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1、(10)申请公布号 CN 104334275 A (43)申请公布日 2015.02.04 C N 1 0 4 3 3 4 2 7 5 A (21)申请号 201380023088.2 (22)申请日 2013.03.15 61/612,008 2012.03.16 US 61/612,005 2012.03.16 US 61/612,087 2012.03.16 US 61/723,759 2012.11.07 US 61/723,738 2012.11.07 US 61/723,658 2012.11.07 US B01L 3/02(2006.01) (71)申请人生命技术公司 地址美国加。
2、利福尼亚州 (72)发明人迈克尔C帕拉斯 詹姆士讷尔斯 加里利姆 西奥多斯特劳博 埃文福斯特 (74)专利代理机构北京英赛嘉华知识产权代理 有限责任公司 11204 代理人王达佐 洪欣 (54) 发明名称 加载液体样品的系统和方法 (57) 摘要 提供了将液体样品加载至基底内的多个反应 位点的样品加载器。所述样品加载器包括第一刮 片，和与第一刮片结合的第二刮片。所述样品加载 器还包括第一刮片和第二刮片之间的流道，其被 配置用于将液体样品分配至包含多个反应位点的 基底。而且，在各种实施方案中，所述液体样品与 所述第一和第二刮片具有85+/-15度的前进接触 角。此外，可基于毛细管作用将从流道分配。
3、的液体 样品加载至所述多个反应位点。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.10.31 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2013/032107 2013.03.15 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/138724 EN 2013.09.19 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书14页 附图20页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书14页 附图20页 (10)申请公布号 CN 104334275 A CN 104334275 A 1/2页 2 1.用于将液体样品加载至基底内的多个反。
4、应位点的样品加载器，所述样品加载器包 括： 第一刮片； 第二刮片，其中所述第一刮片与第二刮片结合； 所述第一刮片和所述第二刮片之间的流道，其被配置用于将液体样品分配至基底，其 中所述基底包含多个反应位点。 2.如权利要求1所述的样品加载器，还包括： 与所述流道流体连通的储液器，其中所述储液器被配置用于接纳待加载至反应位点的 阵列中的存放的液体样品。 3.如权利要求1所述的样品加载器，其中所述第一和第二刮片由以下物质中的一种组 成：聚烯烃、聚氨酯和硅氧烷。 4.如权利要求1所述的样品加载器，其中所述第一和第二刮片一起呈锥形而形成尖 端，其中在所述尖端处所述第一刮片和所述第二刮片之间的距离小于10。
5、0m。 5.如权利要求1所述的样品加载器，其中所述第一和第二刮片接触所述基底以从所述 流道分配液体样品。 6.如权利要求1所述的样品加载器，其中所述液体样品与所述第一和第二刮片具有 85+/-15度的前进接触角。 7.如权利要求1所述的样品加载器，其中基于毛细管作用将从所述流道分配的液体样 品加载至所述多个反应位点。 8.如权利要求1所述的样品加载器，其中前进接触角和后退接触角之间的滞后为0-30 度。 9.将液体样品加载至基底中的多个反应位点的方法，所述方法包括： 将液体样品存放于样品加载器的储液器中； 使所述样品加载器与包含多个反应位点的基底接触；以及 在所述多个反应位点上方横向移动所述样。
6、品加载器，同时使所述样品加载器与所述基 底接触，以便将液体样品置于所述多个反应位点上。 10.如权利要求9所述的方法，其中一定量的液体样品通过毛细管作用被吸入至每个 反应位点中。 11.如权利要求9所述的方法，其中所述样品加载器包括第一刮片和第二刮片，且所述 第一和第二刮片被配置用于将所述第一和第二刮片之间的液体样品放至所述多个反应位 点。 12.如权利要求9所述的方法，其中所述液体样品与样品加载器具有85+/-15度的前进 接触角。 13.如权利要求9所述的方法，其中前进接触角和后退接触角之间的滞后为0-30度。 14.如权利要求9所述的方法，其中所述样品加载器由以下材料中的一种组成：聚烯 。
