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1、10申请公布号CN104046567A43申请公布日20140917CN104046567A21申请号201310087429422申请日20130317C12N1/12200601C12P7/64200601C12R1/8920060171申请人中国石油化工股份有限公司地址100728北京市朝阳区朝阳门北大街22号申请人中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院72发明人荣峻峰周旭华朱俊英黄绪耕54发明名称养殖微藻的方法和生产油脂的方法57摘要本发明涉及养殖微藻的方法和生产油脂的方法，其中的养殖方法包括分多次为微藻提供氮肥；至少有一次氮肥是在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其处于缺氮刺激状态下加入。
2、的；养殖时间10天以上。本发明的养殖方法既可以保证微藻的正常生长，又可以使其积累较多的油脂。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图1页10申请公布号CN104046567ACN104046567A1/1页21一种养殖微藻的方法，分多次为微藻提供氮肥；至少有一次氮肥是在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其处于缺氮刺激状态下加入的；养殖时间10天以上。2按照权利要求1所述的方法,其特征在于，只有在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其处于缺氮刺激状态下，才加入氮肥。3按照权利要求1所述的方法,其特征在于，至少有一次氮肥是在藻液中的氮。
3、肥在被微藻基本或全部消耗完的情况下加入的。4按照权利要求3所述的方法,其特征在于，只有在藻液中的氮肥在被微藻基本或全部消耗完的情况下，才加入氮肥。5按照权利要求1所述的方法,其特征在于，每次加入的氮肥为微藻12小时的消耗量72小时的消耗量。6按照权利要求5所述的方法,其特征在于，每次加入的氮肥量为微藻12小时的消耗量48小时的消耗量。7按照权利要求6所述的方法,其特征在于，每次加入的氮肥量为微藻12小时的消耗量24小时的消耗量。8按照权利要求1所述的方法,其特征在于，当藻液达到采收浓度且藻液中的氮肥被微藻基本或全部消耗完时，再进行采收。9按照权利要求1所述的方法,其特征在于，所述的氮肥选自尿素。
4、、铵盐、硝酸盐和氨基酸中的一种或几种。10按照权利要求1所述的方法,其特征在于，培养温度为1540；光强为2000200000勒克斯；在微藻培养过程中通入CO2，并使藻液PH值在610的范围内。11按照权利要求1所述的方法,其特征在于，养殖时间20天以上。12按照权利要求1所述的方法,其特征在于，所述微藻属于硅藻门、绿藻门或金藻门。13按照权利要求3所述的方法,其特征在于，在氮肥耗光时立即补加氮肥或在氮肥耗光后的72H内补加氮肥。14一种养殖微藻的方法，分多次为微藻提供氮肥，每次加入的氮肥量为00309MMOL/L,只有在藻液中的氮肥被微藻基本或全部消耗完的情况下，才加入氮肥，养殖时间10天以。
5、上；所述微藻为小球藻或栅藻。15按照权利要求14所述的方法,其特征在于，控制每次氮肥的加入量，使其在72H内被微藻消耗完。16按照权利要求14所述的方法,其特征在于，所述的氮肥选自尿素、铵盐、硝酸盐和氨基酸中的一种或几种。17按照权利要求14所述的方法,其特征在于，培养温度为1540；光强为2000200000勒克斯；在微藻培养过程中通入CO2，并使藻液PH值在610的范围内。18按照权利要求14所述的方法,其特征在于，养殖时间20天以上。19按照权利要求14所述的方法,其特征在于，在氮肥耗光时立即补加氮肥或在氮肥耗光后的72H内补加氮肥。20一种生产油脂的方法，包括微藻养殖、微藻采收、微藻油。
6、脂的分离和提取，其特征在于，微藻养殖采用权利要求1或14的方法。权利要求书CN104046567A1/6页3养殖微藻的方法和生产油脂的方法技术领域0001本发明涉及养殖微藻的方法和生产油脂的方法。背景技术0002微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它是由阳光驱动的细胞工厂，通过微藻细胞高效的光合作用，吸收CO2，将光能转化为脂肪或淀粉等碳水化合物的化学能，并放出O2。利用微藻生产生物能源与化学品可以同时达到“替代化石能源、减少CO2排放、净化废气与污水”三个目的。“微藻生物技术”的优势在于以下几个方面微藻是光合效率最高的原始植物，与农作物相比，单位面积的产率高出数十倍。微藻。
