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1、(10)申请公布号 CN 103073655 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103073655 A *CN103073655A* (21)申请号 201310047719.6 (22)申请日 2013.02.06 C08B 37/00(2006.01) A24B 3/12(2006.01) A24B 3/14(2006.01) (71)申请人 乌鲁木齐英赛特生物科技有限公司 地址 830011 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 天津南路 682 号创业大厦 6 层 609 (72)发明人 田英姿 赵谋明 崔春 英犁 王希军 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 。
2、44102 代理人 江裕强 (54) 发明名称 一种甘草多糖的提取方法及应用 (57) 摘要 本发明公开一种甘草多糖的提取方法及应 用。本发明采用高温有机酸法提取结合超滤膜 处理制备甘草多糖。甘草粉碎后， 通过高温有机 酸提取、 超滤截流、 浓缩和乙醇沉淀分离获得甘 草多糖。将本发明制备的甘草多糖以烟丝重量 0.05%0.2% 加入到卷烟中， 所得卷烟的烟草凝集 物对人支气管上皮 BEAS-2B 细胞存活率显著高于 空白样品， 具有正面作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (1。
3、0)申请公布号 CN 103073655 A CN 103073655 A *CN103073655A* 1/1 页 2 1. 一种甘草多糖的提取方法， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 甘草渣除沙洗净， 晾干后粉碎得甘草渣原料 ； （2） 在甘草渣原料中加入有机酸溶液， 于 110-120下提取 2-5 小时， 过滤， 分离甘草渣 提取液， 用氢氧化钾调节提取液 pH 值至 6.5-7.0 ； （3） 将步骤 （2） 所得的提取液用截留分子量 5000 道尔顿的膜进行超滤， 收集截流液部 分 ； （4） 将超滤透过液进行真空浓缩， 至原来体积的 1/71/3， 得浓缩液 ； （5） 在浓缩。
4、液中加入乙醇， 混合均匀后， 在 0-4下静置 1-3 小时， 过滤， 除去上层清液 部分， 得多糖沉淀 ； （6） 收集沉淀物， 冷冻干燥， 获得甘草多糖。 2. 根据权利要求 1 所述的甘草多糖的提取方法， 其特征在于步骤 （1） 所述甘草渣粉碎 至 40-100 目。 3. 根据权利要求 1 所述的提取分离方法， 其特征在于步骤 （2） 所述有机酸溶液为柠檬 酸或苹果酸中任意一种， 且溶液的 pH 值为 1.0-3.0。 4. 根据权利要求 1 所述的提取分离方法， 其特征在于步骤 （2） 所述有机酸溶液 的用量按甘草渣原料重量的 20-40 倍加入。 5. 根据权利要求 1 所述的提取。
5、分离方法， 其特征在于步骤 （5） 所述乙醇添加量满足混 合均匀后乙醇最终浓度为 75-90%（v/v） 。 6. 根据权利要求 1 所述的提取分离方法， 其特征在于步骤 （5） 所述多糖沉淀用 乙醇浸洗 2-3 次。 7. 根据权利要求 1 所述的提取分离方法， 其特征在于步骤 （6） 所得沉淀物进行 冷冻干燥， 得浅黄色甘草多糖。 8. 权利要求 1 所述的甘草多糖在卷烟中的应用， 其特征在于按照烟丝质量的 0.05-0.2% 的比例， 通过喷洒方式将其添加到烟丝或过滤嘴中。 权 利 要 求 书 CN 103073655 A 2 1/4 页 3 一种甘草多糖的提取方法及应用 技术领域 00。
