡虫啉残留量的检测。 背景技术 0002 吡虫啉 （IMI） 是烟碱类超高效杀虫剂， 具有广谱、 高效、 低毒、 低残留， 害虫不易产 生抗性， 对人、 畜、 植物和天敌安全等特点， 并有触杀、 胃毒和内吸。

7、等多重作用。 0003 目前， 含 IMI 的农药产品已在 120 多个国家的 140 余种农作物上登记使用， 应用 范围涉及粮食、 经济、 果树、 茶叶和蔬菜等 60 余种作物， 防治对象涉及同翅目、 半翅目、 缨翅 目、 双翅目、 鞘翅目、 鳞翅目等 7 个目 50 多种害虫。 0004 IMI 的大量使用不仅对环境造成了严重影响， 同时畜禽因长期食用含 IMI 残留的 植物， 使其在体内富集， 最后经食物链进入人体， 危害人体健康。目前国内外已制订出多种 农产品中 IMI 的最大残留限量标准 （MRLs） 。2008 年欧盟重新审理和修正了 IMI 在近 400 种农产品中的 MRLs，。

8、 其中大部分谷物、 水果、 蔬菜中的 MRL 均为 0.05 mg/kg。美国规定谷 物、 蔬菜中 IMI 的 MRL 为 0.05 mg/kg， 畜肉产品中 IMI 的 MRL 为 0.3 mg/kg， 家禽产品中为 0.05 mg/kg。日本于 2006 年 5 月 29 日起执行的食品中农业化学品残留 “肯定列表制度” （Positive List System） 对畜、 禽产品中 IMI 的 MRLs 的规定更为苛刻， 其中不同动物的不 同组织均有相应的MRLs， 大部分肌肉组织中是0.02 mg/kg， 肝脏中为0.05 mg/kg， 脂肪中为 0.3 mg/kg， 对未制订 MRL。

9、s 的农用化学品， 其在食品中的含量执行 “一律标准” ， 即一律不能 超过 0.01 mg/kg。国内对农产品中 IMI 的 MRL 只有大致的规定， 即在谷物、 蔬菜中不超过 0.5 mg/kg， 从整体上看我国在食品中 IMI 的 MRLs 制定方面还落后于国外。 0005 从文献报道看， 有关 IMI 残留的检测方法主要集中于高效液相色谱法 （HPLC） 、 气 相色谱法 （GC） 、 电化学分析法 （EA） 和免疫分析法 （ELISA） 四个方面， 更倾向于色谱技术和 免疫检测技术。尽管色谱法是目前公认的药物残留检测方法， 但这类方法普遍存在着所需 仪器昂贵、 仪器操作技术要求高、 。

10、样品前处理繁琐和分析耗时长、 检测成本高、 不适于现场 实时检测等问题。 而药物残留免疫检测技术在残留样本检测过程中的复杂程度、 速度、 灵敏 度、 准确性、 特异性、 单位时间内样本分析容量、 检测成本等方面与仪器分析法的比较优势 突出， 几乎克服了仪器分析法所表现出来的所有不足， 近年来已经在食品质量安全检测中 得到了越来越广泛的应用， 且逐渐被人们所认可。 0006 在对环境保护和农产品安全呼声日益提高的今天， 农产品中农药残留的有效检测 手段致关重要。随着国际上对 IMI 在农产品中 MRLs 的规定日益严格， 为更好地适应进出 口贸易和保护人民的健康， 开发食品中 IMI 的残留快速。

11、检测技术势在必行。残留物的免疫 学检测方法不仅检测限低、 特异性强， 而且操作简便、 检测速度快、 检测成本低， 非常容易推 广， 是当前药物残留检测的研究热点。尽管国外已有 IMI 残留免疫学检测的文献报道， 但均 不同程度地存在着残留样本前处理程序复杂、 费用高、 检测限偏高， 不能满足国际上 IMI 在 食品中的 MRLs 等问题。因此， 找到一个更有效的方法解决这些问题， 是摆在我们面前亟待 说 明 书 CN 104101712 A 3 2/6 页 4 解决的重要问题。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种能够检测蔬菜、 水果样本中吡虫啉残留量的酶联免疫 试剂盒， 并提供一种高。

