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1、10申请公布号CN104046587A43申请公布日20140917CN104046587A21申请号201310076323422申请日20130311C12N5/071201001C12N5/077201001C12N5/079201001C12N11/1020060171申请人中国科学院大连化学物理研究所地址116023辽宁省大连市中山路457号72发明人马小军刘洋王淑君孙广炜74专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人马驰54发明名称一种调控干细胞体外三维定向分化的方法57摘要本发明涉及再生医学领域，是一种调控干细胞体外三维定向分化的方法。本发明将干细胞包埋在含有硫酸软。
2、骨素的海藻酸钙微胶珠中，添加诱导分化培养液，通过改变制备微胶珠时海藻酸钠和硫酸软骨素的质量比调控干细胞体外定向分化，并且在分化结束后，可利用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，进而得到纯净的分化细胞。本发明操作简单，成本低，含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠可以模拟体内三维细胞外基质，为干细胞提供近似体内的三维定向分化微环境，从而提高干细胞的定向分化效率和生物学功能，本发明将在再生医学应用中发挥重要作用。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图3页10申请公布号CN104046587ACN104046587A1/1页21。
3、一种调控干细胞体外三维定向分化的方法，其特征在于将干细胞包埋在含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠中，添加诱导分化培养液，通过改变制备微胶珠时海藻酸钠和硫酸软骨素的质量比调控干细胞体外定向分化，并且在分化结束后，可利用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，进而得到纯净的分化细胞。2按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述干细胞包括胚胎干细胞、IPS细胞、间充质干细胞、神经干细胞、虹膜色素上皮细胞、羊膜上皮细胞、或造血干细胞。3按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠为由含海藻酸钠和硫酸软骨素的溶液经过钙液钙化所制备，此溶液溶剂为生理盐水；采用海藻酸钠浓度为034W/V，采用硫。
4、酸软骨素溶液浓度为0510W/V，海藻酸钠和硫酸软骨素的质量比为120；含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠直径为2002000M；海藻酸钠的分子量为1001000KDA，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例（GM比）范围为023，且海藻酸钠为未修饰海藻酸钠、精氨酰甘氨酰天冬氨酸（RGD）修饰海藻酸钠、异亮氨酸赖氨酸缬氨酸丙氨酸缬氨酸（IKVAV）修饰海藻酸钠、酪氨酸异亮氨酸甘氨酸丝氨酸精氨酸（YIGSR）修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠；硫酸软骨素平均分子量为240KDA。4按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述定向分化包括干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨或脂肪细胞定向分化。5按照权利要求1。
5、所述的方法，其特征在于所述定向分化所使用的培养容器为静态培养体系或生物反应器；静态培养体系指使用培养瓶、培养板、培养皿、或培养袋培养；生物反应器包括旋转式反应器、灌注式反应器、搅拌式反应器、或气升式反应器。权利要求书CN104046587A1/3页3一种调控干细胞体外三维定向分化的方法技术领域0001本发明涉及再生医学领域，是一种调控干细胞体外三维定向分化的方法。背景技术0002干细胞由于具有自我更新和分化的能力，是损伤组织修复的理想种子细胞。但是当干细胞植入体内受损部位后，干细胞除了分化为所需要的组织细胞，参与组织修复，同时也分化为其它类型的细胞，甚至具有较高的致瘤性。对干细胞进行体外预分化。
