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1、10申请公布号CN104059878A43申请公布日20140924CN104059878A21申请号201410287368022申请日20140623C12N5/07620100171申请人扬州大学地址225009江苏省扬州市大学南路88号72发明人李拥军张光景张佳慧杨波蔡缪荧74专利代理机构南京中新达专利代理有限公司32226代理人孙鸥朱杰54发明名称一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方57摘要本发明涉及一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方。本发明在BO获能液中添加10MOL/LEGCG，用于精子体外获能处理，且在BO获能液中添加10MOL/LEGCG，BO获能液配方为NACL6。
2、5453MG/ML，KCL02997MG/ML，NAH2PO4H2O01145MG/ML，MGCL26H2O01057MG/ML，CACL22H2O0330MG/ML，葡萄糖2518MG/ML，02酚红4，100IU/ML青霉素，100IU/ML链霉素，NAHCO331080MG/ML，丙酮酸钠01380MG/ML，肝素20G/ML，BSA20MG/ML。本发明克服了现有的精子体外获能过程中，由于精子密度较大，精子自身代谢产生的氧自由基积累较多的缺陷。本发明利用成年新西兰白兔公免，对其采精后，在BO获能液中添加不同浓度EGCG0M、10M、15M、20M、25M，研究其对兔精子获能效果的影响，。
3、得出最佳EGCG添加浓度，建立一种高效的兔体外获能培养体系。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图2页10申请公布号CN104059878ACN104059878A1/1页21一种适用于兔精子体外获能方法，是在BO获能液中添加10MOL/LEGCG，用于精子体外获能处理。2一种用于权利1所述方法的获能培养液，其特征在于，是在BO获能液中添加10MOL/LEGCG，BO获能液配方为NACL65453MG/ML，KCL02997MG/ML，NAH2PO4H2O01145MG/ML，MGCL26H2O01057MG/。
4、ML，CACL22H2O0330MG/ML，葡萄糖2518MG/ML，02酚红4，100IU/ML青霉素，100IU/ML链霉素，NAHCO331080MG/ML，丙酮酸钠01380MG/ML，肝素20G/ML，BSA20MG/ML。权利要求书CN104059878A1/4页3一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方技术领域0001本发明涉及生物学领域，特别涉及一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方。背景技术0002体外受精技术是体外胚胎生产的重要环节，通过体外受精，能够生产大量优质廉价的胚胎，以满足胚胎商业化的需求。精子体外获能是体外受精技术必不可少的环节，精子获能时，精子内部发生着一系列。
5、的生理生化反应，包括精子表面精浆蛋白类物质的去除、离子在胞膜内外之间的运动CA2、MG2、CL和HCO3内流而K、NA外流、精子获能调控系统的开放、精子膜电位的超极化等。精子获能的分子机理主要有去能因子的失活、蛋白质酪氨酸的磷酸化、胆固醇的流失、活性氧的产生等。0003表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG是儿茶素中一种主要的酯型儿茶素，其分子量为45838，分子式C22H18O11。EGCG具有较强的抗氧化作用，能有效地清除氧自由基，能保护细胞及其DNA免受损伤，EGCG的这些特点，使得其在抗氧化、防治糖尿病、抗癌变和神经元保护功能等方面具有很强的功效。在精子体外获能过程中，精子会产生多种有害物质。
6、，如细胞脂肪代谢产生的活性氧、氧自由基，过量的活性氧和氧自由基将会大大降低精子体外荻能效果，进而影响体外受精效果。而EGCG具有很强的抗氧化作用，因此在体外胚胎生产培养体系中，添加一定浓度EGCG能有效地提高精子获能效果。0004目前已建立了许多精子获能效果的评价方法，其中考马斯亮蓝染色法是一种常用的方法。考马斯亮蓝是一类蛋白质染色剂，未获能的精子顶体外膜中含有大量的糖蛋白，经染色后，精子头部顶端呈深蓝色，而获能后精子的顶体膜破裂，其中的糖蛋白被释放出来，因此，经过染色后，顶体区不着色。染色后在普通光学显微镜下可以观察到两种类型的精子所有精子尾部均染成紫蓝色，头部则呈A型和B型。A型为没有发生。
7、顶体反应的精子，顶体区染成紫蓝色而顶体后区不染色或呈浅紫色，少量精子顶体后区也呈紫蓝色；B型为已发生顶体反应的精子，顶体区不染色或染浅紫色，其余部位染色与A型相似。考马斯亮蓝检查结果的稳定性和重复性好、各批次间的差异不大，可以在普通实验室中进行，能有效地评价精子获能效果。0005在本发明之前，兔精液体外获能的研究较为成熟，但是在精子体外获能过程中，由于精子密度较大，精子自身代谢产生的氧自由基积累较多，因此有必要发明一种抗氧化型精子体外获能液用于提高精子获能效率，为后期胚胎生产奠定一定基础。发明内容0006本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制建立一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方。0007。
