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电激基因转移装置.pdf

  • 上传人:b***
  • 文档编号:453302
  • 上传时间:2018-02-17
  • 格式:PDF
  • 页数:13
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  • 摘要
    申请专利号:

    CN91105038.8

    申请日:

    1991.07.21

    公开号:

    CN1058043A

    公开日:

    1992.01.22

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情:

    ||||||公开

    IPC分类号:

    C12M1/42; C12N15/02

    主分类号:

    C12M1/42; C12N15/02

    申请人:

    中山大学;

    发明人:

    石和平; 李宝健

    地址:

    510275广东省广州市新港西路

    优先权:

    专利代理机构:

    中山大学专利事务所

    代理人:

    叶贤京;林灿志

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    内容摘要

    本发明涉及一种将生物大分子转移到细胞,尤其是可作DNA分子转移和细胞融合的高压系统。本发明由开关稳压电源、采用逻辑电路组成的具有脉冲休止时间控制器的脉冲发生器、推挽式高压形成电路、电激小室四大部分组成,采用多周期短脉冲输出方式或长周期输出方式,操作参数可调,可连续进行非接触性放电操作,且休止时间足够长。使细胞在两次电激之间有充分时间复原。利用本发明的装置可广泛应用于动物、植物、微生物的外源基因转化和细胞融合。

    权利要求书

    1: 一种电激基因转移装置,有开关稳压电源、电激小室,其特征是采用逻辑电路组成的具有脉休止时间控制器的脉冲发生器和推挽式高压形成电路。
    2: 一种如权利要求1所述的电激基因转移装置,其特征是脉冲发生器的组成为:由与非门11、12组成的双稳态触发器构成防抖动电路,其第1、4输入端分别连接触发开关K1的两个固定接头,并通过电阻R 1 、R 2 接电源VDD,触发开关K 1 的活动接头接地,与非门12的输出端通过电容C和R 3 构成的微分电路进入与非门13的第1输入端,与非门13的输出端连接与非门17的两个输入端,17的输出端经二极管D 1 的正极进入与非门18的第1输入端,18的输出端连接由与非门19、20构成的双稳电路中19的第1输入端,19的输出端和与非门21的第2输入端相连,21的第1输入端与开关K 2 的活动接头相连接,21的输出端A接推挽式高压形成电路的输入端B;由与门14、15组成双稳态触发器,与非门15的第1输入端与18的第2输入端、与非门29的输出端相连接,15的第2输入端和与非门24的第2输入端相连,15的输出端与工作指示电路16、与非门13的第2输入端和周期数计数器28的清零脚1相连接;14的第2输入端与17的二输入端相通;晶体振荡器22产生脉冲宽度为 61μs、占空比为1/2的方波脉冲,它的输出端与24的第1输入端和开关K 2 的一个固定接头1相通,24的输出端和与非门25的第1输入端相连,25的第2输入端和与非门19的第2输入端相连;23为可变频率振荡器,输出脉冲宽度为1μs~200μs、占空比为1/2的方波脉冲,其输出端接开关K 2 的固定接头2;脉冲休止时间计数器26的正脉输出端1经二极管D 2 的正极至与非门18的第1输入端,脉冲休止时间计数器26的计数输入端2接25的输出端,清零端3连接与非门19的输出端;每周期脉冲数计数器27的计数输入端3接与非门21的输出端,清零端1接与非门20的输出端及周期数计数器28的计数输入端2,负脉冲输出端2接与非门20的第2输入端;周期数计数器28的两负脉冲输出端
    3: 4分别与29的二个输入端相连。 3、一种如权利要求1、2所述的电激基因转移装置,其特征是高压形成电路的组成为:输出变压器B 1 的初级二端分别接场效应管T 1 的D极、T 2 的S极,B 1 中间抽头接电源Vcc,T 1 的S极、T 2 的D极共同接地,T 1 、T 2 各自的D、S极间分别接有双向保护器;输入电路从B点输入后分两路,一路接经电容C 1 、电阻R 4 后接场效应管T 1 的G极,另一路先经与非门30进行倒相,再经过电容C 2 、电阻R 5 接T 2 的G极,R 4 与C 1 、R 5 与C 2 的连接处分别接二极管D 3 、D 4 的负极,正极共同下地;T1、T2的G分别按一电阻R6、R7后落地;B 1 的次级分二种接法,一种接桥式整流D5~8,由C、D输出长脉冲,一种以D 9 作半波整流,E、T输出短脉冲。
    4: 15组成双稳态触发器,与非门15的第1输入端与18的第2输入端、与非门29的输出端相连接,15的第2输入端和与非门24的第2输入端相连,15的输出端与工作指示电路16、与非门13的第2输入端和周期数计数器28的清零脚1相连接;14的第2输入端与17的二输入端相通;晶体振荡器22产生脉冲宽度为 61μs、占空比为1/2的方波脉冲,它的输出端与24的第1输入端和开关K 2 的一个固定接头1相通,24的输出端和与非门25的第1输入端相连,25的第2输入端和与非门19的第2输入端相连;23为可变频率振荡器,输出脉冲宽度为1μs~200μs、占空比为1/2的方波脉冲,其输出端接开关K 2 的固定接头2;脉冲休止时间计数器26的正脉输出端1经二极管D 2 的正极至与非门18的第1输入端,脉冲休止时间计数器26的计数输入端2接25的输出端,清零端3连接与非门19的输出端;每周期脉冲数计数器27的计数输入端3接与非门21的输出端,清零端1接与非门20的输出端及周期数计数器28的计数输入端2,负脉冲输出端2接与非门20的第2输入端;周期数计数器28的两负脉冲输出端3、4分别与29的二个输入端相连。 3、一种如权利要求1、2所述的电激基因转移装置,其特征是高压形成电路的组成为:输出变压器B 1 的初级二端分别接场效应管T 1 的D极、T 2 的S极,B 1 中间抽头接电源Vcc,T 1 的S极、T 2 的D极共同接地,T 1 、T 2 各自的D、S极间分别接有双向保护器;输入电路从B点输入后分两路,一路接经电容C 1 、电阻R 4 后接场效应管T 1 的G极,另一路先经与非门30进行倒相,再经过电容C 2 、电阻R 5 接T 2 的G极,R 4 与C 1 、R 5 与C 2 的连接处分别接二极管D 3 、D 4 的负极,正极共同下地;T1、T2的G分别按一电阻R6、R7后落地;B 1 的次级分二种接法,一种接桥式整流D5~8,由C、D输出长脉冲,一种以D 9 作半波整流,E、T输出短脉冲。

