氮3异噁唑基34噻吩基嘧啶磺酰基丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102993193 A (43)申请公布日 2013.03.27 C N 1 0 2 9 9 3 1 9 3 A *CN102993193A* (21)申请号 201210060809.4 (22)申请日 2012.03.09 201110055787.8 2011.03.09 CN C07D 413/14(2006.01) A61K 31/506(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人四川大学 地址 610065 四川省成都市武候区一环路南 一段24号 (72)发明人魏于全 杨胜勇 王永生 石华山 (74)专利代理机构成都虹桥专利事。

2、务所(普通 合伙) 51124 代理人梁鑫 (54) 发明名称 氮-3-异噁唑基-3-4-噻吩基-嘧啶磺酰基 丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途 (57) 摘要 本发明属于医药领域，具体涉及氮-(4，5-2 氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧 啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药 物中的用途。本发明的要解决的技术问题是于 为抑制肿瘤代谢的药物提供一类新的化合物。 本发明的技术方案是提供氮-(4，5-2氢异噁 唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰 基)丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途， 结构如式I所示。本发明创造性地发现式I所示 的化合物具有好的抗。

3、肿瘤作用，能用于制备抗肿 瘤药物组合物，为抗肿瘤药物制备领域提供了一 种新的选择，具有很好的应用前景。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书8页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 4 页 1/2页 2 1.式I所示的氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基) 丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途： 式I 其中，R 1 、R 2 、R 7 、R 8 独立的为H、卤素、NH 2 、CF 3 、卤代C1C8烷基、C1C8烷氧基或 C1C8烷基； R 。

4、3 R 6 独立的为H或C1C8烷基； R 9 R 11 独立的为H、呋喃环基、环丙基、吡唑基或C1C8烷基。 2.根据权利要求1所述的用途，特征在于： R 1 R 6 独立的为H或C1C8烷基，且R 1 和R 2 中至少一个为C1C8烷基； R 7 、R 8 独立的为H、C1C8烷基或CF 3 ，且R 7 和R 8 中至少一个为CF 3 ； R 9 R 11 独立的为H或C1C8烷基。 3.根据权利要求2所述的用途，特征在于： R 1 R 6 独立的为H或C1C4烷基，且R 1 和R 2 中至少一个为C1C4烷基； R 7 、R 8 独立的为H、C1C4烷基或CF 3 ，且R 7 和R 8 。

5、中至少一个为CF 3 ； R 9 R 11 独立的为H或C1C4烷基。 4.根据权利要求3所述的用途，特征在于： R 1 、R 2 独立的为H或C1C8烷基，且R 1 和R 2 中至少一个为C1C8烷基； R 7 、R 8 独立的为H或CF 3 ，且R 7 和R 8 中至少一个为CF 3 ； R 3 R 6 、R 9 R 11 为H。 5.根据权利要求4所述的用途，特征在于： R 1 、R 2 独立的为H或甲基，且R 1 和R 2 中至少一个为甲基； R 7 、R 8 独立的为H或CF 3 ，且R 7 和R 8 中至少一个为CF 3 ； R 3 R 6 、R 9 R 11 为H。 6.式II所。

6、示的氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基) 丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途： 权 利 要 求 书CN 102993193 A 2/2页 3 式II 其中，所述R 1 独立的为H、卤素、NH 2 、CF 3 、卤代C1C8烷基、C1C8烷氧基或C1 C8烷基； 所述R 2 独立的为H、呋喃环、环丙基或吡唑。 7.根据权利要求6所述的用途，特征在于，所述的化合物的化学名为： N-(5-methyl-4，5-dihydroisoxazol-3-yl)-3-(4-(thiophen-2-yl)-6-(trifluorome thyl)pyrimidin。

7、-2-ylsulfonyl)propanamide。 8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的化合物具有式III所示的结构： 式III。 权 利 要 求 书CN 102993193 A 1/8页 4 氮 -3- 异噁唑基 -3-4- 噻吩基 - 嘧啶磺酰基丙酰胺衍生物 在制备抗肿瘤药物中的用途 技术领域 0001 本发明属于医药领域，具体涉及氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻 吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。 背景技术 0002 恶性肿瘤已成为危害人类健康和生存的重要杀手，其发病率和死亡率已超过心血 管疾病，并且发病率有明显上升的趋。

