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1、(10)申请公布号 CN 102907322 A (43)申请公布日 2013.02.06 C N 1 0 2 9 0 7 3 2 2 A *CN102907322A* (21)申请号 201210428997.1 (22)申请日 2012.10.31 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人北京农业生物技术研究中心 地址 100097 北京市海淀区板井曙光花园中 路9号北京市农林科学院 (72)发明人李瑞芬 张杰伟 魏建华 王宏芝 孙振元 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人关畅 (54) 发明名称 一种创制结缕草高频再生系的方法 (57) 摘要。
2、 本发明公开了一种创制结缕草高频再生系的 方法。本发明提供一种创制结缕草高频再生系的 方法，包括如下步骤：将单粒结缕草种子依次经 诱导培养、第一次继代培养、第二次继代培养、第 三次继代培养，得到结缕草高频再生系。本发明的 实验证明，本发明提供了一种创制结缕草高频再 生愈伤组织系或再生植株及专用培养基，本发明 通过筛选日本结缕草品种，以单粒种子为外植体， 分别诱导出不同的愈伤系，经培养基配比组合和 多次干化继代培养，筛选出分化能力强的愈伤系， 每一系增殖的大量高频再生愈伤组织均为同质。 最终，建立一种创制结缕草高频再生系的方法，为 提高结缕草组织培养再生率和遗传转化效率提供 实用方法。 (51)。
3、Int.Cl. 权利要求书2页 说明书12页 附图3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 3 页 1/2页 2 1.一种创制结缕草再生愈伤组织系的方法，包括如下步骤：将单粒结缕草种子依次经 诱导培养、第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养，得到结缕草再生愈伤组织 系。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述诱导培养、所述第一次继代培养、所述第二次继代培养和所述第三次继代培养采 用的培养材料均源自同一个种子； 所述诱导培养为将所述结缕草种子在诱导培养基中诱导培养，得到诱导愈伤组织； 所述第一次继代培养为将所述。
4、诱导愈伤组织在第一代继代培养基中第一代继代培养， 得到第一次愈伤组织； 所述第二次继代培养为将所述第一次愈伤组织在第二代继代培养基中第二代继代培 养，得到第二次愈伤组织； 所述第三次继代培养为将所述第三次愈伤组织在第三代继代培养基中第三代继代培 养，得到再生愈伤组织系； 所述诱导培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度2mg/L的 2,4-D、终浓度的0.15mg/L 6-BA、终浓度30gL -1 的蔗糖、终浓度7.0gL -1 的琼脂、终浓度 0.5gL -1 的水解酪蛋白、终浓度1mgL -1 的VB 1 、终浓度1mgL -1 的VB 2 ，用水补足体积； 所述第一。
5、代继代培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度 为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA、终浓度为40gL -1 的蔗糖、终浓度为9.0gL -1 的琼脂、终浓度为0.5gL -1 的水解酪蛋白、终浓度为1mgL -1 的VB 1 和终浓度为1mgL -1 的VB 2 ，用水补足体积； 所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35gL -1 、 琼脂终浓度调整为8.0gL -1 ，其他成分和浓度不变，用水补足体积； 所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为30gL -1 、 琼。
6、脂终浓度调整为7.0gL -1 ，其他成分和浓度不变，用水补足体积。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述诱导培养的条件为温度24-26、光照强度1000-3000umol m -2 s -1 下暗培养1个 月； 所述第一次、第二次、第三次继代培养条件均为温度24-26、黑暗培养20天。 4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 在所述第一次继代培养后和所述第二次继代培养前还包括如下步骤：选取第一次继代 愈伤组织中的胚性愈伤组织。 5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述结缕草种子为去颖后的结 缕草种子。 6.一种制备结缕草再生植株的方法，包括如下步。
