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1、(10)申请公布号 CN 104224773 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104224773 A (21)申请号 201410445618.9 (22)申请日 2014.09.04 A61K 31/365(2006.01) A61P 31/18(2006.01) C07D 407/04(2006.01) (71)申请人 南京标科生物科技有限公司 地址 210046 江苏省南京市栖霞区尧化街道 甘家边东 108 号 1 幢 701 室 (72)发明人 张金芳 杨存 (54) 发明名称 水牛果素 A 在制备抗艾滋病药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种水牛果素 A 。
2、在制备抗艾滋 病药物中的应用， 通过体外细胞毒性试验及 HIV 病毒体外抑制试验， 观察水牛果素 A 的抗艾滋病 毒作用， 结果表明水牛果素 A 对 HIV-1 标准株、 临床株、 假病毒均有一定的抑制作用， 具有抑制 HIV-1 病毒复制的活性。将水牛果素 A 与医学上 可接受的辅料一起制成抗 HIV 的药物， 药物的剂 型为注射剂、 胶囊剂、 片剂、 颗粒剂、 丸剂、 合剂、 口 服液中的一种。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 104224773 A。
3、 CN 104224773 A 1/1 页 2 1. 结构式如下所示的水牛果素 A 在制备抗艾滋病药物中的应用 。 权 利 要 求 书 CN 104224773 A 2 1/3 页 3 水牛果素 A 在制备抗艾滋病药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 涉及水牛果素 A 在制备抗艾滋病药物中的应用。 背景技术 0002 水牛果素 A（Shephagenin A） ， 分子式为 C48H32O32， 分子量为 1120.75， 结构式为 ： 水牛果素A是从胡颓子科(Elaeagnaceae) 银水牛果 Shepherdia argentea Nutt.叶 中分离得到一种活性化合物。
4、。药理研究表明， 水牛果素 A 具有抗 HIV-1 逆转录酶， IC50 为 0.049M， 强于阳性对照物 (-)-epigallocatechin gallate(IC50 为 0.25M)。 0003 通过文献检索， 国内尚未见水牛果素 A 用于制备抗艾滋病药物。 发明内容 0004 为满足临床需要， 扩大用药品种， 更好地治疗艾滋病， 应用水牛果素 A 制备抗艾滋 病药物。 0005 本发明的技术方案如下 ： 水牛果素 A 在制备抗艾滋病药物中的应用。 0006 通过体外细胞毒性试验及 HIV 病毒体外抑制试验， 观察水牛果素 A 的抗艾滋病毒 作用， 结果表明水牛果素A对HIV-1标。
5、准株、 临床株、 假病毒均有一定的抑制作用， 具有抑制 HIV-1 病毒复制的活性。 0007 上述水牛果素 A 的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 以银水牛果的叶为原料， 切成段状， 放入高速组织捣碎机， 在转速为 18000rpm 条件 下保持 3-5min 后， 过 40 目筛备用 ； （2） 原料按照料液比 1:10-15（g/ml） 的比例加入乙醇水溶液后， 再加入 0.3% 的纤维素 酶， 在超声功率 600W、 48条件下酶解 40-60min， 得到酶解原料 ； （3） 将酶解原料投入加入闪式提取器中， 进行闪式提取， 过滤得到提取液， 浓缩干燥得 到粗提物 ； 说 明 书。
6、 CN 104224773 A 3 2/3 页 4 （4） 将所得粗提物用甲醇溶解， 干法上样至高压硅胶柱层析纯化， 氯仿 - 甲醇溶剂系统 梯度洗脱， 收集水牛果素 A 流分， 减压浓缩 ； （5） 将浓缩液用超临界 CO2抗溶剂结晶得到水牛果素 A 结晶。 0008 所述步骤 （2） 中乙醇水溶液体积百分比为 85%。 0009 所述步骤 （3） 中闪式提取电压为 160V， 提取时间为 5-10min。 0010 所述步骤 （4） 中所述高压硅胶柱层析， 硅胶目数为 200 目， 耐压 35MPa， 柱内径为 250mm， 层析柱径高比为 1 ： 10。 0011 所述步骤 （4） 中所。
7、述氯仿 - 甲醇的体积比为 1:1-1:13。 0012 所述步骤 （5） 中所述超临界CO2抗溶剂结晶条件为 ： 压力12-25MPa， 温度35-55。 0013 本发明用于制备抗艾滋病药物时， 将水牛果素 A 与医学上可接受的辅料一起制成 抗 HIV 的药物， 药物的剂型为注射剂、 胶囊剂、 片剂、 颗粒剂、 丸剂、 合剂、 口服液中的一种。 0014 本发明用于制备抗艾滋病药物时， 在其口服配方中添加肠吸收促进剂， 包含中链 脂肪酸盐、 胆酸盐、 鹅去氧胆酸盐、 壳聚糖及其衍生物中的一种或几种。 0015 本发明的剂量可根据服用方式、 病人的年龄、 病情严重程度等因素而改变， 成人口 。
