本发明涉及一种将生物大分子转移到细胞,尤其是可作DNA分子转移和细胞融合的高压系统。 把外源基因导入到植物细胞,是植物生物工程的关键技术之一。在短短的十多年中,已发展了多种技术。但电激法是目前最实用和广泛应用的少数几种重要技术之一。它的原理是把细胞置于高压电场中,使细胞膜发生电介质可逆击穿而形成微孔,让外源基因通过微孔进入细胞。美国T.K.Wang于1981年首次把电激技术应用于动物细胞,并于1987年研制成功先进的Beakon-2000型电激仪(由美国Beakon公司生产)。由于Beakon-2000采用单管变压器升压电路,只能输出短脉冲。因此它只能用于动物细胞或植物原生质体的转移。同时,Beakon-2000的参数采用脉冲发放时间,实际使用时,需根据几个参数用公式计算出脉冲休止时间,不但麻烦,且当改变脉冲数目和脉冲时间时,脉冲休止时间难以在各实验中保持一致。
本发明的目的是研制一个操作参数可调的、可连续进行非接触放电的生物大分子转移和细胞融合系统。
为了实现以上目的,本发明采用以下几部分组成电激基因转移装置:开关稳压电源、采用逻辑电路组成的具有脉冲休止时间控制器的脉冲发生器、推挽式高压形成电路、电激小室。具体框图如图1所示,其中1为脉冲发生器,采用逻辑电路设计,具有脉冲休止时间控制器;2为推挽式高压形成电路;3为开关稳压电源;为已有技术;4为电激小室。
图2为电激小室的结构示图,其中5为电极,6为样品杯,7为接地金属球。
图3为脉冲发生器的电路结构图,具体描述如下:
由非门11、12组成的双稳态触发器构成防抖动电路,其第1、4输入端分别连接触发开关K1的两个固定接头,并通过电阻R1、R2接电源VDD,触发开关K1的活动接头接地,与非门12的输出端6通过电容C和R3构成的微分电路进入与非门13的第1输入端,与非门13的输出端连接与非门17的两个输入端,17地输出端经二极管D1的正极进入与非门18的第1输入端,18的输出端连接由与非门19、20构成的双稳电路中19的第1输入端,19的输出端和与非门21的第2输入端相连,21的第1输入端与开关K2的活动接头相连接,21的输出端A接推挽式高压形成电路的输入端B;由与非门14、15组成双稳态触发器,与非门15的第1输入端与18的第2输入端、与非门29的输出端相连接,15的第2输入端和与非门24的第2输入端相连,15的输出端与工作指示电路16、与非门13的第2输入端和周期数计数器28的清零脚1相连接;14的第2输入端与17的二输入端相通;晶体振荡器22产生脉冲宽度为61μs、占空比为1/2的方波脉冲,它的输出端与24的第1输入端和开关K2的一个固定接头相通,24的输出端和与非门25的第1输入端相连,25的第2输入端和与非门19的第2输入端相连;23为可变频率振荡器,输出脉冲宽度为1μs~200μs、占空比为1/2的方波脉冲,其输出端接开关K2的固定接头2;脉冲休止时间计数器26的正脉输出端1经二极管D2的正极至与非门18的第1输入端,脉冲休止时间计数器26的计数输入端2接25的输出端,清零端3连接与非门19的输出端;每周期脉冲数计数器27的计数输入端3接与非门21的输出端,清零端1接与非门20的输出端及周期数计数器28的计数输入端2,负脉冲输出端2接与非门20的第2输入端;周期数计数器28的两负脉冲输出端3、4分别与29的二个输入端相连。
图4为推挽式高压形成电路的电路结构图,它采用场效应管作为推挽输出,输出变压器B1的初级二端分别接场效应管T1的D极、T2的S极,B1中间抽头接电源Vcc,T1的S极、T2的D极共同接地,T1、T2各自的D、S极间分别接有双向保护器;输入电路从B点输入后分两路,一路接经电容C1、电阻R4后接场效应管T1的G极,另一路先经与非门30进行倒相,再经过电容C2、电阻R5接T2的G极,R4与C1、R5与C2的连接处分别接上二极管D3、D4的负极,正极共同接地;T1、T2的G极分别接一电阻R6、R7后落地;B1的次级分二种接法,一种接桥式整流D5~8,由C、D输出长脉冲,一种以D9作半波整流,E、F输出短脉冲。