7、骤：在权利要求1-5任一项中的方法 中的第三次继代培养后，将所述结缕草再生愈伤组织系依次经分化培养和生根培养，得到 结缕草再生植株； 所述分化培养为将所述结缕草再生愈伤组织系在分化培养基中进行分化培养，得到生 芽愈伤组织； 所述分化培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为 权 利 要 求 书CN 102907322 A 2/2页 3 1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT、终浓度为0.5mg/L ZT、终浓度为30gL -1 蔗糖、终 浓度为7.0gL -1 琼脂、终浓度为0.5gL -1 水解酪蛋白，终浓度为1mgL -1 VB 1 、终浓度为 1mgL。
8、 -1 VB 2 ，用水补足体积； 在所述分化培养中，所述结缕草再生愈伤组织系的直径大小均具体为0.3-0.5cm。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 所述生根培养为将所述生芽愈伤组织在所述生根培养基中进行生根培养，得到结缕草 再生植株； 所述生根培养基为在液体1/2MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为 10mg/L VB 1 、终浓度为0.25mg/L IBA、终浓度为25gL -1 蔗糖和终浓度为7.0gL -1 琼脂，用 水补足体积。 8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于： 所述分化培养和所述生根培养的条件均如下：温度24-26、光照强度1000-3000u。
9、mol m -2 s -1 及光照14h/黑暗10h的条件下培养1个月。 9.一种制备结缕草再生植株的培养基组，包括诱导培养基、第一次继代培养基、第二次 继代培养基和第三次继代培养基； 所述诱导培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度2mg/L的 2,4-D、终浓度的0.15mg/L 6-BA、终浓度30gL -1 的蔗糖、终浓度7.0gL -1 的琼脂、终浓度 0.5gL -1 的水解酪蛋白、终浓度1mgL -1 的VB 1 、终浓度1mgL -1 的VB 2 ，用水补足体积； 所述第一代继代培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度 为1mg/L的2,。
10、4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA、终浓度为40gL -1 的蔗糖、终浓度为9.0gL -1 的琼脂、终浓度为0.5gL -1 的水解酪蛋白、终浓度为1mgL -1 的VB 1 和终浓度为1mgL -1 的VB 2 ，用水补足体积； 所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35gL -1 、 琼脂终浓度调整为8.0gL -1 ，其他成分和浓度不变，用水补足体积； 所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为30gL -1 、 琼脂终浓度调整为7.0gL -1 ，其他成分和浓度不变，用水补足体积； 所述培养基组还具。
11、体包括分化培养基；所述分化培养基为在液体MS培养基中添加具 有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT、终浓度为0.5mg/L ZT、终浓度为30gL -1 蔗糖、终浓度为7.0gL -1 琼脂、终浓度为0.5gL -1 水解酪蛋白，终浓 度为1mgL -1 VB 1 、终浓度为1mgL -1 VB 2 ，用水补足体积； 所述培养基组还进一步具体包括生根培养基，所述生根培养基为在液1/2MS培养基中 添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/L VB 1 、终浓度为0.25mg/L IBA、终浓度为 25gL -1 蔗糖和终浓度为7.0gL -1 。
12、琼脂，用水补足体积； 所述培养基组中的各种培养基的pH值均具体为5.8。 10.一种愈伤组织的继代保存的方法，包括如下步骤：将愈伤组织按照权利要求1-5中 任一所述的方法中的第三次继代培养2次，得到继代产物；再将所述继代产物按照权利要 求1-5中任一所述的方法中的第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养依次进 行培养； 所述愈伤组织具体为权利要求1-5中任一所述的方法中结缕草再生愈伤组织。 权 利 要 求 书CN 102907322 A 1/12页 4 一种创制结缕草高频再生系的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物组织培养领域，尤其涉及一种创制结缕草高频再生系的方法。 背景技术 00。