7、烃、聚氨酯和硅氧烷。 15.如权利要求9所述的方法，其中所述液体样品从所述储液器流经所述第一和第二 刮片之间的流道后被放至所述基底。 16.如权利要求9所述的方法，其中所述基底和所述多个反应位点的表面为亲水性的。 权 利 要 求 书CN 104334275 A 2/2页 3 17.将多个液体样品加载至基底的装置，所述装置包括： 盒子； 所述盒子内的静止性容积，其中所述静止性容积被配置用于接纳包括基底和加载有多 个液体样品的多个反应位点的芯片；和 导液漏斗，其被配置为与所述盒子成连续关系，其中所述导液漏斗被配置为在所述芯 片通过所述导液漏斗时，通过接触所述芯片而有助于将所述多个液体样品加载至所述。
8、多个 反应位点中。 18.如权利要求17所述的装置，其中所述静止性容积包括封装介质。 19.如权利要求18所述的装置，其中所述封装介质被配置用于将所述多个液体样品的 蒸发减至最小。 20.如权利要求18所述的装置，其中所述封装介质被配置用于将所述静止性容积内的 所述芯片周围的气泡减至最小。 21.如权利要求18所述的装置，其中所述封装介质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，其中所 述PDMS不是完全交联的。 22.如权利要求21所述的装置，其中所述PDMS已完全固化。 23.如权利要求21所述的装置，其中所述PDMS包含0.8wt的交联剂。 24.如权利要求18所述的装置，其中所述封装介质被配置为允。
9、许在进行生物反应后从 所述芯片中取出所述多个样品中的至少一个。 25.如权利要求17所述的装置，其中所述导液漏斗为疏水性的。 26.如权利要求17所述的装置，其中所述多个液体样品被加载至包含在所述基底中的 多个通孔中。 27.如权利要求17所述的装置，其中所述多个通孔各自具有约1纳升的容积。 28.将多个液体样品加载至基底的方法，所述方法包括： 将液体样品放置于导液漏斗中； 将芯片插入至所述导液漏斗中，其中所述芯片包括基底和多个反应位点，其中所述导 液漏斗被配置为既接触所述芯片又允许所述芯片通过所述导液漏斗；和 使所述芯片通过所述导液漏斗，以将放置于所述导液漏斗中的液体样品加载至所述多 个反应。
10、位点，其中所述导液漏斗与所述芯片的接触有助于加载液体样品。 29.如权利要求28所述的方法，还包括： 将所述芯片送至所述静止性容积中，其中所述基底静止性容积包括封装介质。 30.如权利要求28所述的方法，其中所述多个反应位点中的至少一些为约1纳升。 31.如权利要求28所述的方法，其中所述芯片包含至少30,000个反应位点。 32.如权利要求28所述的方法，其中至少80的所述多个反应位点加载有所述液体样 品。 33.如权利要求29所述的方法，其中所述封装介质被预装载至所述静止性容积中。 权 利 要 求 书CN 104334275 A 1/14页 4 加载液体样品的系统和方法 0001 相关申请。
11、的交叉引用 0002 本申请要求2012年3月16日递交的美国临时专利申请第61/612,005号、2012年 3月16日递交的美国临时专利申请第61/612,087号、2012年11月7日递交的美国临时 专利申请第61/723,759号、2012年3月16日递交的美国临时专利申请第61/612,008号、 2012年11月7日递交的美国临时专利申请第61/723,658号和2012年11月7日递交的美 国临时专利申请第61/723,738号的优先权，所有以上申请均通过引用整体并入本文。 0003 发明背景 0004 聚合酶链式反应(PCR)是扩增靶DNA序列的方法。以前，PCR通常在96孔或。
12、384 孔微板中进行。如果期望更高的通量，微板中的常规PCR方法则不具成本效益或高效性。另 一方面，减少PCR反应体积可降低试剂的消耗，并可从反应体积的热质减少而减少扩增次 数。该策略可在阵列格式(m x n)中实施，产生大量的较小反应体积。此外，采用阵列允许 进行具有增加的定量灵敏度、动态范围和特异性的可扩展高通量分析。 0005 阵列格式也被用于进行数字聚合酶链式反应(dPCR)。来自dPCR的结果可用于检 测和定量稀有等位基因的浓度，以提供核酸样品的绝对定量，并测量在核酸浓度的低倍数 变化。通常，增加重复数可增加dPCR结果的精确度和再现性。 0006 大多数定量聚合酶链式反应(qPCR。