12、效、 准确、 简便、 适于大批量样品筛选的定性、 定量检测方法。 0008 本发明试剂盒， 它包括 ： 包被有包被原的酶标板、 特异性抗体、 酶标记物、 吡虫啉标 准品溶液、 底物显色液、 终止液、 洗涤液、 复溶液， 所述包被原为吡虫啉偶联抗原， 所述酶标 记物为酶标记抗抗体。 0009 所述吡虫啉偶联抗原是由吡虫啉半抗原与载体蛋白偶联得到， 所述吡虫啉半抗原 是由氧化还原反应得到， 所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、 甲状腺蛋白、 牛血清白蛋白、 兔血 清蛋白、 人血清蛋白、 卵清蛋白、 血蓝蛋白或纤维蛋白原。 0010 所述吡虫啉特异性抗体是以吡虫啉偶联抗原作为免疫原制备获得， 所述吡虫啉特 。

13、异性抗体可为吡虫啉单克隆抗体或吡虫啉多克隆抗体， 其中优选吡虫啉单克隆抗体。 0011 所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体， 其中优选羊抗鼠抗抗体。 0012 所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶， 其中优选辣 根过氧化物酶 ； 酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联 得到的。 0013 为了更方便现场监控和大量样本筛查， 所述试剂盒还包括吡虫啉标准品溶液、 底 物显色液、 终止液、 洗涤液、 复溶液。 0014 所述吡虫啉标准品溶液 6 瓶， 浓度分别为 0g/L、 4g/L、 12g/L、 36g/L、 108g/L、 324g/L。 0。

14、015 当标记酶为辣根过氧化物酶时， 所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成， A液为过氧化氢或过氧化脲， B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺， 所述终止液为12mol/L的硫 酸或盐酸缓冲液 ； 当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时， 所述底物显色液为对硝基磷酸盐 缓冲液， 所述终止液为 12mol/L 氢氧化钠溶液。 0016 所述洗涤液优选为 pH 值为 7.4， 含有 0.5%1.0% 吐温 -20、 0.01 0.03叠氮化 钠防腐剂、 0.10.3mol/L 的磷酸盐缓冲液， 所述百分比为重量体积百分比。 0017 所述复溶液优选为pH值为7.0、 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液， 所。

15、述百分比为重量体 积百分比。 0018 其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为 pH 值为 9.6， 0.05mol/L 的碳酸 盐缓冲液， 封闭液为 pH 值为 7.17.5， 含有 1%3% 酪蛋白、 0.10.3mol/L 的磷酸盐缓冲液， 所述百分比为重量体积百分比。 0019 本发明中酶标板的制备过程为 ： 用包被缓冲液将包被原稀释成 20g/ml， 每孔加 入100l， 37避光孵育2h或4过夜， 倾去孔中液体， 用洗涤液洗涤2次， 每次30s， 拍干， 然后在每孔中加入 150200l 封闭液， 37避光孵育 12h， 倾去孔内液体拍干， 干燥后用 铝膜真空密封保存。 002。

16、0 本发明的检测原理为 ： 0021 在微孔条上预包被吡虫啉偶联抗原， 加入样本溶液或标准品溶液后， 再加入吡虫 啉特异性抗体溶液， 样本中的吡虫啉与酶标板上包被的吡虫啉偶联抗原竞争抗吡虫啉特异 说 明 书 CN 104101712 A 4 3/6 页 5 性抗体， 加入酶标记抗抗体进行放大作用， 用显色液显色， 样本吸光度值与吡虫啉的含量呈 负相关， 与标准曲线比较即可得到样本中吡虫啉的残留量 ； 同时根据酶标板上颜色的深浅， 与系列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中吡虫啉残留量的浓度范围。 0022 本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测吡虫啉的方法， 它包括步骤 ： 002。

