氨基甲酸酯类农药降解酶CFH与其编码基因CFD以及二者的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104178504 A (43)申请公布日 2014.12.03 CN 104178504 A (21)申请号 201410378234.X (22)申请日 2014.08.01 CCTCC NO: M208076 2008.05.22 C12N 15/55(2006.01) C12N 9/16(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A62D 3/02(2007.01) A23L 1/015(2006.01) C12R 1/19(2006.01) A62D 101/04(。

2、2007.01) A62D 101/26(2007.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇国 家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 闫新 洪青 李顺鹏 谷涛 何健 蒋建东 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 傅婷婷 徐冬涛 (54) 发明名称 氨基甲酸酯类农药降解酶 CFH 与其编码基因 cfd 以及二者的应用 (57) 摘要 本发明属于应用环境微生物和农业领域， 涉 及氨基甲酸酯类农药降解酶 CFH 与其编码基因 cfd 以及二者的应用。本发明降解呋喃丹等氨基 甲酸酯类农药降解酶基因 cfd 的开放阅读。

3、框全长 为2139 bp， 序列如SEQ ID NO.1所示， 其编码产物 CFH含712个氨基酸， 序列为SEQ ID NO.2。 CFH能 降解呋喃丹等氨基甲酸酯类农药。基因 cfd 可用 于构建可降解呋喃丹等氨基甲酸酯类农药的转基 因工程菌或作物， 降解酶 CFH 可用于消除土壤、 水 体和农产品中呋喃丹等氨基甲酸酯类农药残留。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 1041785。

4、04 A CN 104178504 A 1/1 页 2 1. 一种氨基甲酸酯类降解酶基因 cfd， 其核苷酸序列为 SEQ ID NO.1。 2. 权利要求 1 所述的基因 cfd 所编码的降解酶 CFH， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO.2。 3. 含有权利要求 1 所述的基因 cfd 的重组表达载体。 4. 含有权利要求 1 所述的基因 cfd 的基因工程菌。 5. 根据权利要求 4 所述的基因工程菌， 其特征在于所述的基因工程菌的出发菌株为大 肠杆菌 BL21(DE3)。 6. 权利要求 1 所述基因 cfd 在构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因作物中的应用。 7. 权利要求 1 所述。

5、基因 cfd 在去除水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。 8. 权利要求 2 所述降解酶 CFH 在消除土壤、 水体或农产品中氨基甲酸酯类农药残留中 的应用。 9. 权利要求 3 所述重组表达载体在构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因作物中的应 用。 10. 权利要求 1 所述重组表达载体在去除水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104178504 A 2 1/5 页 3 氨基甲酸酯类农药降解酶 CFH 与其编码基因 cfd 以及二者 的应用 技术领域 0001 本发明属于应用环境微生物和农业领域， 涉及能降解呋喃丹等氨基甲酸酯类农药 的酶 CFH 与其编码基因 cfd。

6、 以及二者的应用。 背景技术 0002 我国人多地少， 大量使用化学农药是保证作物高产稳产的必要措施， 但同时也带 来严重污染。 农药的难降解性， 导致土壤和农产品残留率较高， 如目前在长三角和珠三角农 田土壤检出率达 90以上， 受农药污染的农产品更是如此， 如国际绿色和平组织 2009 年检 测结果表明， 我国 90农产品检出农药残留， 66的样品残留至少 5 种以上农药， 2010 年 4 月份发生的青岛毒韭菜事件就是有机磷杀虫剂污染导致的， 造成了恶劣影响。生物 ( 酶 ) 降解技术是一种新型原位生物修复技术， 具有效果好、 费用低和无二次污染等特点， 是降解 土壤和农产品上农药残留的。

7、理想方式。 0003 呋喃丹等氨基甲酸酯类农药是一类在世界范围内应用广泛的杀虫剂。 该类农药毒 性作用机理与有机磷农药相似， 主要是抑制胆碱酯酶活性。 氨基甲酸酯类农药可经呼吸道、 消化道侵入机体， 也可经皮肤粘膜缓慢吸收， 主要分布在肝、 肾、 脂肪和肌肉组织中。近年 来， 由于其高毒性以及频繁发生的农药中毒事件， 部分品种被世界各国限用， 甚至禁用。以 呋喃丹为例， 欧盟和加拿大已禁用， 美国禁用于任何作物 ( 人食用 ) ； 2014 年版的中国国家 禁用和限用农药名单中， 呋喃丹属于限用农药， 蔬菜、 果树、 茶树、 中草药材是其禁止使用的 范围。这也就意味着呋喃丹等氨基甲酸酯类农药仍。