13、)平台中的阵列格式被设计用于根据样品的分 析(sample-by-assay)的实验，其中PCR结果需要为可寻址的以用于运行后分析。然而，对 于dPCR，每个PCR结果的具体位置或小井可能是不重要的，且可仅分析每个样品的阳性和 阴性重复的数目。 0007 在dPCR中，可将含有相对少量靶多核苷酸或核苷酸序列的溶液再分为大量的小 测试样品，从而每个样品通常含有一个所述靶核苷酸序列分子或者没有靶核苷酸序列。当 这些样品随后在PCR方案、程序或实验中进行热循环时，含有所述靶核苷酸序列的样品被 扩增并产生阳性检测信号，而不含靶核苷酸序列的样品则不被扩增且不产生检测信号。 0008 对于如上所述的应用，。
14、持续降低反应体积可导致例如对涉及将样品体积加载至阵 列并维持所述样品体积的物理分离的置信度的挑战。换句话说，将样品体积加载至尽可能 多的小井或通孔并减少小井或通孔之间的交叉串扰非常重要。 0009 发明概述 0010 根据本文描述的各种实施方案，提供了用于将液体样品加载至基底内的多个反应 位点的样品加载器。所述样品加载器包括第一刮片，和与第一刮片结合的第二刮片。所述 样品加载器还包括第一刮片和第二刮片之间的流道，其被配置为将液体样品分配至包含多 个反应位点的基底。而且，在各种实施方案中，所述液体样品与所述第一和第二刮片具有 85+/-15度的前进接触角。此外，可基于毛细管作用将从流道分配的液体。
15、样品加载至所述多 个反应位点。 0011 在本文描述的其他实施方案中，包括将液体样品加载至基底中的多个反应位点的 方法。所述方法包括将液体样品存储在样品加载器的储液器中。然后将样品加载器与包含 多个反应位点的基底接触。所述方法还包括在所述多个反应位点上方横向移动样品加载 说 明 书CN 104334275 A 2/14页 5 器，同时使样品加载器与所述基底接触，以便将液体样品置于所述多个反应位点上。 附图说明 0012 图1A显示了根据本文描述的各种实施方案，在基底中的示例性阵列； 0013 图IB显示了根据本文描述的各种实施方案的基底中的阵列的剖视图； 0014 图2显示了根据本文描述的各种。
16、实施方案，将样品体积加载至阵列中； 0015 图3A为根据本文描述的各种实施方案，用于加载液体样品至阵列中的盒子； 0016 图3B为根据本文描述的各种实施方案，用于以包含阵列的插入的基底加载液体 样品的盒子的示例性视图； 0017 图3C为根据本文描述的各种实施方案，用于以包含阵列的插入的基底加载液体 样品的盒子的另一示例性视图； 0018 图4显示了根据本文描述的各种实施方案，加载液体样品至阵列中的示例性方 法； 0019 图5A显示了根据本文描述的各种实施方案，用于加载液体样品的盒子的示例性 组件； 0020 图5B显示了根据本文描述的实施方案，用于加载液体样品的盒子的阵列托架部 分； 。
17、0021 图5C显示了根据本文描述的各种实施方案，用于加载样品的组合的盒子； 0022 图6显示了根据本文教导的各种实施方案，用于加载液体样品至阵列中的一种示 例性盒子； 0023 图7显示了根据本文教导的各种实施方案，用于加载液体样品至阵列中的另一示 例性盒子； 0024 图8A显示了根据本文教导的各种实施方案，用于加载液体样品至阵列中的又一 示例性盒子； 0025 图8B显示了根据本文教导的各种实施方案的、图8A所示的用于加载液体样品至 阵列中的示例性盒子的另一视图； 0026 图9A显示了根据本文教导的各种实施方案的示例性导液漏斗的一个视图； 0027 图9B显示了根据本文教导的各种实施。
18、方案的、图8A所示的示例性导液漏斗的横 截面图； 0028 图10显示了根据本文教导的各种实施方案，用于加载多于一个样品的示例性芯 片； 0029 图11显示了根据本文教导的各种实施方案的加载装置； 0030 图12显示了根据本文教导的各种实施方案的另一加载装置； 0031 图13显示了根据本文教导的各种实施方案的样品加载器； 0032 图14A显示了根据本文教导的各种实施方案的样品加载器的侧视图； 0033 图14B显示了根据本文教导的各种实施方案的样品加载器尖端的视图； 0034 图15显示了根据本文教导的各种实施方案的另一样品加载器； 0035 图16显示了根据本文教导的各种实施方案的另。
