天冬酰胺作为氮的运输形式起着重要作用，在包括氮固定体在内的许多植物中，其为参予将氮由根部转移到蒸腾流中的重要化合物。在植物中，天冬酰胺是在天冬酰胺合成酶ASN（E.C.6.3.5.4）催化下由谷氨酰胺、天冬氨酸和ATP形成的，从而作为付产物生成了谷氨酸、AMP和焦磷酸。 现已发现，可将原核铵依赖性天冬酰胺合成酶ASN-A（E.C.6.3.1.1）引入植物细胞中，得到有许多优点的转基因植物：植物显示出更有效的净光合CO2固定作用、增加了生长速度、加速植物发育、较早开花并增加了绿色质量和植物干重。因此可使作物生长面积扩展到气候较差的地区，并有可能在温带地区以三季耕作代替两季耕作。此外，转基因植物可以耐受谷氨酰胺合成酶（GS）抑制剂如Phosphinothricine（PPT）或methionine sulfoximine（MSX），甚至可在施用这些抑制剂后刺激光合作用和生长。
与高等植物的ASN编码基因（asn基因）相反，大肠杆菌的asnA基因编码不同类型的ASN，后者利用铵，而不是利用谷氨酰胺产生天冬酰胺（Cedar and Schwartz（1969），J.Biol.Chem.，244，4112-4121）。Nakamura等人已分离了该酶的基因并已鉴定了它的特征（Nucleic Acids Research 9，4669-4676（1981））。发现这种原核生物酶在植物中是有活性的，并且在这些转基因植物中打开了一条新的铵同化途径。其可导致植物氮代谢的总体改变。对植物生长和绿色质量产生具有刺激作用。
正常条件下，转化体中GS和ASN-A均利用氨。当黑暗期间经降低ATP，能量供应和镁离子的可利用性而限制了叶绿体GS活性时，这种细菌途径的优点更为明显（O′Neal and Joy'（1974），plant phys.，54，773-779;Joy，（1988），Can.J.Bot.，66，2103-2109）。另外，当用特异性抑制剂如PPT阻滞植物GS时，植物中细菌asn-A基因的表达可得以同化氨。在未转化的植物中，抑制GS活性可淆乱氨利用和铵积聚地主要途径，其为被处理植物之致死现象的关键因素（Tachibana et al.，（1968），J.Pesticide Sci.，11，33-37）。因此，存在细菌酶可减少PPT处理的转基因植物中的氨积聚量，这样不仅能使转基因植物幸免于对野生型植物是致死性的除草剂的剂量，而且对如此处理的转基因植物有生长刺激作用。
本领域内技术人员将会理解到，这些积极效果不仅限于大肠杆菌的asnA基因，因为其他细菌也含有同一基因或具有同样使天冬氨酸和其盐酰胺化以产生天冬酰胺之能力的基因。
因此本发明涉及在植物细胞中使用原核asnA基因、包含编码原核asnA之基因的基因构建物（所说的基因被有效地连接到可影响所说基因在植物细胞内表达的调节序列上）、含有上述基因构建物的载体、用上述基因构建物或载体转化的、并在植物（特别是农作物）内表达原核氨特异性天冬酰胺合成酶的植物细胞、以及含有上文限定之被转化细胞的上述植物的种子或增殖材料。
本发明优选的实施方案包括使用编码上述酶的大肠杆菌asnA基因及编码上述酶的合成基因，特别是包含优先被植物利用之密码子的基因。本发明还包括编码有不同于天然酶之氨基酸组成的酶的基因，通过删除或加入密码子，或置换天然基因中的密码子，导致本发明的基因编码不同的氨基酸序列，但所得酶产物与天然酶有基本相同的催化活性。本领域普通技术人员可以做到的所有这些改动均包括于本发明的范围内。
实施例1
有RUBISCO小亚单位启动子的大肠杆菌asnA基因在烟草中的表达
1.转基因烟草植物的产生
基于大肠杆菌asnA基因的完整核苷酸序列（Nakamura et al.，（1981）Nucleic Acids Research 18，4673，Fig.3），本发明人将质粒PMY114的pstⅠ-HgaⅠ片段再克隆到PUC9中。然后将asnA基因（1.1Kb）连接到豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶（“RUBISCO”，Herrera-Estrella et al.，（1984）Nature 310，115-120）小亚单位基因的启动子上，并将整个片段导入土壤杆菌（Agrobacterium）载体ppCV001（Koncz and Schell，（1986）Mol.Gen.Genet.，204，383-396）中。对SRI烟草植物进行叶园盘转化之后，基于其卡那霉素抗性鉴定转基因植物。从几个转化体中选择出两株显示对1kg/ha PPT处理有耐受力的植物（ASP4，ASP5）。作为这种PPT处理的结果，SRI对照植物完全被杀死，而且从未发现长出有开花和结种能力的植株。ASP4和ASP5转化体只在低级和老化的叶子上出现这些综合征象，而分生组织区域能够克服这种抑制作用。当继续生长之后，这些植物开了花并结了种子。
自花繁殖ASP4和ASP5转基因烟草植物已产生了有抗性和敏感性后代的分离籽苗群体。在使用的体外条件下，当培养基中存在10μM L-PPT时可以明确地区分这两种表型。
还借助Southern DNA杂交法来显示转化体基因组中asnA序列的存在。用EcoRI消化植物DNA后，在被转化的植物中可显示出一杂交片段。在Northern杂交分析中，由从体外生长的ASP5转化体中分离的总RNA中检测出了少量与asnA基因同源的mRNA。