8、然在被大量使用， 其在土壤和农产品中 残留是依然我们要面对和解决的问题。 0004 要利用生物(酶)降解技术解决氨基甲酸酯类农药残留问题首先要获得优良的菌 株和基因资源。目前能够降解该类农药的微生物已有较多报道， 但是相应的基因资源却报 道很少。目前共有三个相关的基因 cehA(GenBank 登陆号 ： AB069723)、 cahA(GenBank 登陆 号 ： AB081302) 和 mcd， 前两个基因编码的降解酶只对西维因有较强活性， mcd 的序列虽然可 以从 GenBank( 登陆号 ： AF160188) 中获得， 但并未有直接的文献报道， 相关文献只报道了其 出发菌株、 酶的。

9、纯化和基因的定位。因此， 至今还没有针对氨基甲酸酯类农药的广谱、 高效 降解酶基因的报道。这限制了人们利用生物 ( 酶 ) 降解技术消除土壤和农产品上的氨基甲 酸酯类农药残留。 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术的上述不足， 提供呋喃丹等氨基甲酸酯类农药降解 酶 CFH 与其编码基因 cfd 以及二者的应用。基因 cfd 可用于构建降解氨基甲酸酯类农药的 转基因微生物或植物， 亦可用于生产降解氨基甲酸酯类农药的酶制剂， 用于消除土壤、 水体 和农产品中氨基甲酸酯类农药残留。 0006 本发明的目的可通过如下技术方案实现 ： 说 明 书 CN 104178504 A 3 2/5 页 。

10、4 0007 一种氨基甲酸酯类农药降解酶基因 cfd， 其核苷酸序列为 SEQ ID NO.1。 0008 基因cfd的出发菌株鞘氨醇杆菌(Sphingobium sp.)YBL3保存于中国典型培养物 保藏中心， 保藏编号为CCTCC NO:M208076。 质谱分析结果表明菌株YBL3的粗酶液可以把呋 喃丹、 西维因和异丙威等氨基甲酸酯类农药的酰胺键断裂而降解这些农药， 消除其毒性。 0009 克隆氨基甲酸酯类农药降解酶基因的策略为鸟枪法。首先提取菌株 YBL3 的总 DNA， 总 DNA 采用 Sau3AI 部分酶切后和 BamHI 用酶切的质粒 pUC118 酶连， 酶连产物转化大 肠杆。

11、菌 DH5 感受态细胞获得总 DNA 文库。用高效液相色谱 (HPLC) 检测法筛选出能够降 解呋喃丹的克隆， 然后将用降解能力的克隆测序、 分析， 确定目标基因的开放阅读框 (ORF)。 最后获得目标基因的开放阅读框大小为 2139bp， 命名为 cfd， 其编码的酶命名为 CFH。这是 首次针对氨基甲酸酯类农药的广谱、 高效降解酶基因的报道。 0010 所述 cfd 基因所编码的酶 CFH， 其氨基酸序列为 ： SEQ ID NO.2。 0011 含有所述 cfd 基因的重组表达载体。 0012 所述的重组表达载体优选将所述 cfd 基因插入 pET-29a(+) 的 NdeI 和 Eco。

12、RI 位点 之间所得 0013 含有所述 cfd 的基因工程菌。 0014 所述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌 BL21(DE3)。 0015 所述 cfd 基因在构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因作物中的应用。 0016 所述 cfd 基因在去除农产品、 土壤和水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。 0017 所述降解酶 CFH 在降解氨基甲酸酯类农药中的应用。 0018 所述降解酶 CFH 在去除农产品、 土壤和水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。 0019 所述重组表达载体在构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因作物中的应用。 0020 所述重组表达载体在去除水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。。