13、02 草坪草具有景观功能、生态功能和运动功能。随着经济的快速发展和人民生活水 平的不断提高，草坪对于城市的绿化和环境改善起着越来越重要的作用。人们利用有性杂 交、轮回选育等常规育种手段培育出一些草坪草新品种。转基因技术具有可以定向改良、打 破生殖隔离等优点，是草坪草遗传改良的一种非常有前途的手段。 0003 草坪草与其他植物一样，组织培养是遗传转化操作的前提。目前，尽管有不少报道 已建立了各草种的再生体系，但由于大多数草坪草属异花授粉植物，遗传背景复杂，组织培 养比其他植物更具有难度。 0004 结缕草属植物（Zoysia L.）是世界上重要的暖季型草坪草之一，具有很强的生命 力和抗逆性，尤其。
14、以超群的耐践踏、耐瘠薄和抗病能力而著称。结缕草被誉为“最有前途”的 草种，其形成的草坪弹力是早熟禾的30-40倍，耗水量比草地早熟禾少30-40%，建植和管理 费用比早熟禾低80%左右（胡叔良，1997，发展草坪绿地关键问题的探讨，中国草地，5（2）： 67-70）。正是由于结缕草所具有的这些独特的优良性状，使它们成为运动场、开放绿地、边 坡绿化以及水土保持的重要草种，也是适合我国水资源贫乏国情的草坪草种。同时，结缕草 也是我国唯一具有出口创汇能力的草种。 0005 因此，建立稳定高效的结缕草组织培养体系不仅具有重要的理论意义，还有实际 应用价值。 0006 在结缕草组织培养和遗传转化方面，前。
15、人已做过一些探索和研究，并取得了一定 的研究成果。早在1987年，Al-Khayri等以日本结缕草成熟胚作为实验材料，通过切离 成熟胚诱导愈伤组织，最终获得再生植株（A1-Khayri J M,Huang F H,Thompson LF,et a1.1987,In vitro plant regeneration of zoysia grass(Zoysia japonicaSteud.).In Vitro,23:3;A1-Khayri J M,Huang F H,Thompson L F,et a1.1989,Plant regeneration of zoysia grass from e。
16、mbryo-derived callus.Crop Science,29(5):1324-1325）。但 结缕草种子较小，成熟胚的分离操作相对困难，限制其广泛应用。Inokuma等在1996年 首次报道通过培养日本结缕草悬浮细胞系，用纯化得到的原生质体再生出植株（INOKUMA C,SUGIURA K,CHO C,et a1.1996,Plant regenerationfrom protoplasts of Japanese lawn grass.Plant Cell Reports,15(10):737-741）。但该操作不仅比较繁琐，而且再生 率较低。之后，人们又以结缕草幼穗、幼胚和根茎。
17、作为外植体，试图通过体胚发生途径获 得再生植株（NOH H Y,CHOI J S,AHN B J.1995,Plant regeneration through somatic embryogenesis in zoysia grasses(Zoysiaspp.).Journal of the Korean Society for Horticultural Science,36(4):582-587；玄松南,陈慧哲,傅亚萍,等.1997，两种草坪草 愈伤组织的诱导及其分化研究.浙江农业学报,9:295-299；GE Yaxin,TINA Norton,WANG Zeng-Yu.2006,Tr。
18、ansgeniczoysiagrass(Zoysia japonica)plants obtained by Agrobact 说 明 书CN 102907322 A 2/12页 5 erium-mediatedtransformation.Plant Cell Rep,25:792798），但该方法不仅取材受季 节所限，无菌外植体的获得也是一个难题。不管以哪种外植体再生植株，均有诸多因素影响 再生率（齐春辉,韩烈保,黄麟,等.2005，几种因素对日本结缕草愈伤组织诱导与生长影 响的研究.四川草业,4:1-3；张俊卫,唐蜻,包满珠.2006，日本结缕草成熟种子愈伤组织 诱导及植株再生的影响因子。
19、分析.中国农业科学,39(2):368-374）。 0007 目前，尚未见有关结缕草高频再生系的创制方法相关报道或专利。 发明内容 0008 本发明的一个目的是提供一种创制结缕草再生愈伤组织系的方法。 0009 本发明提供的方法，包括如下步骤：将单粒结缕草种子依次经诱导培养、第一次继 代培养、第二次继代培养、第三次继代培养，得到结缕草再生愈伤组织系。 0010 上述方法中，上述诱导培养、所述第一次继代培养、所述第二次继代培养和所述第 三次继代培养采用的培养材料均源自同一个种子。 0011 上述方法中，所述诱导培养为将所述结缕草种子在诱导培养基中诱导培养，得到 诱导愈伤组织； 0012 所述第一。