6、，使之在移植之前预先分化为成熟的组织细胞或前体细胞，能够提高定向分化效率，减低干细胞在体内向其它类型细胞分化的能力，从而提高组织修复效果，并降低致瘤风险。0003在体内细胞生长在细胞外基质所构成的三维网络中，研究表明体外二维培养条件下的细胞逐渐丢失了其表型和功能，而体外三维培养有利于细胞的功能维持，能够模拟体内特异组织细胞微环境，更好地促进干细胞体外的定向分化。目前，调控干细胞体外定向分化的三维体系，采用了脱细胞支架、胶原支架、或聚乳酸支架等，这些支架有的具有较高免疫原性，有的缺乏促分化的特殊细胞外基质成分，有的降解产物不利于细胞培养以及组织修复，这导致了干细胞体外定向分化效率低，获得细胞不具。
7、有体内正常生理功能等问题。0004由于现有诱导分化体系存在上述缺陷，严重限制了干细胞体外定向分化技术的进一步发展与临床应用，因此急需研发便捷实用的诱导干细胞三维分化的新方法，即通过利用三维培养以及添加基质成分来构建能够模拟体内组织的微环境，以实现体外对干细胞定向预分化的调控，进一步促进干细胞在再生医学领域的应用。发明内容0005本发明的目的在于提供一种调控干细胞体外三维定向分化的方法，即利用含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠实现对干细胞体外定向分化的调控。0006为实现上述目的，本发明采用的技术方案为0007本发明将干细胞包埋在含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠中，添加诱导分化培养液，通过改变制备微胶。
8、珠时海藻酸钠和硫酸软骨素的质量比调控干细胞体外定向分化，并且在分化结束后，可利用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，进而得到纯净的分化细胞。0008所述干细胞包括胚胎干细胞、IPS细胞、间充质干细胞、神经干细胞、虹膜色素上皮细胞、羊膜上皮细胞、或造血干细胞。0009所述含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠为由含海藻酸钠和硫酸软骨素的溶液经过钙液钙化所制备，此溶液溶剂为生理盐水，海藻酸钠浓度为034W/V，硫酸软骨素溶液浓度为0510W/V，海藻酸钠和硫酸软骨素的质量比为120；0010含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠直径为2002000M；0011海藻酸钠的分子量为1001000KDA，古罗糖醛酸和甘露糖。
9、醛酸比例（GM比）范围为023，且海藻酸钠为未修饰海藻酸钠、精氨酰甘氨酰天冬氨酸（RGD）修饰海藻酸钠、异亮氨酸赖氨酸缬氨酸丙氨酸缬氨酸（IKVAV）修饰海藻酸钠、酪氨酸异亮氨酸甘说明书CN104046587A2/3页4氨酸丝氨酸精氨酸（YIGSR）修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠；0012硫酸软骨素平均分子量为240KDA；0013所述定向分化包括干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨或脂肪细胞定向分化。0014所述定向分化所使用的培养容器为静态培养体系或生物反应器；0015静态培养体系指使用培养瓶、培养板、培养皿、或培养袋培养；0016生物反应器包括旋转式反应器、灌注式反应器、搅拌。
10、式反应器、或气升式反应器。0017本发明具有如下优点00181操作简单，成本低。本发明利用含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠对干细胞体外定向分化进行调控，方法简单，避免使用昂贵材料和工艺；00192模拟体内特异组织分化微环境，提高干细胞分化效率和功能。三维海藻酸钙微胶珠为干细胞提供了三维生长环境，并且硫酸软骨素的添加进一步模拟了体内组织的细胞外基质成分，因此本发明能够在近似于体内特异组织微环境的条件下诱导干细胞分化，其诱导效率和细胞功能进一步提高；00204高活性收集分化细胞。在分化结束后，利用柠檬酸钠溶液溶解微胶珠，通过离心可在生理条件下收集分化的细胞，细胞活性高，功能不受影响；00215应用范。