19、一加载装置； 0036 图17显示了根据本文教导的各种实施方案的另一加载装置； 说 明 书CN 104334275 A 3/14页 6 0037 图18A-18C显示了根据本文教导的各种实施方案的载样方法； 0038 图19A-19B显示了根据本文教导的各种实施方案的封盒方法； 0039 图20显示了根据本文教导的各种实施方案的后退和前进接触角； 0040 图21显示了根据本文教导的各种实施方案，通过样品加载器加载反应位点； 0041 图22的方框图显示了可用于实施本文教导的实施方案的聚合酶链式反应(PCR) 仪；和 0042 图23显示了根据本文描述的各种实施方案加载的样品的热循环结果。 0。
20、043 发明详述 0044 为了提供对本发明更充分的理解，以下描述列举了很多具体细节如具体结构、参 数、实例等。然而，应认识到这样的描述并非旨在限制本发明的范围，而是旨在提供对示例 性实施方案的更好描述。 0045 本发明涉及将样品、样品体积或反应体积加载至基底中的阵列的方法和系统，且 更具体地，涉及将样品加载至基底中单个反应位点的阵列中。 0046 在各种实施方案中，包括用于将样品加载至物件中的装置、仪器、系统和方法，所 述物件用于检测大量小体积样品中的靶标。这些靶标可为任何合适的生物学靶标，包括但 不限于，DNA序列(包括无细胞DNA)、RNA序列、基因、寡核苷酸、分子、蛋白、生物标记物、。
21、细 胞(例如，循环肿瘤细胞)或任何其他合适的靶标生物分子。在各种实施方案中，这类生物 学组分可结合各种PCR、qPCR和/或dPCR方法和系统用于一些应用如胎儿诊断、多重dPCR、 病毒检测和定量标准、基因分型、测序校验、突变检测、遗传改良的生物的检测、稀有基因的 检测和拷贝数变化。 0047 尽管处理大量样品时通常可适用定量聚合酶链式反应(qPCR)，但应认识到任何合 适的PCR方法均可用于本文描述的各种实施方案。合适的PCR方法包括但不限于，例如数 字PCR、等位基因特异性PCR、非对称PCR、连接介导的PCR、多重PCR、巢式PCR、qPCR、Cast PCR、基因组步移和桥式PCR。 。
22、0048 如下文所述，根据本文描述的各种实施方案，反应位点可包括但不限于，例如通 孔、样品保留区、小井、凹口、点、腔和反应室。 0049 此外，如本文所用，热循环可包括例如，采用热循环仪、等温扩增、热转换、红外线 介导的热循环或依赖解旋酶的扩增。在一些实施方案中，所述芯片可整合有嵌入式加热元 件。在各种实施方案中，所述芯片可整合有半导体。 0050 根据各种实施方案，靶标的检测可为，但不限于，例如单独或组合的荧光检测、正 负离子检测、pH检测、电压检测或电流检测。 0051 本文描述的各种实施方案尤其适用于数字PCR(dPCR)。在数字PCR中，含有相对少 量靶多核苷酸或核苷酸序列的溶液可再分。
23、为大量小测试样品，从而每个样品通常含有一个 分子的靶核苷酸序列或没有所述靶核苷酸序列。当这些样品随后在PCR方案、程序或实验 中进行热循环时，含有所述靶核苷酸序列的样品被扩增并产生阳性检测信号，而不含靶核 苷酸序列的样品则不被扩增且不产生检测信号。采用泊松(Poisson)统计，可将初始溶液 中靶标核苷酸序列的数目与产生阳性检测信号的样品数目相关联。 0052 在根据本文描述的实施方案的芯片上进行的示例性dPCR结果如图23所示。 0053 为了实施典型的dPCR方案、程序或实验，有利的是能够将初始样品溶液以简单且 说 明 书CN 104334275 A 4/14页 7 低成本的方式分为成千上。
24、万个或数十万个测试样品，每个样品具有几纳升、1纳升或约1纳 升，或者小于1纳升的体积。由于靶核苷酸序列的数目可能很少，在这种情况下也很重要的 是初始溶液的全部内含物均被计数且被接纳到所述多个反应位点中。 0054 本文描述的实施方案，通过将初始样品溶液分配至多个反应位点中，以能计数所 有或基本上所有样品溶液的方式，解决了这些和其他的dPCR设计局限。 0055 对于高通量PCR分析和dPCR方法，可实施用阵列格式来减少液体样品的反应体积 同时增加同一时间进行的反应数目的策略。液体样品的反应体积的阵列可在基底的多个反 应位点中。根据本文描述的各种实施方案，反应位点可为，但不限于，通孔、小井、凹口。