20、次继代培养为将所述诱导愈伤组织在第一代继代培养基中第一代继代 培养，得到第一次愈伤组织； 0013 所述第二次继代培养为将所述第一次愈伤组织在第二代继代培养基中第二代继 代培养，得到第二次愈伤组织； 0014 所述第三次继代培养为将所述第三次愈伤组织在第三代继代培养基中第三代继 代培养，得到再生愈伤组织系； 0015 所述诱导培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度 2mg/L的2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、终浓度的0.15mg/L 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、终浓度 30gL -1 的蔗糖、终浓度7.0gL -1 的琼脂、终浓度0.5gL -1 的水解酪蛋白、终浓。
21、度1mgL -1 的VB 1 （维生素B1）、终浓度1mgL -1 的VB 2 （维生素B2），用水补足体积； 0016 所述第一代继代培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终 浓度为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA（脱落酸）、终 浓度为40gL -1 的蔗糖、终浓度为9.0gL -1 的琼脂、终浓度为0.5gL -1 的水解酪蛋白、终 浓度为1mgL -1 的VB 1 和终浓度为1mgL -1 的VB 2 ，用水补足体积； 0017 所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为 35gL -1 、琼脂。
22、终浓度调整为8.0gL -1 ，其他成分和浓度不变，用水补足体积； 0018 所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为 30gL -1 、琼脂终浓度调整为7.0gL -1 ，其他成分和浓度不变，用水补足体积。 0019 上述方法中，所述诱导培养的条件为温度24-26、光照强度1000-3000umol m -2 s -1 下暗培养1个月； 0020 所述第一次、第二次、第三次继代培养条件均为温度24-26、黑暗培养20天。 0021 上述方法中，在所述第一次继代培养后和所述第二次继代培养前还包括如下步 骤：选取第一次继代愈伤组织中的胚性愈伤组织；所述选取第一次继代愈伤组。
23、织中的胚性 愈伤组织具体为剥离松软第一次继代愈伤组织，而选取质地变硬的第一次继代愈伤组织。 说 明 书CN 102907322 A 3/12页 6 0022 上述方法中，所述结缕草种子为去颖后的结缕草种子。 0023 在上述方法中，也可以在第二次、第三次继代培养时均选用胚性愈伤组织作为培 养材料。 0024 本发明的另一个目的是提供一种制备结缕草再生植株的方法。 0025 本发明提供的方法，包括如下步骤：在上述创制结缕草再生愈伤组织系的方法中 的第三次继代培养后，将所述结缕草再生愈伤组织系依次经分化培养和生根培养，得到结 缕草再生植株； 0026 所述分化培养为将所述结缕草再生愈伤组织系在分化。
24、培养基中进行分化培养，得 到生芽愈伤组织； 0027 所述分化培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为 1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT（6-糠氨基嘌呤）、终浓度为0.5mg/L ZT（玉米素）、终 浓度为30gL -1 蔗糖、终浓度为7.0gL -1 琼脂、终浓度为0.5gL -1 水解酪蛋白，终浓度为 1mgL -1 VB 1 、终浓度为1mgL -1 VB 2 ，用水补足体积。 0028 上述获得再生植株的方法中，在所述分化培养中，所述结缕草再生愈伤组织系的 直径大小均为0.3-0.5cm； 0029 上述获得再生植株的方法中，所述生根培养为将。
25、所述生芽愈伤组织在所述生根培 养基中进行生根培养，得到结缕草再生植株； 0030 所述生根培养基为在液体1/2MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度 为10mg/L VB 1 、终浓度为0.25mg/L IBA（吲哚丁酸）、终浓度为25gL -1 蔗糖和终浓度为 7.0gL -1 琼脂，用水补足体积。 0031 上述获得再生植株的方法中，所述分化培养和所述生根培养的条件均如下：温度 24-26、光照强度1000-3000umol m -2 s -1 及光照14h/黑暗10h的条件下培养1个月。 0032 本发明的第三个目的是提供一种创制结缕草再生愈伤组织系或制备结缕草再生 植株的培养基。