6、01 本发明涉及甘草渣深加工技术， 具体是甘草多糖的提取方法及应用。 背景技术 0002 随着人们生活水平和生活质量的不断提高， 卷烟消费已经向品牌消费转变， 尤其 是高档卷烟市场， 消费者对卷烟的健康、 风味也提出越来越高的要求。生产低焦油、 低危害 的卷烟已成为我国乃至世界卷烟行业发展的重要方向之一。目前， 降低卷烟危害采用的主 要技术路线有两条 ： 一种是 “降焦” ， 即通过降低卷烟焦油的释放量使有害成分同时降低， 即 协同性降低卷烟烟气有害成分 ； 另一种是 “减害” ， 即采用特殊技术和添加功能性因子以达 到降低卷烟烟气中部分有害成分， 而对其他成分作用较小的目的， 即选择性降低卷。
7、烟烟气 中有害成分。烟草凝集物 （CSC） 对人支气管上皮 BEAS-2B 细胞的细胞毒性是评价卷烟安全 性的一项重要指标。目前已有多篇文献报道 CSC 诱导人支气管上皮 BEAS-2B 细胞凋亡并探 讨了其作用途径和机理。目前尚未见降低烟草凝集物 （CSC） 对人支气管上皮 BEAS-2B 细胞 的细胞毒性的方法。 0003 甘草为多年生草本， 主要分布于新疆、 青海、 甘肃等地。 甘草具有益气补中、 缓急止 痛、 润肺止咳、 泻火解毒和调和诸药的作用， 广泛应用于医药和食品行业。目前我国甘草主 要用于生产甘草浸提物、 甘草酸及其衍生物， 甘草渣是甘草加工的副产物。长期以来 , 工业 化生产。
8、只对甘草中的甘草甜素 ( 又名甘草酸 ) 作为主要有效成分进行提取 , 而提取甘草酸 后的甘草渣则被当作废弃物遗弃 , 造成了环境污染和资源浪费。由于加工技术手段限制， 目前我国甘草渣还没有得到充分利用， 或用于养殖饲料， 或作为肥料直接填埋回土地。 近年 来， 甘草渣的深加工利用成为国内研究的热点和重点。授权专利 （专利号 201010242200.X） 采用甘草渣为原料制备烟草薄片， 并发现烟草薄片添加到烟草中具有无焦油含量、 一氧化 碳释放量较低、 明显增香和减少卷烟刺激感的作用。授权专利 （专利号 201010111656.2） 公 开了一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方法。发明 。
9、（申请号 200510119580.7） 公开 了一种从甘草废渣中提取甘草酸的方法。发明 （申请号 02109474.8） 公开了一种从甘草废 渣中提取甘草黄酮的方法。目前尚未见以甘草渣或甘草为原料， 制备具有降低卷烟的烟草 凝集物 (CSC) 细胞毒性功能性甘草多糖的报道。 发明内容 0004 本发明的目的是填补目前关于应用甘草多糖降低卷烟烟草凝集物 （CSC） 对人支气 管上皮 BEAS-2B 细胞的细胞毒性方法的空白， 提供一种甘草多糖的提取方法及应用。将本 发明制备的甘草多糖加入到卷烟中， 所得卷烟的烟草凝集物对人支气管上皮 BEAS-2B 细胞 存活率显著高于空白样品， 具有正面作用。
10、。 0005 本发明同时提供了在卷烟中添加甘草多糖降低卷烟烟草凝集物 （CSC） 对人支气管 上皮 BEAS-2B 细胞的细胞毒性的应用。 0006 本发明的目的通过如下技术方案予以实现 ： 说 明 书 CN 103073655 A 3 2/4 页 4 一种甘草多糖的提取方法， 其包括如下步骤 ： （1） 甘草渣除沙洗净， 晾干后粉碎得甘草渣原料 ； （2） 在甘草渣原料中加入有机酸溶液， 于 110-120下提取 2-5 小时， 过滤， 分离甘草渣 提取液， 用氢氧化钾调节提取液 pH 值至 6.5-7.0 ； （3） 将步骤 （2） 所得的提取液用截留分子量 5000 道尔顿的膜进行超滤，。