8、势。虽然随着近年来治疗方法的不断改进和新药物的 发现，使得部分肿瘤的5年生存率有所上升，但是诸如肺癌，肝癌，前列腺癌等癌症的预后 仍很差，死亡率高。肿瘤病人多伴随有能量消耗高、体重减轻等代谢紊乱现象。上世纪20 年代，德国诺贝尔奖得主奥托瓦伯格发现肿瘤组织的代谢明显增强，肿瘤细胞主要依赖糖 酵解进行代谢，其耗糖速度远大于正常细胞。近年来，肿瘤代谢异常现象再次引起人们的重 视，这种“瓦伯格效应”又开始成为肿瘤研究的焦点。哈佛大学科学家发现主要存在于肿瘤 细胞的M2型丙酮酸激酶(PKM2)可促进肿瘤细胞“瓦伯格效应”的发生，并对肿瘤的形成和 生长起着至关重要的作用。实验研究已发现，抑制PKM2的活。

9、性，可以干扰肿瘤的代谢，抑制 肿瘤的增值，增加肿瘤细胞的凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的目的。 0003 基于PKM2的抑制剂在肿瘤治疗中的重要价值，本发明的发明人开展了针对PKM2 的靶向小分子药物设计和合成研究工作，设计并合成了一些实体化合物，进过体外细胞筛 选，发现其中一些化合物对肿瘤细胞的增值具有一定的抑制活性，它们在多种肿瘤细胞株 上显示出良好的抑制活性，并在体内实验中也显示了较好的实验效果。 发明内容 0004 本发明的目的在于为制备肿瘤防治的药物提供新的有效选择。 0005 本发明的技术方案是提供结构如式I所示的氮-(4，5-2氢异噁 唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-。

10、2-磺酰基)丙酰胺衍生物在制备肿瘤防治药物中 的用途： 0006 说 明 书CN 102993193 A 2/8页 5 0007 其中，R 1 、R 2 、R 7 、R 8 独立的为H、卤素、NH 2 、CF 3 、卤代C1C8烷基、C1C8烷氧基 或C1C8烷基； 0008 R 3 R 6 独立的为H或C1C8烷基； 0009 R 9 R 11 独立的为H、呋喃环基、环丙基、吡唑基或C1C8烷基。 0010 优选的，R 1 R 6 独立的为H或C1C8烷基，且R 1 和R 2 中至少一个为C1C8烷 基； 0011 R 7 、R 8 独立的为H、C1C8烷基或CF 3 ，且R 7 和R 8 。

11、中至少一个为CF 3 ； 0012 R 9 R 11 独立的为H或C1C8烷基。 0013 进一步优选的，R 1 R 6 独立的为H或C1C4烷基，且R 1 和R 2 中至少一个为C1 C4烷基； 0014 R 7 、R 8 独立的为H、C1C4烷基或CF 3 ，且R 7 和R 8 中至少一个为CF 3 ； 0015 R 9 R 11 独立的为H或C1C4烷基。 0016 更进一步优选的，R 1 、R 2 独立的为H或C1C8烷基，且R 1 和R 2 中至少一个为C1 C8烷基； 0017 R 7 、R 8 独立的为H或CF 3 ，且R 7 和R 8 中至少一个为CF 3 ； 0018 R 3。

12、 R 6 、R 9 R 11 为H。 0019 最优选的，R 1 、R 2 独立的为H或甲基，且R 1 和R 2 中至少一个为甲基； 0020 R 7 、R 8 独立的为H或CF 3 ，且R 7 和R 8 中至少一个为CF 3 ； 0021 R 3 R 6 、R 9 R 11 为H。 0022 本发明另外还提供了结构如式II所示的氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻 吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物在制备肿瘤防治药物中的用途： 0023 0024 式II 0025 其中，所述R 1 独立的为H、卤素、NH 2 、CF 3 、卤代C1C8烷基、C 1 C 8 烷氧基或 。