8、本发明的技术方案是0008一种适用于兔精子体外获能方法，其主要技术特征是在BO获能液中添加说明书CN104059878A2/4页410MOL/LEGCG，用于精子体外获能处理。0009本发明的另一技术方案是0010一种用于兔精子体外获能的获能液，其主要技术特征在于，是在BO获能液中添加10MOL/LEGCG，BO获能液配方为NACL65453MG/ML，KCL02997MG/ML，NAH2PO4H2O01145MG/ML，MGCL26H2O01057MG/ML，CACL22H2O0330MG/ML，葡萄糖2518MG/ML，02酚红4，100IU/ML青霉素，100IU/ML链霉素，NAHCO。
9、331080MG/ML，丙酮酸钠01380MG/ML，肝素20G/ML，BSA20MG/ML。0011本发明的效果和优点在于利用成年新西兰白兔公兔，对其采精后，在BO获能液中添加不同浓度EGCG0M、10M、15M、20M、25M，研究其对兔精子获能效果的影响，得出最佳EGCG添加浓度，建立一种高效的兔体外获能培养体系。同时可由表1可知，获能液中添加不同浓度EGCG对活精子百分数具有显著的影响P005，其中0、5和10MOL/LEGCG对活精子百分率的影响差异不显著P005，但显著的高于其他三组。由图1可知，在添加0MOL/L到10MOL/L的EGCG之间，活精子百分率的变化趋势基本不变，但到。
10、10MOL/L之后，活精子百分率开始逐渐下降。说明添加0、5和10MOL/LEGCG对精子的活力没有显著影响。0012在BO获能液中添加不同浓度EGCG对精子顶体反应发生率具有显著影响P005，其中获能液添加10M浓度的顶体反应发生率显著高于其他各组P005见表2，图2可以看出，在添加0到10M浓度区间，精子顶体反应发生率逐渐增加，在添加10到20M浓度区间，精子顶体反应发生率逐渐降低。0013在精子体外获能过程中，EGCG最佳添加浓度为10M。0014精子获能6H后，活精子的百分数见表1和图1。0015表1不同浓度EGCG对活精子百分率的影响00160017注上标同字母表示差异不显著P005。
11、，不同字母表示差异显著P0050018精子获能6H后，添加孕酮诱发其发生顶体反应，其顶体反应率见表2和图2。0019表2不同浓度EGCG对精子获能的影响00200021注上标同字母表示差异不显著P005，不同字母表示差异显著P005说明书CN104059878A3/4页5附图说明0022图1不同浓度EGCG对活精子百分率的影响示意图。0023图2不同浓度EGCG对精子获能后顶体反应率的影响示意图。0024图3考马斯亮蓝法染色的精子顶体形态示意图，其中A为未发生顶体反应，B为发生顶体反应。具体实施方式0025本发明的技术思路是0026以免精液为研究对象，通过在精子BO获能液中添加不同浓度EGCG。
12、，研究EGCG对精子获能的影响，以期提高精子体外获能效果，旨在建立一种高效的兔体外获能培养体系，提高相应的胚胎生产效率。0027注BO液为常规使用的获能液。0028下面具体说明本发明。00291试验动物0030选用健康的成年新西兰公兔作为试验兔。00312实验分组0032BO获能液NACL65453MG/ML，KCL02997MG/ML，NAH2PO4H2O01145MG/ML，MGCL26H2O01057MG/ML，CACL22H2O0330MG/ML，葡萄糖2518MG/ML，02酚红4，100IU/ML青霉素，100IU/ML链霉素，NAHCO331080MG/ML，丙酮酸钠01380M。
13、G/ML，肝素20G/ML，BSA20MG/ML混合后过滤除菌，CO2培养箱内平衡30MIN。0033试验分五组I基础液BO获能液0034II基础液5MOL/L的EGCG0035III基础液10MOL/L的EGCG0036IV基础液15MOL/L的EGCG0037V基础液20MOL/L的EGCG0038VI基础液25MOL/L的EGCG00393精子体外获能0040人工采集公兔精液，将收集到的精液与获能液按125混匀，1000R/MIN离心5MIN，去上清液并在下层精子沉淀中加入1ML获能液，将离心管倾斜放置于CO2培养箱中2030MIN。然后吸取上清液加入另一个灭菌的离心管中，继续培养6H。。
14、0041死活精子染色法取一滴精液，一滴015的伊红溶液和两滴1的苯胺黑溶液于载玻片，然后用盖玻片的一角将精液、伊红与苯胺黑的混合液搅拌均匀，再取混合液的一小滴，滴在另一张载玻片的一端，用一张边缘平整的盖玻片，呈35与精液接触，待精液沿接触面扩散后，均匀地用力推向至载玻片的另一端做成精液抹片。将做好的精液抹片，置于显微镜下放大400倍进行观察。随机观察不同视野中的精子200个，并按公式计算0042活精子的百分数活精子数/计数的总精子数1000043死精子染成粉红色，活精子头部为无色透明0044获能评价方法采用考马斯亮蓝染色法获能后精液加入1MMOL/L的孕酮至浓度为说明书CN104059878A4/4页61G/ML，并继续孵育30MIN。精子悬液离心1000R/MIN，5MIN，沉淀以固定液含4甲醛的PBS溶液固定10MIN，离心去上清，PBS洗涤2遍；适量PBS悬浮沉淀，吸取适量精子悬液制成涂片晾干；精子涂片用考马斯亮蓝染色液滴于玻片染30MIN，三蒸水冲洗玻片，晾干，并在普通光学显微镜下进行观察见图3及统计分析。说明书CN104059878A1/2页7图1图2说明书附图CN104059878A2/2页8图3说明书附图CN104059878A。