26、组。 0033 本发明提供的培养基组，包括诱导培养基、第一次继代培养基、第二次继代培养基 和第三次继代培养基； 0034 所述诱导培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度 2mg/L的2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、终浓度的0.15mg/L 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、终浓度 30gL -1 的蔗糖、终浓度7.0gL -1 的琼脂、终浓度0.5gL -1 的水解酪蛋白、终浓度1mgL -1 的VB 1 （维生素B1）、终浓度1mgL -1 的VB 2 （维生素B2），用水补足体积； 0035 所述第一代继代培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终 浓度。
27、为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA（脱落酸）、终 浓度为40gL -1 的蔗糖、终浓度为9.0gL -1 的琼脂、终浓度为0.5gL -1 的水解酪蛋白、终 浓度为1mgL -1 的VB 1 和终浓度为1mgL -1 的VB 2 ，用水补足体积； 0036 所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为 35gL -1 、琼脂终浓度调整为8.0gL -1 ，其他成分和浓度不变，用水补足体积； 0037 所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为 30gL -1 、琼脂终浓度调整为7.0gL -1 ，。
28、其他成分和浓度不变，用水补足体积。 0038 所述培养基组还具体包括分化培养基；所述分化培养基为在液体MS培养基中添 说 明 书CN 102907322 A 4/12页 7 加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT（6-糠氨基嘌 呤）、终浓度为0.5mg/L ZT（玉米素）、终浓度为30gL -1 蔗糖、终浓度为7.0gL -1 琼脂、终 浓度为0.5gL -1 水解酪蛋白，终浓度为1mgL -1 VB 1 、终浓度为1mgL -1 VB 2 ，用水补足体积。 0039 所述培养基组还进一步具体包括生根培养基，所述生根培养基为在液1/2MS培养 。
29、基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/L VB 1 、终浓度为0.25mg/L IBA（吲哚 丁酸）、终浓度为25gL -1 蔗糖和终浓度为7.0gL -1 琼脂，用水补足体积。 0040 所述培养基组中的各种培养基的pH值均为5.8。 0041 本发明的第四个目的是提供一种愈伤组织的继代保存的方法。 0042 本发明提供的方法，包括如下步骤：将愈伤组织按照上述的创制结缕草再生愈伤 组织系中的第三次继代培养2次，得到继代产物；再将所述继代产物按照上述创制结缕草 再生愈伤组织系的方法中的第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养依次进行 培养； 0043 所述愈伤组织具体为上述创。
30、制结缕草再生愈伤组织系中结缕草再生愈伤组织。 0044 本发明的实验证明，本发明提供了一种创制结缕草高频再生系的方法，本发明的 方法具有如下优点：1）由于结缕草属异花授粉植物，不同种子可能是不同的基因型，植物再 生能力很大程度上依赖于其自身的基因型，本发明通过筛选日本结缕草品种，以单粒种子 为外植体，分别诱导出不同的愈伤系，经培养基配比组合和多次干化继代培养，筛选出分化 能力强的愈伤系，每一系增殖的大量高频再生愈伤组织均为同质，可以最大程度上将具有 较强再生能力的基因型保留下来，淘汰再生能力弱的基因型；2）由于结缕草品种内基因型 复杂，不同基因型的表型可能有差异，建立单独的高频再生系而不是混系。
31、，有利于转基因后 代或变异株系与亲本在遗传背景一致的条件下进行比较分析；3）本发明采用的专用培养基 制备高频再生愈伤系，该高频再生愈伤系分化率高，且保存时间长。 附图说明 0045 图1为结缕草高频再生系的诱导培养 0046 图2为结缕草高频再生系的继代培养 0047 图3为结缕草高频再生系的扫描电镜鉴定 0048 图4为结缕草高频再生系的分化和生根培养 0049 图5为结缕草高频再生系的创制过程 具体实施方式 0050 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 0051 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0052 下述实施例中的结缕草以日本结。
32、缕草品种Qingdao（克劳沃集团http:/www. bjclover.com/center/aboutcp1.asp，产品目录号zj-011-02）为例，也可以换为其他所有 结缕草属（Zo ysia Willd.）植物。 0053 本发明发现了影响结缕草植株再生率的关键因素是如何高效地将非胚性愈伤组 织调整为胚性愈伤组织。具有同一基因型、再生力强的胚性愈伤组织，在本专利称之为“高 频再生愈伤组织系”。 说 明 书CN 102907322 A 5/12页 8 0054 下述实施例中液体MS培养基中的组分如表1所示，液体MS培养基为将表1的溶 质按所示的终浓度均溶于水配制： 0055 表1为M。