13、C1C8烷基；所述R 2 独立的为H、呋喃环、环丙基或吡唑。 0026 进一步的，所述R 1 独立的为C1C4烷基、卤代C1C4烷基或C 1 C 4 烷氧基。 0027 进一步的，所述化合物的其化学名为： 0028 N-(5-methyl-4，5-dihydroisoxazol-3-yl)-3-(4-(thiophen-2-yl)-6-(trifluo romethyl)pyrimidin-2-ylsulfonyl)propanamide 说 明 书CN 102993193 A 3/8页 6 0029 进一步的，所述化合物具有式III所示的结构 0030 0031 式III 0032 本发明的。

14、有益效果在于，创造性地发现式I所示的氮-(4，5-2氢异噁 唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物具有好的抗肿瘤作用， 能用于制备抗肿瘤药物组合物，并通过实验表明其很可能是通过降低肿瘤细胞代谢起到抗 肿瘤作用。为抗肿瘤药 物制备领域提供了一种新的选择，具有很好的应用前景。 附图说明 0033 图1为本发明中氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺 酰基)丙酰胺衍生物对人肺癌细胞株A549的增值抑制实验结果。 0034 图2为本发明中氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺 酰基)丙酰胺衍生。

15、物对人肝癌细胞株HepG2的增值抑制实验结果。 0035 图3为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人肺癌A549肿瘤模型的治疗实验结果。 0036 图4为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人肝癌HepG2肿瘤模型的治疗实验结果。 0037 图5为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人乳腺癌MCF-7肿瘤模型的治疗实验结果。 0038 图6为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人结肠癌SW480肿瘤模型的治疗实验结果。 0039 图7为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人卵巢癌SKOV-3肿瘤模型的治疗实验结果。 0040 以下结合附图通过对具体实施方式的描述说明但不限制本发明。 具体实施方式 0041 实施例一式III所示的化合物抑制肿瘤的体外实。

16、验 0042 一、式III所示的化合物的来源及理化性质 0043 本发明具体实施方式中使用的一种氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻 吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物结构式如式III所示，购买自荷兰Specs公司 (Specs，荷兰)，相对分子质量为448.05， 0044 说 明 书CN 102993193 A 4/8页 7 0045 式III 0046 该异噁唑噻吩嘧啶为浅黄色粉末，在水，乙醇等溶剂中溶解性差。 0047 其化学名为：N-(5-methyl-4，5-dihydroisoxazol-3-yl)-3-(4-(thiophen-2-yl) -6-(tri。

17、fluoromethyl)pyrimidin-2-ylsulfonyl)propanamide； 0048 中文名：氮-(5-甲基-4，5-异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲 基)-2-丙磺酰基嘧啶。 0049 二实验材料 0050 1、主要试剂 0051 RPMI-1640、DMEM、胎牛血清、胰酶等购自Gibco BRL公司(Invitrogen Corporation，USA)，溴化噻唑蓝四唑(MTT)、碘化丙啶(PI)，二甲亚砜(DMSO)为Sigma 公司(USA)产品。式III所示的氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻 吩-2-基)-。

18、6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺购自荷兰Specs公司，为化学标准品， 体外实验时用DMSO配制成10mg/ml储存液，置4冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液 稀释至所需浓度。 0052 2、细胞系及培养 0053 本实验所用的人肺癌细胞株(A549)，人肝癌细胞株(HepG2)，人前列腺癌细胞株 (PC-3)，人乳腺癌细胞株(MCF-7)，人结肠癌细胞株(SW480)，人肾癌细胞株(OSC)和人卵巢 癌细胞株(SKOV-3)购于美国ATCC公司，常规保存。HepG2细胞及SW480细胞用含10胎 牛血清、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的DMEM完全培养基、5CO 2 、。