2.降低了转基因烟草植物中氨积聚量
经PPT处理以抑制GS活性后，可使对照组烟草植物叶中的氨浓度迅速增加。用微量扩散法测定氨积聚的速度，然后基于所施用杀草剂的浓度进行奈斯勒比色（Shelp et al.，（1985）Can.J.Bot.63，1135-1140）。
当剂量为0.5Kg/ha时，转基因植物能够抵抗PPT处理的影响（表1）。
表1.喷洒0.5Kg/ha PPT后对照组烟草植物
（SR1）和含asnA基因之转基因植物中氨的积聚量
氨浓度（mM）
小时 SR1 ASP4 ASP5
4 0.58 0.42 0.40
6 1.20 0.82 0.78
24 1.70 0.70 0.75
48 1.95 0.60 0.50
当喷洒1Kg/ha PPT后，将这些植物与SR1烟草植物相比较，也可看出氨积聚量的降低（表2）。所测得的低水平氨可对被转化之植物造成不太显著的损伤。
表2.1Kg/ha PPT对烟草（SR1）和转基因植物（ASP4、ASP5）中氨浓度的影响
氨浓度（mM）
小时 SR1 ASP4 ASP5
6 0.8 0.78 0.88
8 2.2 0.87 0.95
24 4.9 2.0 1.40
48 8.6 4.1 3.6
3.植物生长和发育刺激作用
详细比较对照和ASP植物之间的生长行为，可见存在着显著的差异：转基因植物具有提高的生长速度，但用低剂量PPT处理ASP植物时可出现更为显著的刺激作用。
可用各种形式的生长曲线证明基础及PPT诱导的生长加速作用。图1显示尽管喷洒0.025Kg/ha PPT已抑制了SR1植物的生长，但在两株转化体内却可测出明显的刺激作用。喷洒0.05kg/ha PPT对所有植物都产生消极影响。各点代表这三株植物的平均高度。
如果在温室条件下用Baule Mitscherlich曲线确定植物生长的特性时，也可测出对照和被处理条件下各植物品系之间的差异（图2）。可根据图2所示有特征性α角的曲线斜率查出对生长的抑制和刺激作用。
4.增加了转基因植物的干重
除植物高度的不同之外，还可根据植物干重来检测这种刺激作用。表3所示数据证明asnA转化体有较高的生产量。
表3.对照（SR1）和转化株植物（ASP4、ASP5）的最后干重（gr）
处理
品系 对照 0.025kg/ha PPT
SR1 3.19 100% 2.76 100%
ASP4 3.85 120% 4.79 173%
ASP5 3.74 117% 5.05 183%
实施例Ⅱ
转基因植物中CaMV35S启动子启动asnA的作用
作为一种可选用的研究手段，本发明人用直接DNA摄入法（R.X.Fang et al.，（1989）The Plant Cell，1，141-150）将携带含CaMV35S启动子之大肠杆菌asnA基因的质粒分子（PUc）导入SR1叶原生质体中。基于PPT抗性直接选择转化体。在10μm L-PPT存在下，由微小愈伤组织再生成植株。对得自PPT抗性再生株的DNA进行Southern杂交分析，进一步证明asnA基因的存在。
2.降低了转基因植物中的氨积聚量并改善了对PPT的耐受力
自花繁殖再生的转化株后，产生了有不同PPT抗性水平的分离后代（培养基内添加高达30μM的L-PPT）。
与抗性表型相符，当喷洒1kg/ha PPT时，被转化的植物比SR1植物积聚较少的氨（表4）。
表4.植物喷洒1kg/ha PPT后的氨积聚量
氨浓度（mM）
小时 SR1 ASP70 ASP95
6 6.85 2.92 1.95
24 9.50 5.60 5.10
48 22.3 13.60 17.40
120 58.60 28.30 35.6
144 113.00 39.40 50.00
3.光合作用的效率
根据光合作用的各种参数，如CO2固定速率（Szajko et al.，1971，Acta Agr.Acad.Hung.，20，247-260）和荧光诱导作用（Hideg et al.，1986，Photobiochem.Photobiophys.，12，221-230）来鉴定对照组SR1和转基因烟草植物的特性。在温室条件下，用不同剂量的PPT处理植物并测定氨含量。如表5所示，与对照组植物相比，含ASN-A基因的转基因植物显著地提高了净CO2固定作用的效率。应用低剂量PPT处理，可进一步刺激CO2固定，同时用或不同PPT处理（50g/ha）的SR1植物间的差异并没有统计学上的显著性。表5所示数据还提供了这样的证据，即对于烟草植物来说，抑制性PPT浓度可引起铵积聚，并通过抑制电子传递和使CO2固定作用降低50%而对光合作用造成严重损害。但在同一条件下，转基因植物则可以耐受这种处理对光合功能的影响。
4.asnA转化株植物的生长行为
对植物生长速率（mm/天）的重复分析显示在植物早期发育阶段加速了转化株的生长。表6中所示数据为温室中的植物生长速率。
在田间条件下对这些植物所作分析与上述温室条件下观察到的差异相似（表7）。在生长的Ⅰ-Ⅲ阶段，Asp植物生长速率明显高于SR1植物。这一实验也进一步证实了PPT对转基因植物的生长刺激作用，特别是在最后的生长阶段。Baule-Mitscherlich曲线（图3）清楚地表明，在田间生长期间，Asp植物表现得比对照组SR1植物生长更快。
5.asnA转化株的生产能力
如表8所示，与SR1植物相比Asp植物的总绿色质量及干重得以增加。还可看出，PPT处理后明显地刺激了转基因植物。同时喷洒PPT则抑制了对照组SR1植物。