25、、点、 腔、反应室或可容纳样品的任何结构。在一些实施方案中，所述通孔或小井可为直径上呈锥 形的。 0056 减少液体样品的反应体积可允许更高密度的反应体积，从而可在给定的区域内进 行更多的反应。例如，基底上由300m直径的通孔组成的反应位点阵列可容纳约30nL的 反应体积。例如，通过将阵列中每个通孔的大小降低至直径60-70m，每个反应体积可为 100pL的液体样品。根据本文描述的各种实施方案，反应体积的范围可为约1pL至30nL的 液体样品。在一些实施方案中，反应位点阵列可由各种不同体积的反应位点组成以增加动 态范围。此外，可通过采用对液体样品进行多于一次的稀释来增加动态范围。 0057 图。
26、1A显示了根据本文描述的各种实施方案的包含阵列的芯片100。芯片100可称 为例如物件、装置、阵列、滑片(slide)或压板。芯片100包括基底110和反应位点的阵列 120。基底110可为各种材料，包括但不限于，例如金属、玻璃、陶瓷和硅。阵列120包括多 个反应位点104。所述多个反应位点104可为例如通孔、小井、凹口、点、腔或反应室。每个 反应位点也可具有多种横截面几何形状，例如圆形、三角形或六边形。具有其他几何形状可 允许更紧密地装填反应位点，以进一步增加在给定区域中的反应数目。 0058 图1B说明了根据各种实施方案的反应位点104的阵列的横截面图。芯片100具 有第一表面112和第二。
27、表面114。每个反应位点104从第一表面112的开口延伸至第二表 面114的开口。反应位点104可被配置用于通过毛细管作用提供足够的表面张力以容纳待 处理或检测的各个含有生物样品的液体样品。芯片100可具有如以下任一专利中所公开的 通用形式或结构：美国专利第6,306,578、7,332,271、7,604,983、7,682,565、6,387,331或 6,893,877号，其通过引用整体并入本文，如同其在本文被完整陈述。在图1B所示的实例 中，所述反应位点为通孔。 0059 在各种实施方案中，第一表面112和第二表面114包含亲水材料，且反应位点104 的表面包含亲水材料。在这些实施方案。
28、中，毛细管作用有助于将液体样品加载至反应位点。 而且，毛细管作用将液体样品保留在反应位点中。 0060 在各种实施方案中，第一表面112和第二表面114包含疏水材料，且反应位点104 的表面包含疏水材料。在这些实施方案中，毛细管作用有助于将液体样品加载至反应位点。 而且，毛细管作用将液体样品保留在反应位点中。 0061 在一些实施方案中，反应位点104的表面包含亲水材料，而第一表面112和第二表 面114包含疏水材料。以这种方式，有助于将液体样品加载至反应位点104，因为所述液体 样品倾向于亲水表面。而且，使得加载至反应位点104中的液体样品之间的交叉污染或串 扰最小化。这类亲水区的阵列可在疏。
29、水表面上包含亲水岛，且可采用各种精密加工技术，包 说 明 书CN 104334275 A 5/14页 8 括但不限于，沉积法、等离子体、掩蔽法、转移印刷、网版印刷、合模法(spotting)等在基底 102上形成。 0062 在所示的实施方案中，基底110具有的第一表面112和第二表面114之间的厚度 为300微米，从而每个反应位点104具有约1.3纳升的体积。可选择地，通过例如减小反应 位点104的直径和/或基底102的厚度，每个反应位点的体积可为小于1.3纳升。 0063 因此，每个反应位点具有的体积可小于或等于1纳升、小于或等于100皮升、小于 或等于30皮升，或者小于或等于10皮升。在。
30、其他实施方案中，一些或所有反应位点的体积 的范围为1-20纳升。根据各种实施方案，所述多个反应位点可包括一系列的不同体积以增 加动态范围。 0064 在某些实施方案中，反应位点104的密度可为至少100个反应位点/平方毫米。在 其他实施方案中，可具有更高密度的反应位点。例如，芯片100内反应位点104的密度可为 大于或等于150个反应位点/平方毫米、大于或等于200个反应位点/平方毫米、大于或等 于500个反应位点/平方毫米、大于或等于1,000个反应位点/平方毫米，或者大于或等于 10,000个反应位点/平方毫米。 0065 在某些实施方案中，通孔的密度可为至少100个反应位点/平方毫米。在。
31、其他实 施方案中，可具有更高密度的通孔。例如，芯片100内通孔的密度可为大于或等于150个通 孔/平方毫米、大于或等于200个通孔/平方毫米、大于或等于500个通孔/平方毫米、大 于或等于1,000个通孔/平方毫米，或者大于或等于10,000个通孔/平方毫米。 0066 芯片100的其他实施方案还描述于以下文献中：2012年3月16日递交的临时 申请第61/612,087号(案件编号LT00655PRO)和2012年11月7日递交的临时申请第 61/723,759号(案件编号LT00655PRO 2)，为所有目的将其并入本文。 0067 如上所述，减少反应位点的大小可导致与将液体样品加载至每个。