19、37培养。PC-3细 胞、MCF-7细胞、OSC细胞、SKOV-3细胞及A549细胞用含10胎牛血清、100U/ml青霉素、 100g/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基、5CO 2 、37培养。 0054 三实验方法和结果 0055 1 统计学方法 0056 实验数据用均数标准差表示，采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料采用t 检验，P0.05为差异有统计学意义。 0057 2 细胞增殖抑制实验 0058 2.1实验方法(MTT法) 0059 用完全培养液调整细胞浓度为210 4 /ml，接种于96孔板，每孔200l，培 说 明 书CN 102993193 A 5/8页 8 养过。

20、夜，次日分别用不同剂量的氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻 吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺(终浓度分别为10，5，2.5，1.25，0.625， 0.312，0.16g/ml)处理细胞，同时等体积的溶剂对照组，DMSO浓度为0.1(0.1的DMSO 对细胞增殖没有影响)。每个设5个复孔，37，5CO 2 培养。分别于培养48小时后，取1个 培养板，每孔加入5mg/ml MTT试剂20l，继续培养2到4小时，弃上清，再加DMSO150l， 振荡混匀15min，用酶标仪(入570nm)测定吸光度(A)值(A值与活细胞数成正比)，取 其平均值。相对细。

21、胞增殖抑制率 ()(对照组A 570 -实验组A 570 )/对照组A 570 100。 实验至少重复3次(因溶剂对照组无细胞细胞增殖抑制作用，故这里的对照组是指溶剂对 照组)。为了观察氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲 基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺细胞增殖抑制作用是否有时间依赖性，进一步进行氮-(5-甲 基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰 胺作用A549细胞和HepG2细胞72小时细胞增殖抑制试验，试验处理方法同上。 0060 2.2氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(。

22、4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰 胺衍生物对细胞增殖抑制实验结果 0061 不同浓度氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基) 丙酰胺衍生物作用不同细胞后，随药物浓度增大，细胞增殖抑制越明显，各剂量组与对照组 相比，细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P0.05)(结果见表1)。氮-(5-甲基-4， 5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺处 理A549、HepG2、MCF-7、PC-3、SW480、OSC、SKOV-3细胞48h的半数抑制浓度(IC 50 )分别为 1.58g/ml、3.0。

23、1g/ml、4.57g/ml、5.69g/ml、3.58g/ml、4.74g/ml、10.2g/ml。 0062 不同浓度氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基) 丙酰胺衍生物作用A549及HepG2细胞不同时间，细胞抑制率随作用时间逐渐升高(结果 见图1和图2)。各剂量组与对照组相比，相对细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P 0.05)。细胞增殖抑制实验结果显示氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻 吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺能显著性抑制各种不同组织来源地肿 瘤细胞的增值。 0063 表1氮-(4，5。

24、-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰 胺衍生 0064 物对不同肿瘤细胞株的相对增殖抑制率() 0065 说 明 书CN 102993193 A 6/8页 9 0066 3流式细胞仪分析检测细胞凋亡 0067 3.1实验方法 0068 取对数生长期的HepG2细胞和PC-3细胞，按照每孔110 5 个细胞接种于6孔板 中，培养24小时后，加入氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺 酰基)丙酰胺衍生物，使其终浓度分别为10，5，2.5，1.25，0.625g/ml，每个剂量组设3个复 孔，37，5CO 2 培养。培养72。

25、小时后，收集不同处理组和对照组的细胞，用4预冷的PBS 洗涤3次，加入70冷乙醇固定细胞。离心之后加入含RNase的PI染料，半小时后上流式 细胞仪检测。 0069 3.2实验结果 0070 HepG2和PC-3细胞经-作用后经流式细胞仪检测时发现，在G0/G1期峰前出现一 亚二倍体，使用凋亡程序软件去除细胞碎屑后分析确认其为凋亡峰，此峰随药物浓度增大 而升高呈现出较明显的剂量依赖性。处理组和对照组相比有显著性差异(P0.05)(结果 见表2)，提示氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基) 嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺对A549和HepG2细胞的增。