17、3 （1） 样品前处理 ； 0024 （2） 用试剂盒进行检测 ； 0025 （3） 分析检测结果。 0026 本发明检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒主要采用竞争 ELISA 方法定性或定量检测 样品中吡虫啉的含量 ； 对样品的前处理要求低， 样品前处理过程简单， 能同时快速检测大批 量样品 ； 主要试剂以工作液的形式提供， 检验方法方便易行， 具有特异性高、 灵敏度高、 精确 度高、 准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒， 结构简单、 使用方便、 价格便宜、 携带便 利、 检测方法高效、 准确、 简便、 适于大批量样品筛选的定性、 定量。 附图说明 0027 图 1 ： 吡虫啉半抗原合成路线图 。

18、0028 图 2 ： 吡虫啉半抗原核磁共振氢谱图 0029 图 3 ： 试剂盒标准曲线图 具体实施方式 0030 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本 发明， 而不用来限制本发明的范围。 0031 实施例 1 试剂盒组分的制备 0032 1、 吡虫啉半抗原的制备 0033 100ml 二口瓶中加入吡虫啉 0.25g， 1ml 的二甲基甲酰胺 （DMF） ， 水合氯化锡 0.75g 和10ml的乙醇， 氮气排空， 控温65反应40min， 反应液显褐色， 薄层色谱 （TLC） 检测反应完 全。处理 ： 降温至室温， 加乙酸乙酯 50ml， 加饱和碳酸氢钠水溶液。

19、调节至弱碱性， 大量盐析 出， 乙酸乙酯 40ml2 次萃取浑浊液， 合并有机相， 盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥， 蒸干溶剂， 得固体产物 0.22g。 0034 取上述产物经核磁共振氢谱测定， 如图 2 所示， 4.7ppm 左右的峰为咪唑啉环上的 两个亚甲基信号峰， 5.0ppm 左右的峰为苄基信号峰， 7.2-8.7ppm 为氨基与芳环混合信号 峰， 说明目标半抗原合成成功。 0035 2、 抗原的制备 0036 免疫原制备吡虫啉半抗原与牛血清白蛋白 （BSA） 偶联得到免疫原。 0037 取 7mg 半抗原， 溶解于 1ml DMF 中 ； 取戊二醛水溶液 0.1ml 加入半抗原溶液中，。

20、 室 温下搅拌 24h， 即可得到反应液 A ； 称取牛血清白蛋白 （BSA） 30mg， 使之充分溶解在 2.7ml 0.1mol/L 碳酸盐缓冲液 （CB） （pH 9.6） 中， 将反应液 A 逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中， 并于室 温下搅拌 24h， 用 5mol/L 的硼氢化钠水溶液 0.2ml 还原反应 4h， 用 0.01mol/L 磷酸缓冲液 （PBS） 4透析 3d， 每天换 3 次透析液， 以除去未反应的小分子物质 ； 分装， 于 -20保存备 用。 说 明 书 CN 104101712 A 5 4/6 页 6 0038 包被原制备吡虫啉半抗原与卵清蛋白 （OVA） 偶联得到免。

21、疫原。 0039 取 7mg 半抗原， 溶解于 1ml DMF 中 ； 取戊二醛水溶液 0.1ml 加入半抗原溶液中， 室 温下搅拌 24h， 即可得到反应液 A ； 称取 OVA 30mg， 使之充分溶解在 2.7ml 0.1mol/L CB （pH 9.6） 中， 将反应液 A 逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中， 并于室温下搅拌 24h， 用 5M 的硼氢化钠水 溶液 0.2ml 还原反应 4h， 用 0.01mol/L PBS 4透析 3d， 每天换 3 次透析液， 以除去未反应 的小分子物质 ； 分装， 于 -20保存备用。 0040 3、 吡虫啉单克隆抗体的制备 0041 动物免疫 ： 将上。