7、也是自然界中生长最为迅速的一种植物，通常在24H内，微藻所含生物质可以翻倍，在其“指数生长期”内其生物量翻倍时间可以缩短到35H。微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，因此微藻可以不同农作物争地、争水。产油率高，微藻干细胞的含油量可高达70，微藻没有高等植物的根茎叶等细胞分化，在缺氮等条件下，某些单细胞微藻可大量积累油脂，是最有前景的产油生物。微藻的培养可以利用工业废气中的CO2，缓解温室气体的排放，也可以吸收工业废气中的NOX，减少环境的污染。生产微藻生物柴油的同时，还可以生产相当数量的微藻生物质，。
8、还可进一步获得蛋白质、多糖、脂肪酸等高价值产品。0003微藻可分为原核藻类和真核藻类，原核藻类以蓝藻为主，含叶绿素A、不形成细胞器、能进行光合作用，细胞中蛋白质含量高，可达干重的70，脂肪含量低，为5左右；真核藻类种类比较多，是主要的生物燃料藻种的来源。常见的微藻主要归于以下八个门类硅藻门（BACILLARIOPHYTA）、绿藻门（CHLOROPHYTA）、金藻门（CHRYSOPHYTA）、蓝藻门（CYANOPHYTA）、甲藻门（PYRROPTATA）、红藻门（RHODOPHYTA）、隐藻门（CRYPTOPHYTA）和黄藻门（XANTHOPHYTA）。其中，硅藻门、绿藻门和金藻门是最具潜力的生。
9、物柴油藻种来源。0004微藻高效规模化养殖技术，即通过研究开发微藻规模化养殖的新设备与新工艺来高效、低成本地获得微藻生物量，是微藻生物技术的核心之一。影响微藻生长的因素很多，主要有光、营养盐、CO2、PH、温度和O2等，这些因素在微藻规模化养殖过程中所产生的影响尤为突出。研究表明，微藻的生长及油脂含量与光照、氮、磷和温度等培养条件密切相关。不同微藻生长和积累油脂的培养条件不尽相同，应该根据不同的藻种确定最佳培养条件，提高生长速率和油脂含量。微藻的养殖需要有充足的阳光、CO2、水和无机盐，温度通常要控制在2030，培养液必须能够提供组成微藻细胞的无机元素，如N、P、K、SI、FE等。0005目前。
10、对于大部分微藻尤其是绿藻而言，提高其细胞油脂含量的主要培养方法是条件胁迫，尤其是缺氮胁迫,即将藻细胞接种于缺氮环境的培养体系中以改变体内代谢的途径，更多地合成脂肪而非蛋白质或糖类，从而达到提高油脂含量的目的。然而限制氮源会影响细胞的正常分裂和生长，使细胞活力下降，导致生物量急剧下降，最后总的油脂产量并未提升。现有的方法是，先在氮源充足的条件下快速积累微藻生物量，然后再将微藻从富氮的培养基中分离出来再放入缺氮培养基中，进行条件胁迫，以提高油脂含量。这种方法不适合说明书CN104046567A2/6页4大规模工业生产，因为将微藻从富氮的培养基中分离出来再放入缺氮培养基中过程繁琐且能耗极高。0006。
11、有文献报道，通过控制氮源浓度以同时提高微藻生物量及油脂含量的方法，这些方法只是控制氮源浓度，并非使微藻处于缺氮状态，其不是条件胁迫，而是将培养过程控制在最佳条件下，以同时提高微藻生长速率和油脂含量，这些方法只适用于特定的藻种。0007综上所述，开发既能保证微藻正常生长又能提高其油脂含量，同时适于大规模生产的微藻养殖方法迫在眉睫。发明内容0008本发明的目的之一是提供一种养殖微藻的方法，该方法既能保证微藻的正常生长，又能提高其油脂含量。本发明的目的之二是提供一种养殖微藻的方法，该方法既能保证微藻的正常生长，又能大幅度提高其油脂含量。0009一种养殖微藻的方法，分多次为微藻提供氮肥；至少有一次氮肥。
12、是在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其处于缺氮刺激状态下加入的；养殖时间10天以上。0010优选的情况下，只有在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其处于缺氮刺激状态下，才加入氮肥。0011优选的情况下，至少有一次氮肥是在藻液中的氮肥在被微藻基本或全部消耗完的情况下加入的；更优选的情况下，只有在藻液中的氮肥在被微藻基本或全部消耗完的情况下，才加入氮肥。0012优选的情况下，每次加入的氮肥为微藻12小时的消耗量72小时的消耗量；更优选的情况下，每次加入的氮肥量为微藻12小时的消耗量48小时的消耗量；进一步优选的情况下，每次加入的氮肥量为微藻12小时的消耗量24小时的消耗量。0013优选的情况下，当藻液培养10天。