32、反应位点有关的 挑战。 0068 如上所述，可取的是加载液体样品，以便很少或没有残留的液体样品。根据本文描 述的各种实施方案，对于加载芯片，将用于加载芯片的液体样品的至少75体积加载至所 述多个反应位点。在一些实施方案中，将用于加载芯片的液体样品的至少90体积加载至 所述多个反应位点。在各种实施方案中，用于加载芯片的液体样品体积等于芯片上所述多 个反应位点的总体积的体积。在一些实施方案中，施用于芯片的液体样品体积为芯片上所 述多个反应位点的总体积的体积减去一个反应位点的体积。 0069 参照图2，根据本文描述的各种实施方案，可通过将一定量的液体样品放至芯片 100上来加载反应位点104的阵列。。
33、由柔性材料组成的样品加载器206可用于接触阵列 104，并以足够促进阵列104的毛细管作用加载的压力将液体样品散布于反应位点104的阵 列上。当以横向涂抹(sweeping)方式加载时，足够的压力可为足以克服表面的疏水/亲水 特性的力。在一些实施方案中，样品加载器206可保持静止，而芯片100移动以将液体样品 散布于阵列104上。在其他实施方案中，芯片100可保持静止，而样品加载器206在阵列104 上移动以加载反应位点104的阵列。此外，以这种方式，也可将过量液体样品从芯片100上 去除。 0070 而且，根据本文描述的各种实施方案，当将所述芯片移入盒子或容器中时，所述多 个反应位点可被加载。
34、。盒子可有助于防止液体样品的蒸发，也可增加热循环期间每个反应 说 明 书CN 104334275 A 6/14页 9 体积的稳定性。 0071 图3A、3B和3C显示了根据本文件公开的各种实施方案的用于加载反应位点阵列 的示例性盒子300的各种视图。盒子300可包括第一部分302和第二部分304。第一部分 302和第二部分304被配置为可移动式连接以便第一部分302和第二部分304能在封闭的 位置包裹住芯片100。 0072 根据本文教导的各种实施方案，加载芯片中的反应位点的方法如图4所示。在步 骤402中，将液体样品放于样品加载器。在各种实施方案中，所述样品加载器可具有接入口 来放入液体样品。
35、，以便将液体样品接纳在样品加载器内的储液器中。在其他实施方案中，将 所述液体样品直接放至包含反应位点阵列的芯片上。在步骤404中，使所述样品加载器与 芯片接触。在步骤406中，横向移动所述样品加载器跨越芯片表面，以便以足够允许反应位 点的毛细管作用的压力将液体样品与反应位点接触，从而将液体样品加载至反应位点。可 任选地进行步骤408。在步骤408中，通过进行加热，可有助于去除样品加载器放置于芯片 表面上且没有加载至反应位点中的任何过量的液体样品。可通过加热表面来加热所述芯 片。去除过量的液体样品可有助于降低例如扩增液体样品中的生物分子期间可能产生的误 差。 0073 参照图5B，第一部分302。
36、可容纳芯片100。在一些实施方案中，芯片100可通过施 加于端口310的粘合剂而容纳在盒子300的第一部分302中。所述粘合剂可为例如胶水或 UV粘合剂类型。在其他实施方案中，芯片100可通过例如紧固件或夹持件而容纳在第一部 分302中。 0074 根据各种实施方案，导液漏斗308与盒子300的第二部分304为连通的关系，以有 助于将样品引入至芯片100的反应位点。导液漏斗308可为具有足够柔性的疏水材料以接 触并施加压力于芯片100从而加载反应位点。导液漏斗308可由例如硅酮、RTV、聚氨酯、天 然橡胶、其他弹性体或聚烯烃组成。导液漏斗308被配置用于将液体样品散布于芯片100 上，以便在将。
37、芯片100移动经过导液漏斗308时加载单个反应位点。导液漏斗308也可配 置为垫圈。 0075 以这种形式，按整个本文件中讨论的且尤其是图4中的方式，有助于引入样品材 料，且可减少所需的样品的最小体积。在各种实施方案中，导液漏斗308被整合或结合至盒 子中。可选择地，导液漏斗308可为分离的或可移动的物件。 0076 导液漏斗308可具有各种形状和大小。例如，在一个实施方案中，导液漏斗308可 采用具有狭缝904的水槽形式，如图9A和9B所示。狭缝904的宽度足够窄，从而当液体样 品被放于导液漏斗308中时，液体样品不会流过去。狭缝904允许芯片100通过进入位于 盒子的第二部分304内的静止。