整个电路的工作原理是:
1.初始状态(K1打到1)时,初始化电路(已知技术)使15输出高电位,使13打开,输出低电平,同时28清零,工作指示电路16的指示灯熄灭;14输出低电位,使24关闭;19输出低电位,使21关闭;20输出高电位,使27清零,25打开。
2.触发过程和脉冲发放期:
按下触发开关K1(打到2处)后,11、12组成的双稳态电路发生翻转,经微分电路输出一正脉冲至13,因此时15输出高电位,故此正脉冲经13反相后输出负脉冲至17和14,14、15组成的双稳态电路发生翻转,15输出低电位,使工作指示电路16的指示灯发亮,同时使13关闭。这样可防止在工作期间乱按触发开关对仪器造成的干扰。触发信号从13至17,反相成为正脉冲输入18的第1输入端,18的第2输入端为高电位,故18的输出端输出一负脉冲触发19、20所组成的双稳态电路,19、20发生翻转,19输出高电位使26清零,同时打开21;此时,从开关K2来的信号(61μs或1~200μs脉冲串)从21输出至高压形成电路和27,27开始计数,在达到所予置脉冲数后,分两处进行说明:对于高压形成电路,它收到控制部分来的方波信号分二路,一路经箝位(低电位箝位)后输至推挽电路,另一路经反相后输至推挽电路。调节开关稳压电源的电压,可控制输出电压高低,输出电压经B1升压后,半波整流后在E、F端为短脉冲,桥式整流后在C、D端为长脉冲输出;对于每周期脉冲数计数器27来说,此时输出负脉冲使19、20发生翻转,19输出低电位,关闭21,此时无脉冲输至高压形成电路,整个电路进入脉冲休止期,20输出高电位,使27清零,28开始计算周期数,同时25打开,26开始计算脉冲休止时间数。
3.脉冲休止期
20输出高电位,25打开,14在整个电路工作期间内一直处于高电位,所以24是开的,25打开后,从22来的61μs脉冲经24、25后输入26,26开始计数。在达到所予置的脉冲数(仪器面板上所标时间值)后,26输出一正脉冲。此脉冲加至18的输入端,在18输出一负脉冲,使19、20发生翻转,19输出高电位,打开21,此时,第二周期的脉冲发放期开始,21输出第二周期的脉冲至高压形成电路和27。周而复始。
4.周期计数
在每一周期内脉冲数达到设定值后,19、20组成的双稳态电路发生翻转,20呈高电位,此电位使28计数,在达到所予置周期数后,29输出一负脉冲使14、15翻转,15输出高电位,关掉工作指示电路16的指示灯,同时打开13,28清零,仪器又回到初始状态。
5.周期计数器置数00和99时的特殊状态:
周期计数器18置数为00时,29输出保持低电位,使18关断,触发脉冲不能送到19,使输出脉冲为零。同时,15输出高电位,使工作指示电路16的指示灯不亮。28置数为99时,28的第三脚输出一负脉冲,使28的第4脚所输出的脉冲不能通过29,而使周期数为无穷多次。
具体实施时,一周期脉冲数计数器27可采用集成电路CD4040,周期数计数器28可用集成电路CD4518,脉冲休止时间计数器26可用集成电路CD4040。
本发明采用多周期短脉冲输出方式或长周期输出方式,任意选择,并把脉冲发放时间改为脉冲休止时间,脉冲休止时间足够长,使细胞膜在两次电激之间有充分的时间复原。利用本发明的装置,不但可以把外源基因导入动物细胞和植物原生质体,而且可以把外源基因导入有壁的植物细胞,如悬浮培养植物细胞、愈伤组织、叶片和茎组织、种子胚组织等多种受体中。它可以在动物、植物、微生物的外源基因转化和细胞融合中,得到广泛的应用。