13、以上并达到采收浓度且藻液中的氮肥被微藻基本或全部消耗完时，再进行采收。0014所述“缺氮刺激状态”具有这样的氮肥浓度，即在其它培养条件适宜的情况下，微藻短期处于该浓度下不至于使其正常生长受到抑制，但长期处于该氮肥浓度下，其生长和繁殖会受到抑制。微藻在这样的氮肥浓度下且能正常生长的状态就是“缺氮刺激状态”。0015所述的氮肥为可被微藻代谢的无机含氮化合物、有机含氮化合物或者二者的混合物，如可选自尿素、铵盐、硝酸盐和氨基酸中的一种或几种。所述的铵盐可选自碳酸氢铵、硫酸铵、氯化铵和磷酸铵中的一种或几种。所述的硝酸盐可以是硝酸钠和/或硝酸钾。0016所述的氮肥优选为尿素和/或碳酸氢铵。0017根据本发。
14、明的方法，在培养微藻的过程中还需要维持微藻正常生长所需要的其它必要条件，如提供合适的光照、温度，以及其它微藻生长所必需的营养成份，调控藻液中的CO2、溶解氧、水、无机盐、必要营养物质、PH值等在合适的范围内，使其适宜微藻的快速生长与繁殖。这些技术是本领域技术人员所熟知的。0018一般地，培养温度为1540，优选为2535；光强为2000200000勒克斯，优选为5000100000勒克斯；在微藻培养过程中通入CO2，并使藻液PH值在610的范围内。0019本发明中，微藻的培养可以采用分级扩大的方式，比如藻种经过1L、5L、50L、说明书CN104046567A3/6页5500L逐级放大培养。接。
15、种的起始浓度一般可以控制在藻液光密度值（OD值）为021的范围内。养殖时间通常在10天以上，优选15天以上，对于产油微藻的培养，养殖时间20天以上可以获得更佳的效果。0020本发明可用于提高微藻的油脂含量，同时又能保证其正常生长，其特别适用于产油微藻的培养，尤其是属于硅藻门、绿藻门或金藻门的微藻，如小球藻、栅藻等。0021本发明还提供了的另一种养殖微藻的方法，分多次为微藻提供氮肥，每次加入的氮肥量为00309MMOL/L,只有在藻液中的氮肥被微藻基本或全部消耗完的情况下，才加入氮肥，养殖时间10天以上；所述微藻为小球藻或栅藻。0022优选的情况下，控制每次氮肥的加入量，使其在72H内被微藻消耗。
16、完；更优选的情况下，控制每次氮肥的加入量，使其在24H内被微藻消耗完。0023所述的氮肥为可被微藻代谢的无机含氮化合物、有机含氮化合物或者二者的混合物，如可选自尿素、铵盐、硝酸盐和氨基酸中的一种或几种。所述的铵盐可选自碳酸氢铵、硫酸铵、氯化铵和磷酸铵中的一种或几种。所述的硝酸盐可以是硝酸钠和/或硝酸钾。0024所述的氮肥优选为尿素和/或碳酸氢铵。0025根据本发明的方法，在培养微藻的过程中还需要维持微藻正常生长所需要的其它必要条件，如提供合适的光照、温度，以及其它微藻生长所必需的营养成份，调控藻液中的CO2、溶解氧、水、无机盐、必要营养物质、PH值等在合适的范围内，使其适宜微藻的快速生长与繁殖。
17、。这些技术是本领域技术人员所熟知的。0026一般地，培养温度1540，优选2535；光强2000200000勒克斯，优选5000100000勒克斯；在微藻培养过程中通入CO2，使藻液PH值在610的范围内。0027本发明中，微藻的培养可以采用分级扩大的方式，比如藻种经过1L、5L、50L、500L逐级放大培养。接种的起始浓度一般可以控制在藻液光密度值（OD值）为021的范围内。养殖时间通常在10天以上，优选15天以上，对于产油微藻的培养，养殖时间20天以上可以获得更佳的效果。0028本发明所述的两种养殖方法中，既可以在氮肥耗光时立即补加氮肥；也可以在氮肥耗光后的一段时间内再加入氮肥，只要不违背。
18、本发明的目的，其同样属于本发明保护的范围。一般情况下，需要在氮肥耗光后的72H内补加氮肥；较佳在氮肥耗光后的48H内补加氮；更佳在氮肥耗光后的24H内补加氮肥。0029本发明还提供了一种生产油脂的方法，包括微藻养殖、微藻采收、微藻油脂的分离和提取，其中，微藻养殖采用上述的两种方法。0030现有技术主要是通过氮胁迫或控制培养条件的方法来同时实现快速积累微藻生物量和提高微藻油脂含量。二者均有较大的局限性，氮胁迫的过程繁琐且能耗极高，而控制培养条件只适用于特定的藻种。本发明人通过大量试验发现，采用“缺氮刺激”的方法，通过微量氮肥的分批加入可以既保证微藻的正常生长，又使其通过本发明所述的不断地缺氮刺激。