13、 0021 有益效果 0022 1. 本发明用鸟枪法成功的从菌株 YBL3(CCTCC NO:M208076) 中克隆出基因 cfd。 在 GenBank 比对结果表明该基因为一个新的基因， 全长 ( 从起始密码子到终止密码子 ) 为 2139bp， 编码 712 个氨基酸。 0023 2. 本发明中的降解酶 CFH 或携带 cfd 基因的工程菌能高效降解氨基甲酸酯类农 药。基因 cfd 可用于构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因微生物或植物， 亦可用于生产降 解氨基甲酸酯类农药的酶制剂， 用于消除土壤、 水体和农产品中氨基甲酸酯类农药残留。 附图说明 0024 图 1 基因 cfd 在 BL21。

14、(pET-29a(+) 中表达策略图。 0025 图 2 基因 cfd 在 BL21(pET-29a(+) 中表达产物降解呋喃丹生成呋喃酚的质谱检 测图。图 2A 为降解产物的一级质谱图 ； 图 2B 为物质 S1( 呋喃丹 ) 的二级质谱图 ； 图 2C 为 物质 S2( 呋喃酚 ) 的二级质谱图。 0026 生物材料保藏信息 0027 鞘氨醇杆菌YBL3， 分类命名为Sphingobium sp.YBL3， 保存在中国典型培养物保藏 中心 (CCTCC)， 地址为中国武汉武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO:M208076， 保藏日期为 2008 年 5 月 22 日。 说 明 书 C。

15、N 104178504 A 4 3/5 页 5 具体实施方式 0028 实施例 1 基因 cfd 的克隆 0029 (1) 细菌基因组总 DNA 的提取 0030 YBL3(CCTCC NO:M208076) 在液体 LB 培养基中 (37、 200rpm、 18h) 大量培养后， 采用 CTAB 法提取高纯度、 大片段的菌株 YBL3 基因组总 DNA， 溶于 TE 缓冲液 (pH8.0) 中， 置 于 -20保藏， 具体方法参考 F奥斯伯等编的 精编分子生物学实验指南 。 0031 (2)pUC118(BamHI) 购买于宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司。 0032 (3) 采用 Sau。

16、3AI 部分酶切菌株 YBL3 总 DNA。 0033 (4)DNA 的回收 0034 酶 切 后 的 总 DNA 通 过 电 泳 (TAE 缓 冲 液 ) 进 行 纯 化，采 用 axygen biosciences(China)回收试剂盒进行回收， 回收的DNA溶于10mmol/L的Tris HCl(pH8.0) 中， 置于 -20保藏。 0035 (5) 酶连 0036 建立如下反应体系 ： 0037 0038 0039 16温育 12 小时。 0040 (6) 转化及筛选 0041 取 10l 酶 连 产 物 转 化 200l 大 肠 杆 菌 DH5 感 受 态 细 胞 (TaKaRa。

17、， Code:D9057)， 具体方法参照 F. 奥斯伯等编的 精编分子生物学实验指南 P23。涂布含有 100mg/kg 氨苄青霉素的 LB 平板， 培养 24h 后分别挑选克隆子进行扩大培养， 将菌体细胞重 悬于 PBS(pH7.0) 中， 置于恒温摇床中 180rpm,30振荡培养 2 小时， 取出 PBS 菌悬液， 调节 菌体浓度至 OD600 2.0 便制成了菌株克隆子的静息细胞， 静息细胞悬液中加入 50mgL-1 的呋喃丹， 180rpm， 30， 于恒温摇床中振荡培养24h。 加入等体积二氯甲烷终止反应并剧烈 振荡提取产物， 有机相经无水硫酸钠脱水、 氮气吹干后溶于 100L 。

18、甲醇待测。用 HPLC 检测 克隆子能否降解呋喃丹， 液相条件为 ： 色谱柱， Kromasil 100-5C18(4.6mm250mm5m) ； 流动相， 甲醇 / 水 ( 体积比 70/30) ； 流速， 1mlmin-1； 紫外检测器， 波长 280nm 和 230nm ； 进 样量， 20l。 0042 (7) 基因核苷酸序列测定 0043 将 (6) 中获得的能降解呋喃丹的阳性克隆子委托上海英骏生物技术有限公司进 行序列测定， 呋喃丹降解酶基因 cfd 的核苷酸序列为 SEQ ID NO.1， 根据基因 cfd 核苷酸序 列所推到的 712 个氨基酸序列为 SEQ ID NO.2。 。