8、服剂量为 1-200mg/ 日， 成人注射剂量为 1-50mg/ 日。 0016 下面将结合具体实施方式进一步说明本发明， 但本发明要求保护的范围并不局限 于下列实施方式。 具体实施方式 0017 实施例 1 ： 水牛果素 A 的制备 以银水牛果的叶为原料， 放入高速组织捣碎机， 在转速为 18000rpm 条件下保持 5min 后， 过 40 目筛备用， 称取 1kg， 按照料液比 1:10 （g/ml） 的比例加入 85% 乙醇水溶液后， 再加 入 0.3% 的纤维素酶， 在超声功率 600W、 48条件下酶解 50min， 得到酶解原料， 加入闪式提 取器中， 提取电压为 160V， 提。
9、取时间为 8min， 进行闪式提取， 过滤得到提取液， 提取液浓缩 干燥后得到粗提物， 用甲醇溶解， 干法上样至高压硅胶 （硅胶目数为 200 目） 柱层析纯化， 耐 压 35MPa， 柱内径为 250mm， 层析柱径高比为 1 ： 10， 氯仿 - 甲醇按体积比为 1:1、 1:5、 1:13 梯 度洗脱， 收集水牛果素 A 流分， 将流分浓缩至有少量晶体析出， 置于超临界 CO2结晶釜中， 控 制结晶压力 12MPa， 温度 35， 进行超临界 CO2抗溶剂结晶， 结晶时间为 60min， 停机后取出 结晶产物， 含量为 94.3%。 0018 为了更好的理解本发明的实质， 下面将用水牛果。
10、素 A 的药理实验及药理来说明其 在制药中的用途。 0019 1、 受试提取物 ： 水牛果素 A 提取物 （1） 性状 ： 白色结晶， 味苦。 0020 （2） 规格 ： 含水牛果素 A 90%。 0021 （3） 溶剂 ： 乙醇或甲醇。 0022 （4） 储存条件 ： 4， 密封保存。 0023 2、 TZM-b1 的病毒抑制实验 （1） 实验方法 ： 在培养基中， 将被试细胞调成密度为 2105细胞 /ml， 将上述细胞株悬 说 明 书 CN 104224773 A 4 3/3 页 5 液接种于96孔培养板， 每孔50l， 置于饱和湿度、 37和5%CO2培养箱中培养24小时， 弃去 培养。
11、上清， 加入 200TCID-50 病毒， 分别加入溶剂对照 0.1% 二甲基亚砜、 阳性对照以及不同 浓度水牛果素 A 的二甲亚砜溶液各 50l， 每组设 3 个复孔。培养 48 小时， 检测 TZM-b1 细胞 中的荧光强度。 0024 （2） 结果 ： 本发明使用实验室标准株观察了水牛果素 A 对 SF33 和临床分离株 XJDC257 复制的抑 制作用， 结果如表1显示， 水牛果素A对SF33的平均IC50为6.35g/ml， 对临床分离株抑制 的平均 IC50 为 2.45g/ml。 0025 表 1 水牛果素 A 对 SF33 和临床分离株 XJDC257 的抑制作用 （液体培养法。
12、） 毒株所用细胞 IC50（g/ml）IC90（g/ml）T1 SF33MT-46.2917.8815.43 SF33TZM-b14.7717.6233.78 XJDC257 TZM-b12.3615.9971.56 3、 MT4 细胞的病毒抑制实验 （1） 实验方法 ： 在培养基中， 将被试细胞调成密度为2105细胞/ml， 将增长期的MT4细 胞株悬液接种于 96 孔培养板， 每孔 50l， 加入 100TCID-50HIV-1 病毒， 置于饱和湿度、 37 和 5%CO2 培养箱中培养 72 小时， 去培养上清， 分别加入溶剂对照 0.1% 二甲基亚砜、 阳性对 照以及不同浓度水牛果素 。
13、A 的二甲亚砜溶液各 50l， 每组设 3 个复孔。培养 72 小时收集上 清用 HIV-1p24 抗原检测试剂盒检测上清 HIV 病毒颗粒释放。 0026 （2） 结果 ： 本发明使用实验室标准株观察了水牛果素 A 对 HIV-1 假病毒复制的抑制作用， 结果 如表 2 显示， 水牛果素 A 对不同亚型的毒株的平均 IC50 为 1.9-3.3g/ml， 平均 IC50 为 2.42g/ml。 0027 表 2 水牛果素 A 对假病毒的抑制作用 （液体培养法） 假病毒亚型IC50（g/ml）T1 9-14B /C1.785.5 188-36AE1.2133.9 Z20-11B3.644.2 实施例 2 片剂 ： 水牛果素 A40g， 淀粉 135g， 鹅去氧胆酸盐 25g， 制粒， 压片制成 1000 片。服用方 法 ： 成人一次 1 片， 一日 2 次。 0028 实施例 3 ： 胶囊 ： 水牛果素 A40g， 淀粉 135g， 壳聚糖 25g， 混匀， 制成 1000 粒。服用方法 ： 成人一次 1 粒， 一日 2 次。 说 明 书 CN 104224773 A 5 。