    说明书


    本发明涉及一种将生物大分子转移到细胞,尤其是可作DNA分子转移和细胞融合的高压系统。

        把外源基因导入到植物细胞,是植物生物工程的关键技术之一。在短短的十多年中,已发展了多种技术。但电激法是目前最实用和广泛应用的少数几种重要技术之一。它的原理是把细胞置于高压电场中,使细胞膜发生电介质可逆击穿而形成微孔,让外源基因通过微孔进入细胞。美国T.K.Wang于1981年首次把电激技术应用于动物细胞,并于1987年研制成功先进的Beakon-2000型电激仪(由美国Beakon公司生产)。由于Beakon-2000采用单管变压器升压电路,只能输出短脉冲。因此它只能用于动物细胞或植物原生质体的转移。同时,Beakon-2000的参数采用脉冲发放时间,实际使用时,需根据几个参数用公式计算出脉冲休止时间,不但麻烦,且当改变脉冲数目和脉冲时间时,脉冲休止时间难以在各实验中保持一致。

        本发明的目的是研制一个操作参数可调的、可连续进行非接触放电的生物大分子转移和细胞融合系统。

        为了实现以上目的,本发明采用以下几部分组成电激基因转移装置:开关稳压电源、采用逻辑电路组成的具有脉冲休止时间控制器的脉冲发生器、推挽式高压形成电路、电激小室。具体框图如图1所示,其中1为脉冲发生器,采用逻辑电路设计,具有脉冲休止时间控制器;2为推挽式高压形成电路;3为开关稳压电源;为已有技术;4为电激小室。

        图2为电激小室的结构示图,其中5为电极,6为样品杯,7为接地金属球。

        图3为脉冲发生器的电路结构图,具体描述如下:

        由非门11、12组成的双稳态触发器构成防抖动电路,其第1、4输入端分别连接触发开关K1的两个固定接头,并通过电阻R1、R2接电源VDD,触发开关K1的活动接头接地,与非门12的输出端6通过电容C和R3构成的微分电路进入与非门13的第1输入端,与非门13的输出端连接与非门17的两个输入端,17地输出端经二极管D1的正极进入与非门18的第1输入端,18的输出端连接由与非门19、20构成的双稳电路中19的第1输入端,19的输出端和与非门21的第2输入端相连,21的第1输入端与开关K2的活动接头相连接,21的输出端A接推挽式高压形成电路的输入端B;由与非门14、15组成双稳态触发器,与非门15的第1输入端与18的第2输入端、与非门29的输出端相连接,15的第2输入端和与非门24的第2输入端相连,15的输出端与工作指示电路16、与非门13的第2输入端和周期数计数器28的清零脚1相连接;14的第2输入端与17的二输入端相通;晶体振荡器22产生脉冲宽度为61μs、占空比为1/2的方波脉冲,它的输出端与24的第1输入端和开关K2的一个固定接头相通,24的输出端和与非门25的第1输入端相连,25的第2输入端和与非门19的第2输入端相连;23为可变频率振荡器,输出脉冲宽度为1μs~200μs、占空比为1/2的方波脉冲,其输出端接开关K2的固定接头2;脉冲休止时间计数器26的正脉输出端1经二极管D2的正极至与非门18的第1输入端,脉冲休止时间计数器26的计数输入端2接25的输出端,清零端3连接与非门19的输出端;每周期脉冲数计数器27的计数输入端3接与非门21的输出端,清零端1接与非门20的输出端及周期数计数器28的计数输入端2,负脉冲输出端2接与非门20的第2输入端;周期数计数器28的两负脉冲输出端3、4分别与29的二个输入端相连。