11、围广。本发明方法可促进干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨或脂肪细胞定向分化，并可放大培养规模，具有临床应用前景。附图说明0022图1为本发明的示意图培养容器1，含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠2，干细胞3；0023图2为含有20W/V硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠中细胞的软骨特异性染色；0024图3为不同硫酸软骨素质量百分比的海藻酸钙微胶珠中细胞型胶原基因表达；0025图4为海藻酸钙微胶珠调控间充质干细胞定向分化为神经前体细胞图4A为NESTIN基因相对表达；图4B为NESTIN阳性细胞百分比。具体实施方式0026实施例1三维诱导体系调控人间充质干细胞体外向软骨细胞定向分化0027将海藻酸钠分。
12、子量430KDA，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比15粉末溶解于生理盐水中，得到3W/V,G/ML的溶液。将硫酸软骨素平均分子量20KDA粉末溶解于生理盐水中，得到5W/V,G/ML的溶液。将3W/V,G/ML海藻酸钠、5W/V,G/ML硫酸软骨素溶液以及生理盐水混合，得到海藻酸钠终浓度均为2W/V,G/ML，海藻酸钠/硫酸软骨素质量比分别为15、4以及9的混合溶液。将第5代人脐带间充质干细胞与该混合溶液混合，调整细胞密度为6106CELLSML1，将该细胞悬液经过注射器泵滴入100MMOLL1CACL2溶液中钙化30MIN，得到包埋有干细胞的海藻酸钙微胶珠，再添加含有107MOLL1地塞米松、1胎牛。
13、血清、1ITS、40MGML1L脯氨酸、50MGML1维生素C和100MGML1丙酮酸钠的高糖DMEM培养液（含4500MLL1葡萄糖）进行软骨诱导3周。之后，使用55MMOLL1柠檬酸钠溶液浸泡微胶珠10MIN，溶解微胶珠，离心收获软骨分化细胞，利用甲苯胺蓝进行软说明书CN104046587A3/3页5骨细胞的特异性染色，并分析从不同硫酸软骨素含量微胶珠中获得的软骨细胞型胶原的基因表达水平。实验结果见图2和3，结果显示，经过三维诱导干细胞分化为软骨细胞，型胶原基因表达随硫酸软骨素含量的增加而提高，说明此三维诱导体系可调控干细胞的软骨分化。0028实施例2三维诱导体系调控人间充质干细胞体外向神。
14、经前体细胞定向分化0029首先，制备精氨酰甘氨酰天冬氨酸RGD修饰的海藻酸钠。将海藻酸钠分子量500KDA，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比2溶解于含有05MNACL的01M2N吗啉代乙磺酸MES缓冲液中PH值65，得到1W/V,G/ML海藻酸钠溶液。再加入13二甲氨基丙基3乙基碳二亚胺EDC，N羟基硫代琥珀酰亚胺SULFONHS和RGD多肽，室温搅拌反应24小时。EDC和海藻酸钠摩尔比为120，EDC和SULFONHS摩尔比为21，RGD多肽和海藻酸钠质量比为11000。然后进行透析并冷冻干燥，从而得到RGD修饰的海藻酸钠。0030将RGD修饰海藻酸钠粉末溶解于生理盐水中，得到3W/V,G/ML的溶。
15、液。将硫酸软骨素平均分子量20KDA粉末溶解于生理盐水中，得到5W/V,G/ML的溶液。将3W/V,G/MLRGD修饰海藻酸钠、5W/V,G/ML硫酸软骨素溶液以及生理盐水混合，得到海藻酸钠终浓度均为15W/V,G/ML，海藻酸钠/硫酸软骨素质量比分别为15、4以及9的混合溶液。将第4代人脐带间充质干细胞与该混合溶液混合，调整细胞密度为4106CELLSML1，将该细胞悬液经过注射器泵滴入100MMOLL1CACL2溶液中钙化30MIN，得到包埋有干细胞的海藻酸钙微胶珠，再添加含有10NGL1上皮生长因子EGF和10NGL1碱性成纤维生长因子BFGF的RPMI1640培养液进行神经诱导1周。之后，使用55MMOLL1柠檬酸钠溶液浸泡微胶珠10MIN，溶解微胶珠，离心收获神经分化细胞，利用REALTIMEPCR分析从不同硫酸软骨素含量微胶珠中获得的神经细胞的NESTIN相对基因表达，并利用荧光染色获得各个条件下NESTIN阳性细胞的百分比。实验结果见图4，结果显示，经过三维诱导，NESTIN基因以及阳性细胞百分比随硫酸软骨素含量的增加而提高，说明此三维诱导体系可调控干细胞向神经前体细胞分化。说明书CN104046587A1/3页6图1图2说明书附图CN104046587A2/3页7图3图4A说明书附图CN104046587A3/3页8图4B说明书附图CN104046587A。