38、性容积(resting volume)312中。在一些实施方案中，可用 薄膜覆盖狭缝904以保持静止性容积312封闭，以便例如隔绝杂物或空气。当插入芯片100 而通过导液漏斗308时，芯片100可打破覆盖狭缝904的膜。 0077 同样结合至第二部分304的是样品端口306。可将液体样品放于样品端口306中 以加载芯片100。放于样品端口306中的液体样品可被容纳在导液漏斗308中。另外，导液 漏斗308可被配置为沿着其长度上的几个点来接收样品材料，从而有助于加载样品。沿着 导液漏斗长度上的几个加样端口可有助于有效加载液体样品。沿着导液漏斗长度上的几个 加样端口可被配置为与芯片100一起发挥作。
39、用。 说 明 书CN 104334275 A 7/14页 10 0078 芯片100可被再分为单独的区以用于在芯片的单独部分中加载多个样品，从而增 加通量。图10显示了被配置为包括至少两个样品的芯片1000。分隔区1004将反应位点 的第一阵列1006与反应位点的第二阵列1008隔开。可用这种方式加载芯片，以便第一液 体样品被加载至第一阵列1006，而第二液体样品被加载至第二阵列1008。在一些实施方案 中，第一液体样品可为样品的一种稀释液，而第二液体样品可为样品的另一种稀释液。 0079 在其他实施方案中，可例如通过如图3A-3C或图8A-8B所示的盒子，将所述第一和 第二液体样品加载至芯片。
40、1000。采用根据本文描述的各种实施方案的盒子，可将所述液体 样品加载至导液漏斗，从而将其加载至芯片上期望的阵列中。相比之下，芯片1002图示了 根据各种实施方案的包含多个样品区的单个阵列的芯片。 0080 如上所述，导液漏斗308可具有形成槽形小井的结构，以便所述液体样品被容纳 并与芯片100接触。 0081 如上所述，第二部分304可包括静止性容积312。静止性容积312是当盒子300处 在封闭位置时容纳芯片的地方。在各种实施方案中，静止性容积312中可装有浸液。浸液 也可称为包封介质。包封介质可为不与反应位点104中容纳的液体样品混合的不混溶的流 体(例如液体或凝胶)，并被配置用于防止或。
41、减少反应位点104中容纳的液体样品的蒸发。 0082 根据各种实施方案，所述包封介质可为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。PDMS可为交联不 足的，以充分包封芯片100的反应位点而不污染加载至反应位点的液体样品。 0083 PDMS具有一些特性使其适合用于PCR。例如，PDMS具有很低的自发荧光、在PCR温 度下对热稳定且对聚合过程无抑制作用。此外，PDMS可容纳含水样品，但可允许水蒸气透 过。 0084 PDMS可在交联不足下但被充分固化。在一个实例中，所述包封介质为添加有 0.8wt交联剂的PDMS。通常，充分交联的PDMS添加有10wt的交联剂。其他合适的包封 介质可为其他的PCR相容性粘弹性。
42、材料。 0085 通过PDMS的交联不足，其可作为合适的包封剂同时保留所有通常与完全交联的 材料相关的属性。例如，PDMS可通过使用小于10的量的交联剂而为交联不足。例如，交 联水平小于或等于1符合某些PCR应用如dPCR某些应用的一些设计需要。已采用以小于 或等于0.8的量的交联剂包封的平板100显示了多重dPCR响应。而且，由于交联不足的 PDMS材料具有比Fluorinert更高的粘性，PDMS封装介质可为自身提供包装需要和客户工 作流程解决方案。 0086 当芯片100通过样品和导液漏斗308的狭缝时，所述反应位点将被灌注样品并进 入至静止性容积312。如果在插入芯片100以前，用封装。
43、介质填充静止性容积312，那么填 充的反应位点暴露于空气的时间量以及样品的蒸发量被最小化。 0087 可用与生物反应相容如与PCR相容的一系列材料制造所述盒子。例如，与PCR相 容时，该盒子可具有低的自发荧光、对PCR反应无抑制作用、对PCR的激发和检测波长光学 透明和在PCR温度下热稳定。用于盒子的材料实例可为，但不限于，聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚 环烯烃、环烯烃或其他这类聚合物材料。 0088 在一些实施方案中，静止性容积312位于所述盒子的囊(pocket)中。所述囊被配 置用于在静止性容积312内容纳包封介质。 0089 在一些实施方案中，可在插入芯片100之前，将所述包封介质预装载至所述。