        图4为推挽式高压形成电路的电路结构图,它采用场效应管作为推挽输出,输出变压器B1的初级二端分别接场效应管T1的D极、T2的S极,B1中间抽头接电源Vcc,T1的S极、T2的D极共同接地,T1、T2各自的D、S极间分别接有双向保护器;输入电路从B点输入后分两路,一路接经电容C1、电阻R4后接场效应管T1的G极,另一路先经与非门30进行倒相,再经过电容C2、电阻R5接T2的G极,R4与C1、R5与C2的连接处分别接上二极管D3、D4的负极,正极共同接地;T1、T2的G极分别接一电阻R6、R7后落地;B1的次级分二种接法,一种接桥式整流D5~8,由C、D输出长脉冲,一种以D9作半波整流,E、F输出短脉冲。

        整个电路的工作原理是:

        1.初始状态(K1打到1)时,初始化电路(已知技术)使15输出高电位,使13打开,输出低电平,同时28清零,工作指示电路16的指示灯熄灭;14输出低电位,使24关闭;19输出低电位,使21关闭;20输出高电位,使27清零,25打开。

        2.触发过程和脉冲发放期:

        按下触发开关K1(打到2处)后,11、12组成的双稳态电路发生翻转,经微分电路输出一正脉冲至13,因此时15输出高电位,故此正脉冲经13反相后输出负脉冲至17和14,14、15组成的双稳态电路发生翻转,15输出低电位,使工作指示电路16的指示灯发亮,同时使13关闭。这样可防止在工作期间乱按触发开关对仪器造成的干扰。触发信号从13至17,反相成为正脉冲输入18的第1输入端,18的第2输入端为高电位,故18的输出端输出一负脉冲触发19、20所组成的双稳态电路,19、20发生翻转,19输出高电位使26清零,同时打开21;此时,从开关K2来的信号(61μs或1~200μs脉冲串)从21输出至高压形成电路和27,27开始计数,在达到所予置脉冲数后,分两处进行说明:对于高压形成电路,它收到控制部分来的方波信号分二路,一路经箝位(低电位箝位)后输至推挽电路,另一路经反相后输至推挽电路。调节开关稳压电源的电压,可控制输出电压高低,输出电压经B1升压后,半波整流后在E、F端为短脉冲,桥式整流后在C、D端为长脉冲输出;对于每周期脉冲数计数器27来说,此时输出负脉冲使19、20发生翻转,19输出低电位,关闭21,此时无脉冲输至高压形成电路,整个电路进入脉冲休止期,20输出高电位,使27清零,28开始计算周期数,同时25打开,26开始计算脉冲休止时间数。

        3.脉冲休止期

        20输出高电位,25打开,14在整个电路工作期间内一直处于高电位,所以24是开的,25打开后,从22来的61μs脉冲经24、25后输入26,26开始计数。在达到所予置的脉冲数(仪器面板上所标时间值)后,26输出一正脉冲。此脉冲加至18的输入端,在18输出一负脉冲,使19、20发生翻转,19输出高电位,打开21,此时,第二周期的脉冲发放期开始,21输出第二周期的脉冲至高压形成电路和27。周而复始。

        4.周期计数

        在每一周期内脉冲数达到设定值后,19、20组成的双稳态电路发生翻转,20呈高电位,此电位使28计数,在达到所予置周期数后,29输出一负脉冲使14、15翻转,15输出高电位,关掉工作指示电路16的指示灯,同时打开13,28清零,仪器又回到初始状态。

        5.周期计数器置数00和99时的特殊状态:

        周期计数器18置数为00时,29输出保持低电位,使18关断,触发脉冲不能送到19,使输出脉冲为零。同时,15输出高电位,使工作指示电路16的指示灯不亮。28置数为99时,28的第三脚输出一负脉冲,使28的第4脚所输出的脉冲不能通过29,而使周期数为无穷多次。

        具体实施时,一周期脉冲数计数器27可采用集成电路CD4040,周期数计数器28可用集成电路CD4518,脉冲休止时间计数器26可用集成电路CD4040。

        本发明采用多周期短脉冲输出方式或长周期输出方式,任意选择,并把脉冲发放时间改为脉冲休止时间,脉冲休止时间足够长,使细胞膜在两次电激之间有充分的时间复原。利用本发明的装置,不但可以把外源基因导入动物细胞和植物原生质体,而且可以把外源基因导入有壁的植物细胞,如悬浮培养植物细胞、愈伤组织、叶片和茎组织、种子胚组织等多种受体中。它可以在动物、植物、微生物的外源基因转化和细胞融合中,得到广泛的应用。

    关 键  词:
    基因 转移 装置
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