19、0044 实施例3呋喃丹水解酶CFH在BL21(pET-29a(+)中的高效表达及其功能测定(技 术路线图 1) 0045 (1) 基因 cfd 的 PCR 扩增 说 明 书 CN 104178504 A 5 4/5 页 6 0046 以正向引物 :5 -TCTGGACATATGTCTAGTGACAAACTCCAT-3 (SEQ ID NO.3) 和反向引 物 :5 -TCTGGAGAATTCATTGTCTTTTTGCATCA-3 (SEQ ID NO.4) 为引物， 用 PCR 从菌株 YBL3 总 DNA 中扩增出基因 cfd 序列。 0047 扩增体系 ： 0048 0049 0050 。

20、PCR 扩增程序 ： 0051 a.95变性 3min ； 0052 b.95变性 1.5min， 53退火 0.5min， 72延伸 1.5min， 进行 25 个循环 ； 0053 c.72延伸 10min， 冷却到室温。 0054 (2)PCR 产物用 NdeI 和 EcoRI 双酶切。 0055 酶切体系 ： 0056 0057 在 37水浴中， 反应 3h 以上。酶切产物进行 2的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。 0058 (3)pET-29a(+) 用 NdeI 和 EcoRI 双酶切 ( 参考 2.2)。 0059 (4) 转化 0060 (2) 中的回收片段和 (3) 中酶切好的 pE。

21、T-29a(+) 进行酶连 ( 参考实施例 1 步 骤 (5) 获 得 含 cfd 基 因 的 pET-29a(+) 重 组 质 粒 pET-29a(+)-cfd。 将 重 组 质 粒 pET-29a(+)-cfd 转化到表达宿主菌 BL21(DE3) 获得含 cfd 的重组微生物 BL21(CFH)。 0061 (5)CFH 的表达、 纯化和功能验证 0062 BL21(CFH) 在 LB 培养基中培养至 OD600nm为 0.6 到 0.8 之间， 加 IPTG 至浓度 1mM， 30培养4个小时。 100ml菌液离心， 用10ml(50mM,pH 7.0)PBS缓冲液重悬菌体， 超声破碎。

22、 (Auto Science,UH-650B ultrasonic processor,30intensity)5分钟， 离心， 收集上清， 用镍离子亲和层析柱对上清进行了纯化得呋喃丹水解酶 CFH。 0063 (6)CFH 降解呋喃丹产物的测定 0064 CFH 水解呋喃丹的反应体系 ： 50mM 磷酸缓冲液 (pH 7.0)， 50mgL-1呋喃丹、 CFH 50l， 30反应30min。 加入3ml二氯甲烷终止反应并剧烈振荡提取产物， 有机相经无水硫 酸钠脱水、 氮气吹干后溶于 100L 甲醇待测。质谱检测结果显示 CFH 能将呋喃丹降解为呋 说 明 书 CN 104178504 A 6。

23、 5/5 页 7 喃酚 ( 图 2)。 0065 (7)CFH 降解其它氨基甲酸酯类农药的能力测定 0066 CFH 水解氨基甲酸酯类农药的反应体系 ： 50mM 磷酸缓冲液 (pH 7.0)， 50mgL-1西 维因、 异丙威或速灭威、 CFH 50l， 30反应 30min。加入 3ml 二氯甲烷终止反应并剧烈 振荡提取产物， 有机相经无水硫酸钠脱水、 氮气吹干后溶于 100L 甲醇后用质谱检测。检 测结果显示 CFH 同样可以高效地降解西维因、 异丙威和速灭威。 0067 本发明使用的微生物来源如下 ： 0068 pUC118(BamHI) 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司， 00。

24、69 大肠杆菌 DH5 购自上海英骏生物技术有限公司， 0070 大肠杆菌高表达载体 pET-29a(+) 购自 Novegen 公司， 0071 表达宿主菌大肠杆菌 BL21(DE3) 购自上海英骏生物技术有限公司。 说 明 书 CN 104178504 A 7 1/5 页 8 0001 序 列 表 CN 104178504 A 8 2/5 页 9 0002 0003 序 列 表 CN 104178504 A 9 3/5 页 10 0004 序 列 表 CN 104178504 A 10 4/5 页 11 0005 序 列 表 CN 104178504 A 11 5/5 页 12 序 列 表 CN 104178504 A 12 1/3 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 104178504 A 13 2/3 页 14 说 明 书 附 图 CN 104178504 A 14 3/3 页 15 图 2 说 明 书 附 图 CN 104178504 A 15 。