11、 收集截流液部 分 ； （4） 将超滤透过液进行真空浓缩， 至原来体积的 1/71/3， 得浓缩液 ； （5） 在浓缩液中加入乙醇， 混合均匀后， 在 0-4下静置 1-3 小时， 过滤， 除去上层清液 部分， 得多糖沉淀 ； （6） 收集沉淀物， 冷冻干燥， 获得甘草多糖。 0007 进一步改进的， 步骤 （1） 所述甘草渣粉碎至 40-100 目。 0008 进一步改进的， 步骤 （2） 所述有机酸溶液为柠檬酸或苹果酸中任意一种， 且溶液的 pH 值为 1.0-3.0。 0009 进一步改进的， 步骤 （2） 所述有机酸溶液的用量按甘草渣原料重量的 20-40 倍加 入。 0010 进一步。
12、改进的， 步骤 （5） 所述乙醇添加量满足混合均匀后乙醇最终浓度为 75-90% （v/v） 。 0011 进一步改进的， 步骤 （5） 所述多糖沉淀用乙醇浸洗 2-3 次。 0012 进一步改进的， 步骤 （6） 所得沉淀物进行冷冻干燥， 得浅黄色甘草多糖。 0013 上述方法得到的甘草多糖在卷烟中的应用， 具体是按照烟丝质量的 0.05-0.2% 的 比例， 通过喷洒方式将其添加到烟丝或过滤嘴中。 0014 本发明采用了以上技术方案， 具有如下的优点和有益效果 ： 1、 本发明提供了一种甘草多糖的提取分离方法， 将本发明制备的甘草多糖以烟丝重量 0.05%0.2% 加入到卷烟中， 所得卷烟。
13、的烟草凝集物对人支气管上皮 BEAS-2B 细胞存活率显 著高于空白样品， 具有正面作用。此外， 本发明制备的甘草多糖对卷烟的吸食品质无影响。 0015 2、 本发明以低值的甘草渣为原料， 制备具有功能活性的甘草多糖， 实现了甘草渣 资源的高值化利用。所公开的甘草多糖提取方法具有工艺流程简单、 易于产业化的特点。 具体实施方式 0016 烟草凝集物细胞毒性试验 ： 按标准吸烟条件 （GB/T 16450-1996， 常规分析用吸烟 机定义的标准条件） 收集卷烟烟气， 制备烟气凝集物， 用细胞培养液配制成 1 支烟 /ml 的溶 液， 液氮储存备用。实验时， 稀释到实验设计浓度。人支气管上皮 B。
14、EAS-2B 细胞采用无血清 的 LHC-8 培养基， 在 37 度、 5% 二氧化碳和 95% 湿度条件下培养。 0017 将指数生长期的细胞， 以适当密度接种于 96 孔板中， 24h 后加入不同浓度的烟草 凝集物， 每种条件设 6 个平行洋， 培养基总体积为 200ul， 在在 37 度、 5% 二氧化碳和 95% 湿 度条件下继续培养 72h。培养结束前 4h， 每孔加入 5mg/ml MTT 溶液 20ul。培养结束后， 取 上清液， 加入150ulDMSO， 吹打混匀， 待紫色结晶全部溶解后， 用酶标仪测定490nm波长的OD 值， 计算细胞存活分数。 0018 下面结合实施例和附。
15、表对本发明的具体实施作进一步说明。 说 明 书 CN 103073655 A 4 3/4 页 5 0019 实施例 1 （1） 甘草渣除沙洗净， 晾干后粉碎， 过 40 目筛得甘草渣原料 ； （2） 按甘草渣原料重量的 35 倍加入水， 于 110下提取 5 小时， 过滤， 分离甘草渣， 得提 取液， 用氢氧化钾调节提取液 pH 值至 7.0 ； （3） 将步骤 （2） 所得的提取液用截留分子量 5000 道尔顿的膜进行超滤， 收集截流液部 分 ； （4） 将提取液进行真空浓缩， 至原来体积的 1/5， 得浓缩液 ； （5） 在浓缩液中加入乙醇， 混合均匀后乙醇最终浓度为 70%（v/v） ，。
16、 在 2下静置 3 小 时， 过滤， 除去上层清液部分， 得多糖沉淀 ； （5） 收集沉淀物， 冷冻干燥， 获得浅黄色甘草渣多糖 1#。 0020 实施例 2 （1） 甘草渣除沙洗净， 晾干后粉碎， 过 40 目筛得甘草渣原料 ； （2） 按甘草渣原料重量的 35 倍加入 pH 值为 2 的柠檬酸溶液， 于 110下提取 5 小时， 过滤， 分离甘草渣， 得提取液， 用氢氧化钾调节提取液 pH 值至 7.0 ； （3） 将步骤 （2） 所得的提取液用截留分子量 5000 道尔顿的膜进行超滤， 收集截流液部 分 ； （4） 将截流液进行真空浓缩， 至原来体积的 1/5， 得浓缩液 ； （5） 在。