44、囊中。 说 明 书CN 104334275 A 10 8/14页 11 可将芯片100按压至预装的容积中，这期间其被包封介质所包封。在所述盒子封闭期间，组 装第一部分302和第二部分304，并在静止性容积312内将芯片100包封在包封介质中，可 通过第一部分302进一步压实垫圈308以形成密封的静止性容积312。 0090 在其他实施方案中，静止性容积312中的囊可为密封的且没有空气，从而当芯片 100被推进静止性容积312中时，所述囊被打开。以这种方式，将无油法和盒子用于所述芯 片。 0091 在各种实施方案中，导液漏斗308可由聚二甲基硅酮或类似材料组成。在一些实 施方案中，硅酮油也可包含。
45、在导液漏斗308中。例如，所述硅酮油可为PD5。采用该聚合物 材料，硅酮油随时间从所述聚合物基质中缓慢释放出来。所述硅酮油可赋予导液漏斗308 润滑性，从而芯片100更容易被推送而经过导液漏斗308。在这些实施方案中，导液漏斗308 被配置用于将液体样品散布于芯片100上，以便在移动芯片100通过导液漏斗308时加载 单个反应位点。此外，所述硅酮油可在芯片100被载入至盒子300中时对其进行包被，以减 少或防止样品蒸发。在这些实施方案的一些中，由于包被硅酮油足以防止样品损失而可能 不需要包封介质。 0092 根据各种实施方案，所述浸泡流体可为，但不限于，弹性体、聚合物或油。所述浸泡 流体可有助。
46、于样品加载、减少其蒸发和防止产生气泡。盒子中的空气可能干扰例如样品的 生物反应或成像误差。 0093 一些应用的浸泡流体实例为Fluorinert，由3M公司出售。然而，对于某些PCR应 用来说Fluorinert可能存在问题，因为Fluorinert具有易于吸收空气的习性，这些空气随 后会在PCR循环期间释放出来，导致形成不期望的气泡。 0094 图3B显示了在芯片静止性容积312内包含有芯片100的盒子。第一部分和第二 部分处在封闭的位置。图3C是根据本文描述的各种实施方案的封闭盒子的另一透视图。 0095 图4显示了根据本文描述的各种实施方案，描述加载多个反应位点的方法400的 流程图。。
47、在步骤402，将液体样品放入导液漏斗中。如图9A和9B所示，导液漏斗可为槽形 以容纳液体样品。根据各种实施方案，所述导液漏斗可由疏水材料组成。 0096 在步骤404中，所述芯片被插入至导液漏斗，其中所述芯片包括如上所述的基底 和多个反应位点。所述导液漏斗配置为在芯片经过导液漏斗时接触所述芯片。 0097 在步骤406中，使所述芯片经过导液漏斗以将液体样品加载至所述多个反应位 点。接触导液漏斗有助于将所述液体样品加载至反应位点。如上文所述，当使用横向涂抹 (sweeping)方式时，导液漏斗以足够克服表面的疏水/亲水特性的压力接触芯片。以这种 方式，所述导液漏斗通过将过量的液体样品保留在导液漏。
48、斗中，也可减少可能残留在基底 上的过量液体样品。 0098 根据本文描述的各种实施方案，对于加载芯片，将施用于所述芯片用于加载的液 体样品的至少75体积加载至所述多个反应位点。在一些实施方案中，将施用于所述芯片 用于加载的液体样品的至少90体积加载至所述多个反应位点。在各种实施方案中，施用 于芯片的待加载的液体样品体积等于芯片上所述多个反应位点的总体积的体积。在一些实 施方案中，用于加载芯片的液体样品体积为芯片上所述多个反应位点的总体积的体积减去 一个反应位点的体积。 0099 此外，在各种实施方案中，所述反应位点和基底可包被有疏水材料或由其组成。以 说 明 书CN 104334275 A 1。
49、1 9/14页 12 这种方式，反应位点的毛细管力是将液体样品加载至反应位点和将所述液体样品接纳在反 应位点中的主要因素。 0100 在一些实施方案中，所述反应位点可包被有亲水材料或由组成，而基底可包被有 疏水材料或由其组成。如此，结合由导液漏斗提供的力，液体样品的加载可能会更加有效。 所述芯片可用各种包被方法来包被，如沉积法、等离子体、掩蔽法、转移印刷、网版印刷、合 模法等。包被方法和特性还描述于2012年11月7日递交的案件编号为LT00668PRO的临 时申请，为所有目的将其并入本文。 0101 图8A和8B显示了根据本文描述的各种实施方案，用于加载包含反应位点阵列的 芯片的盒子的另一实例。盒子802包括导液漏斗806和芯片静止性容积808。将芯片100 插入至芯片静止性容积808。通过导液漏斗806促进芯片100的样品加载。如以上所述， 。