26、值抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡 而实现。 0071 表2对不同细胞株的诱导凋亡比例() 0072 浓度(g/ml) 10 5 2.5 1.25 0.625 A549 61.5 62.1 56.9 31.4 13.3 HepG2 66.2 53.5 36.7 28.6 11.8 0073 实施例二异噁唑噻吩嘧啶抑制肿瘤的实验 0074 一、异噁唑噻吩嘧啶的来源及理化性质 0075 本发明具体实施方式中使用的一种异噁唑噻吩嘧啶结构式如式III所示，购买自 荷兰Specs公司(Specs，荷兰)，相对分子质量为448.05， 0076 说 明 书CN 102993193 A 7/8页 10 007。

27、7 式III 0078 该异噁唑噻吩嘧啶为浅黄色粉末，在水，乙醇等溶剂中溶解性差。 0079 其化学名为：N-(5-methyl-4，5-dihydroisoxazol-3-yl)-3-(4-(thiophen-2-yl) -6-(trifluoromethyl)pyrimidin-2-ylsulfonyl)propanamide 0080 中文名：氮-(5-甲基-4，5-异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲 基)-2-丙磺酰基嘧啶。 0081 二实验材料 0082 1、主要试剂 0083 RPMI-1640、DMEM、胎牛血清、胰酶等购自Gibco BRL公司(Invi。

28、trogen Corporation，USA)，溴化噻唑蓝四唑(MTT)、碘化丙啶(PI)，二甲亚砜(DMSO)为Sigma公司 (USA)产品。式II所示的异噁唑噻吩嘧啶购自荷兰Specs公司，为化学标准品，体外实验时 用DMSO配制成10mg/ml储存液，置4冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需 浓度。 0084 2、细胞株及培养 0085 本实验所用的人肺癌细胞株(A549)，人肝癌细胞株(HepG2)，人乳腺癌细胞株 (MCF-7)，人结肠癌细胞株(SW480)和人卵巢癌细胞株(SKOV-3)购于美国ATCC公司，常规 保存。HepG2细胞及SW480细胞用含10胎牛血清、1。

29、00U/ml青霉素、100g/ml链霉素的 DMEM完全培养基、5CO 2 、37培养。MCF-7细胞、SKOV-3细胞及A549细胞用含10胎牛 血清、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基、5CO 2 、37培养。 0086 3、动物饲养 0087 本实验所用的SPF级裸鼠购自北京华阜康公司，均为6到8周，饲养于恒温、恒湿 的层流动物房。 0088 三实验方法和结果 0089 1 统计学方法 0090 实验数据用均数标准差表示，采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料采用t 检验，P0.05为差异有统计学意义。 0091 2 肿瘤模型治疗实验 0092 。

30、2.1实验方法 0093 收集培养的肿瘤细胞，双无培养基洗两次，用双无培养液调整细胞浓度为510 7 / 说 明 书CN 102993193 A 10 8/8页 11 ml，接种于裸鼠右侧背部，待肿瘤生长至50-100立方毫米后，每天一次腹腔注射治疗，药物 浓度为1mg/kg，同时等体积的溶剂对照组，每组10只小鼠。每三天测量一次肿瘤体积，计算 方法为：体积0.52长宽宽。实验至少重复3次(因溶剂对照组无细胞细胞增殖 抑制作用，故这里的对照组是指溶剂对照组)。 0094 2.2异噁唑噻吩嘧啶对细胞增殖抑制实验结果 0095 异噁唑噻吩嘧啶作用不同肿瘤模型，随药给药时间延长，肿瘤抑制率越明显，各。

31、给 药组与对照组相比，肿瘤抑制率差异均有统计学意义(P0.05)。具体各肿瘤动物模型的 结果为：A549肿瘤模型(结果见图3)、HepG2肿瘤模型(结果见图4)、MCF-7肿瘤模型(结 果见图5)、SW480肿瘤模型(结果见图6)、SKOV-3肿瘤模型(结果见图7)肿瘤模型的抑瘤 率分别为62、59、73、34、45。 说 明 书CN 102993193 A 11 1/4页 12 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102993193 A 12 2/4页 13 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102993193 A 13 3/4页 14 图5 图6 说 明 书 附 图CN 102993193 A 14 4/4页 15 图7 说 明 书 附 图CN 102993193 A 15 。