22、述步骤得到的免疫原注入到 Balb/c 小鼠体内， 免疫剂量为 150g/ 只， 使其产生抗血清。 0042 细胞融合和克隆化 ： 小鼠血清测定结果较高后， 取其脾细胞， 按 8:1（数量配比） 比 例与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合， 采用间接竞争 ELISA 测定细胞上清液， 筛选阳性孔。利用有限 稀释法对阳性孔进行克隆化， 直到得到分泌吡虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 0043 细胞冻存和复苏 ： 将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成 1106个 /ml 的细胞悬 液， 在液氮中长期保存。 复苏时取出冻存管， 立即放入37水浴中速融， 离心去除冻存液后， 移入培养瓶内培养。 0044 单克隆抗。

23、体的生产与纯化 ： 将 Balb/c 小鼠腹腔注入灭菌石蜡油 0.5ml/ 只， 7 天后 腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株 5105个 / 只， 7 天后采集腹水。用辛酸 - 饱和硫酸 铵法进行腹水纯化， -20保存。 0045 4、 羊抗鼠抗抗体的制备 0046 以羊为免疫动物， 以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊， 得到羊抗鼠抗抗体。 0047 5、 酶标记抗抗体的制备 0048 将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶 （HRP） 采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传 统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为 4:1， 由于辣根过氧化物酶在强 氧化作用下产生许多与抗体结合的位点， 这样活化。

24、的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分 子的桥梁， 降低了酶标记物的酶活性， 使制备的偶联物中混有许多聚合体。 为了解决这个问 题， 我们将传统的方法进行了改良， 即 ： 0049 （1） 省去了氨基的封闭过程， 因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少 ； 0050 （2） 降低辣根过氧化物酶与抗体的摩尔浓度比率至 2:1， 改良后的方法比传统的方 法简便， 对酶活性的损失减少。 0051 6、 酶标板的制备 0052 用包被缓冲液将包被原稀释成 20g/ml， 每孔加入 100l， 37避光孵育 2h， 倾 去孔中液体， 用洗涤液洗涤 2 次， 每次 30s， 拍干， 然后在每孔中加入 200l 。

25、封闭液， 37避 光孵育 2h， 倾去孔内液体拍干， 干燥后用铝膜真空密封保存。 0053 实施例 2 检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒的组建 0054 组建检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒， 使其包含下述组分 ： 0055 （1） 包被吡虫啉偶联抗原的酶标板 ； 0056 （2） 吡虫啉标准品溶液 6 瓶， 浓度分别为 0g/L、 4g/L、 12g/L、 36g/L、 108g/L、 324g/L ； 0057 （3） 吡虫啉单克隆抗体工作液 ； 说 明 书 CN 104101712 A 6 5/6 页 7 0058 （4） 用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体 ； 0059 （5） 底物显色液由 A 。

26、液和 B 液组成， A 液为过氧化脲， B 液为四甲基联苯胺 ； 0060 （6） 终止液为 2mol/L 硫酸 ； 0061 （7） 洗涤液为 pH 值为 7.4， 含有 0.5%1.0% 吐温 -20、 0.01 0.03叠氮化钠防 腐剂、 0.10.3mol/L 的磷酸盐缓冲液， 所述百分比为重量体积百分比 ； 0062 （8） 复溶液为 pH 值为 7.0、 0.02mol/L 的磷酸盐缓冲液， 所述百分比为重量体积百 分比。 0063 实施例 3 蔬菜、 水果样品中吡虫啉的检测 0064 1、 样品前处理 0065 用均质器均质样本 ； 称取2.00.05g均质物至50ml聚苯乙烯离。