17、浓缩液中加入乙醇， 混合均匀后乙醇最终浓度为 70%（v/v） ， 在 2下静置 3 小 时， 过滤， 除去上层清液部分， 得多糖沉淀 ； （5） 收集沉淀物， 冷冻干燥， 获得浅黄色甘草渣多糖 2#。 0021 实施例 3 （1） 甘草渣除沙洗净， 晾干后粉碎， 过 80 目筛得甘草渣原料 ； （2） 按甘草渣干粉重量的 20 倍加入 pH 值为 1 的柠檬酸溶液， 于 120下提取 2 小时， 过滤， 分离甘草渣渣得提取液， 用氢氧化钾调节提取液 pH 值至 6.5 ； （3） 将步骤 （2） 所得的提取液用截留分子量 5000 道尔顿的膜进行超滤， 收集截流液部 分 ； （4） 将超滤透。
18、过液进行真空浓缩， 至原来体积的 1/5， 得浓缩液 ； （5） 在浓缩液中加入乙醇， 混合均匀后乙醇最终浓度为 85%（v/v） ， 在 4下静置 12 小 时， 过滤， 除去上层清液部分， 得多糖沉淀， 并用乙醇和丙酮浸洗 2-3 次 ； （6） 收集沉淀物， 冷冻干燥， 获得浅黄色甘草渣多糖 3#。 0022 实施例 4 （1） 甘草渣除沙洗净， 晾干后粉碎， 过 100 目筛得甘草渣原料 ； （2） 按甘草渣干粉重量的25倍加入pH值为2.5的苹果酸溶液， 于115下提取4小时， 过滤， 分离甘草渣渣得提取液， 用氢氧化钾调节提取液 pH 值至 6.7 ； （3） 将步骤 （2） 所得。
19、的提取液用截留分子量 5000 道尔顿的膜进行超滤， 收集截流液部 说 明 书 CN 103073655 A 5 4/4 页 6 分 ； （4） 将超滤透过液进行真空浓缩， 至原来体积的 1/7， 得浓缩液 ； （5） 在浓缩液中加入乙醇， 混合均匀后乙醇最终浓度为 80%（v/v） ， 在 3下静置 10 小 时， 过滤， 除去上层清液部分， 得多糖沉淀， 用乙醇浸洗 2-3 次 ； （6） 收集沉淀物， 冷冻干燥， 获得浅黄色甘草渣多糖 4#。 0023 实施例 5 （1） 甘草渣除沙洗净， 晾干后粉碎， 过 80 目筛得甘草渣原料 ； （2） 按甘草渣干粉重量的25倍加入pH值为3.0的。
20、柠檬酸溶液， 于110下提取5小时， 过滤， 分离甘草渣渣得提取液， 用氢氧化钾调节提取液 pH 值至 6.8 ； （3） 将步骤 （2） 所得的提取液用截留分子量 5000 道尔顿的膜进行超滤， 收集截流液部 分 ； （4） 将超滤透过液进行真空浓缩， 至原来体积的 1/3， 得浓缩液 ； （5） 在浓缩液中加入乙醇， 混合均匀后乙醇最终浓度为 90%（v/v） ， 在 4下静置 3 小 时， 过滤， 除去上层清液部分， 得多糖沉淀， 用乙醇浸洗 3 次 ； （6） 收集沉淀物， 冷冻干燥， 获得浅黄色的甘草渣多糖 5#， 。 0024 卷烟 CSC 对人支气管上皮 BEAS-2B 细胞增殖。
21、的影响 产品添加量 IC50 甘草多糖 1# 0.1%0.00299 支烟 /ml 甘草多糖 2# 0.1%0.00485 支烟 /ml 甘草多糖 3# 0.1%0.00496 支烟 /ml 甘草多糖 4# 0.1%0.00499 支烟 /ml 甘草多糖 5# 0.1%VC 空白 0.00295 支烟 /ml 由表1可见， 用去离子水溶解甘草多糖， 通过喷洒方式在卷烟中添加0.1%的甘草多糖， 其卷烟 CSC 对人支气管上皮 BEAS-2B 细胞增殖的 IC50 值是空白样品的 1.74 倍。采用常 规的热水提取得到的甘草多糖其卷烟 CSC 对人支气管上皮 BEAS-2B 细胞增殖的 IC50 值与 空白样品相当。这表明， 本发明所制备的甘草多糖可以显著提高卷烟 CSC 对人支气管上皮 BEAS-2B 细胞增殖的 IC50 值， 即添加了甘草多糖的卷烟安全性更高。 说 明 书 CN 103073655 A 6 。