19、积累较多的油脂，并且该方法操作简便易行，更适合大规模、低成本、高效率地养殖微藻。此外，本发明还可以避免过量氮肥的使用，养殖废水基本不含N元素、对环境的污染很小。附图说明0031附图1为小球藻生长曲线。说明书CN104046567A4/6页60032附图2为栅藻生长曲线。具体实施方式0033下面以实施例详细说明本发明，但并不因此构成对本发明的限制。0034溶液氮含量的测定0035采用ICS3000型离子色谱仪（美国DIONEX公司）测定水溶液中的NH4与NO3含量，仪器配有EG40淋洗液自动发生器、电导检测器和变色龙色谱工作站；IONPACAS11HC型分离柱（250MM4MMID）；IONPA。
20、CAG11型保护柱（50MM4MMID）；ASRSULTRA阴离子自身抑制器。淋洗液KOH溶液；流速为1MLMIN1；淋洗液浓度30MMOLL1；进样量为60L；柱温为30；抑制电流100MA；外标法峰面积定量。0036藻液光密度值（OD680值）测定0037光密度值用分光光度计测定，以蒸馏水作对照，测定藻液在波长680NM处的吸光值，作为微藻养殖浓度的指标。0038微藻含油量测定0039采用索氏提取器测定，首先将适量藻液离心、干燥，仔细研磨成细粉一确保微藻有效破壁，称量，用滤纸包裹放入提取器中，加入甲醇和三氯甲烷，在90下抽提6小时，将两种混合溶剂烘干，恒重称取遗留下的物质，测得含油量的公式。
21、含油抽提物重（G）/干粉重（G）100。0040微藻的培养基0041培养基成份见表1表2，使用时稀释成1000倍的母液，121高温消毒20MIN后冷却备用。0042表1培养基BG1100430044表2微量元素A5说明书CN104046567A5/6页700450046实施例10047采用两级扩大的基本工艺流程进行小球藻的培养。一级接种培养1L玻璃三角瓶装入约700ML培养液，培养基采用BG11培养基（表1），一级接种培养基采用尿素为氮肥，浓度为03G/L，控制光照和温度适宜，通入2（V/V）的CO2空气混合气进行通气培养，混合气用过滤膜过滤净化。检测藻液的OD值，当藻液OD值达到5以上时可以。
22、进行二级扩大培养。二级扩大培养采用本发明的方法扩大培养在5L玻璃三角瓶中进行，装入34L培养基（培养基母液经高压高温灭菌或煮沸消毒，培养用水采用过滤消毒的自来水），按最终藻液OD值为0306接入上述一级培养的藻种进行培养，以碳酸氢铵为氮肥，添加量为20MG/L,每天测量藻液的NH4含量，若NH4未被消耗完，则等待其消耗完毕在补加碳酸氢铵。以自然光为光源，控制光强度在200030000勒克斯的范围内，室温培养。通入2（V/V）的CO2和空气的混合气进行通气培养，混合气经过滤膜过滤净化。每隔24小时添加20MG/L碳酸氢铵一次，24H后检测不到藻液中NH4，说明碳酸氢铵被基本消耗完。连续培养20天。
23、后收获，其生长曲线见图1。0048实施例20049小球藻的养殖，方法同实例1，不同之处在于添加的氮肥为尿素，添加量为9MG/LD。连续培养20天后收获，其生长曲线见图1。0050实施例30051栅藻的养殖，方法同实例1。连续培养20天后收获，其生长曲线见图2。0052实施例40053栅藻的养殖，方法同实例2。连续培养20天后收获，其生长曲线见图2。0054实施例50055小球藻的养殖，方法同实例2，不同之处在于尿素的添加量为6MG/L。连续培养20天后收获，其生长曲线见图1。0056比较例10057小球藻的养殖，方法同实例2，不同之处在于尿素一次性加入，添加量为02G/L。连续培养20天后收获，其生长曲线见图1。0058比较例20059栅藻的养殖，方法同实例4，不同之处在于尿素一次性加入，添加量为03G/L。连续培养20天后收获，其生长曲线见图2。0060表3试验结果0061说明书CN104046567A6/6页8实例实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5比较例1比较例2油含量34183313204024163421189313030062上表试验结果表明，采用本发明的方法，小球藻和栅藻的正常生长不受影响，而油脂含量均比常规方法有显著提高。说明书CN104046567A1/1页9图1图2说明书附图CN104046567A。