27、心管中， 分别加入 2ml 2mol/L氢氧化钠溶液， 10ml乙酸乙酯， 用涡旋仪涡旋5min， 3000g以上， 室温 （20-25） 离心 5min ； 移取 1ml 上层有机相至 15ml 干净玻璃试管中， 于 （50-60） 水浴氮气 / 空气流 下吹干 ； 加入 1ml 复溶工作液， 涡动 3min ； 取 50ul 用于分析。 0066 2、 用试剂盒检测 0067 向包被有吡虫啉偶联抗原的酶标板微孔中加入吡虫啉标准品溶液或经前处理的 样品溶液 50l/ 孔， 再加入吡虫啉单克隆抗体 50l/ 孔， 轻轻振荡混匀， 用盖板膜盖板后 置25避光环境中反应30min ； 倒出孔内液体。

28、， 每孔加入250l洗涤液充分洗涤45次， 每 次间隔 10s， 用吸水纸拍干 ； 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体 100l/ 孔， 轻轻振 荡混匀， 用盖板膜盖板后置 25避光环境中反应 30min， 取出洗板 ； 每孔加入底物显色液 A 液过氧化氢 50l， 底物显色液 B 液四甲基联苯胺 （TMB） 50l， 轻轻振荡混匀， 用盖板膜盖 板后置 25避光显色 15min， 每孔加入终止液 2mol/L 硫酸 50l， 轻轻振荡混匀， 用酶标仪 波长设定在 450nm 处， 测定每孔吸光度值 （OD 值） 。 0068 3、 检测结果分析 0069 标准品或样本的平均吸光度值 （双孔。

29、） 除以第一个标准品 （0 标准） 的平均吸光度 值， 再乘以 100%， 得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标， 以吡 虫啉标准品浓度 （ppb） 为横坐标， 绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中， 从标准曲线上读出样本所对应的浓度， 乘以其对应的稀释倍数即为样本中吡虫啉实际浓 度。 0070 实施例 4 吡虫啉技术参数的确定试验 0071 1、 试剂盒灵敏度和检测限 0072 按照常规方法测定试剂盒灵敏度， 试剂盒标准曲线最低点为 4g/L， 标准曲线的 范围为 4324g/L， IC50（50% 抑制浓度） 浮动范围为 1016g/L ； 对 20 份样。

30、品进行检测， 从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度， 以20份样本浓度的平均值加上3倍标准 差表示检测限， 结果得该方法对样本的检测限为 20g/kg。 0073 2、 样本精密度和准确度试验 0074 以回收率作为准确度评价指标， 重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差 （RSD%） 作为精密度评价指标。计算公式为 ： 回收率 （%） 实际测定值 / 理论值 100%， 其 中理论值为样品的添加浓度 ； 相对标准偏差 RSD% SD/X100%， 其中 SD 为标准偏差， X 为 测定数据的平均值。 说 明 书 CN 104101712 A 7 6/6 页 8 0075 按 100。

31、g/kg、 300g/kg、 500g/kg 三个浓度吡虫啉分别对蔬菜和水果样品进行添 加回收测定， 每个样品做 4 个平行， 用三批不同试剂进行测定， 计算样品的平均回收率及精 密度结果见下表。 0076 表 1 蔬菜精密度及准确度试验 0077 0078 表 2 水果精密度及准确度试验 0079 0080 以 100、 300、 500g/kg 三个浓度的吡虫啉分别对蔬菜和水果样品进行添加， 平均 回收率在 83.5%117.9% 之间 ； 批内、 批间相对标准偏差均小于 10%。 0081 3、 试剂盒稳定性试验 0082 试剂盒保存条件为 28， 经过 12 个月的测定， 试剂盒的最大。

32、吸光度值 （零标准） 、 50% 抑制浓度、 吡虫啉添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中， 会有 非正常保存条件出现， 将试剂盒在 37保存条件下放置 7 天， 进行加速老化实验， 结果表明 该试剂盒各项指标完全符合要求。 考虑到试剂盒冷冻情况发生， 将试剂盒放入-20冰箱冷 冻7天， 测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。 从以上结果可得出试剂盒可以在28 至少保存 12 个月以上。 说 明 书 CN 104101712 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104101712 A 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 104101712 A 10 。