33、S培养基中的组分 0056 大量元素培养基中终浓度（gL -1 ） NH 4 NO 3 1.65 KNO 3 1.9 KH 2 PO 4 0.17 MgSO 4 .7H 2 O 0.37 CaCl 2 0.44 微量元素培养基中浓度（mgL -1 ） FeSO 4 .7H 2 O 27.8 Na 2 EDTA 37.3 MnSO 4 .4H 2 O 22.3 ZnSO 4 .4H 2 O 8.6 H 3 BO 3 6.2 KI 0.83 Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0.25 CuSO 4 .5H 2 O 0.025 CoCl 2 .6H 2 O 0.025 有机成分培养基中浓度（mg。
34、L -1 ） 甘氨酸2.0 盐酸硫胺素0.4 盐酸吡哆素0.5 烟酸0.5 说 明 书CN 102907322 A 6/12页 9 肌醇100 0057 0058 实施例1、结缕草高频再生愈伤组织系和再生植株的获得 0059 下述实施例中采用的日本结缕草品种Qingdao种子先用细砂纸打磨去颖，再用 自来水冲洗约1h，无菌条件下70%酒精处理30s，然后用10%次氯酸钠溶液（体积百分比，并 加入1滴吐温20）于超声清洗仪中处理10min，以无菌水清洗6次，并用无菌水浸泡过夜，准 备接种。 0060 一、结缕草高频再生愈伤组织系的获得 0061 创制高频再生愈伤组织系必须满足3个条件：1）诱导率。
35、要高，诱导率除了与诱导 条件有关外，还与诱导品种有关；2）在一定诱导时间下（一般为诱导1个月）愈伤组织增殖 快；3）诱导出的愈伤组织有利于后期胚性状态的调整。 0062 1、诱导培养愈伤组织 0063 不同组分诱导培养基配方：在MS培养基的基础上优化了生长素（2.0mg/L 2,4-D） 与分裂素（0.1-0.2mg/L 6-BA和0.1-1.0mg/L KT）的组合配比，部分培养基添加葡萄糖为 20gL -1 ，其余蔗糖浓度为30gL -1 ，琼脂7.0gL -1 ，水解酪蛋白0.5gL -1 ，VB 1 1mgL -1 ， VB 2 1mgL -1 ，pH 5.8，部分培养基还添加0.5%。
36、甘露醇；具体配方见表2。 0064 诱导培养条件：在温度24-26、光照强度1000-3000umol m -2 s -1 下暗培养1个月。 0065 诱导率为（诱导愈伤组织数/种子数）*100%。 0066 诱导培养愈伤组织的方法具体如下： 0067 将前天消毒处理的每一粒日本结缕草品种Qingdao种子分别接种在不同组分的 诱导培养基上诱导培养，得到每一粒种子的愈伤组织（为1个愈伤组织系）；每种培养基配置 6个培养皿，每个培养皿中接种约30粒种子（分隔开接种），培养条件为温度25暗培养1 个月。 0068 统计各处理诱导愈伤组织诱导率，结果见如表2。 0069 表2日本结缕草愈伤组织诱导培。
37、养基 0070 0071 根据上述结果，确定最佳诱导培养基为Md，其组分及各组分在培养基中的终浓度 如下：在液体MS培养基中添加终浓度2mg/L 2,4-D、终浓度0.15mg/L 6-BA、终浓度30gL -1 蔗糖、终浓度7.0gL -1 琼脂、终浓度0.5gL -1 水解酪蛋白、终浓度1mgL -1 VB 1 、终浓度 说 明 书CN 102907322 A 7/12页 10 1mgL -1 VB 2 ，用水补足体积；调节pH值为5.8。 0072 观察在最佳诱导培养基Md下诱导愈伤组织结果如图1所示，a为消毒结缕草种子 接种于最佳诱导培养基上3天；b为消毒结缕草种子在最佳诱导培养基上诱。
38、导15天后出现 的愈伤组织；可以看出，在最佳诱导培养基Md下诱导培养愈伤组织增殖明显，表面湿润、松 软，颜色呈乳白或透明状，少数出现淡黄色颗粒突起，为非胚性愈伤组织，诱导率达50%以 上；在此条件下诱导出的愈伤组织有利于调整为胚性愈伤组织。 0073 而诱导培养基中添加KT(激动素)、甘露醇和葡萄糖对结缕草愈伤组织诱导并无 明显改观，而且后期不利于愈伤组织胚性状态的调整。 0074 2、愈伤组织系的继代培养 0075 创制结缕草高频再生愈伤组织系的关键是通过继代培养将非胚性愈伤组织调整 为高频再生系。经过多年的摸索和研究发现，不管哪种基因型的成熟胚，其刚诱导出的愈伤 组织总是非胚性的，表现为质。
39、地松软，颜色乳白，水样化；这样的非胚性愈伤组织必须经过 继代培养调整为具有分化能力的愈伤组织。 0076 继代培养的目的：1）是经过优化的继代培养将大多数再生能力较强的基因型“挖 掘”出来，即调整为高频再生愈伤组织；2）是将每一粒种子诱导出的愈伤组织经继代培养增 殖为一个高频再生系。 0077 不同组分继代培养基配方：在液体MS培养基的基础上优化了生长素（1.0mg/ L2,4-D）与分裂素（0.05-0.2mg/L 6-BA和0.2mg/L ABA）的组合配比，培养基添加蔗糖浓 度为30-45gL -1 ，琼脂7.0-9.0gL -1 ，水解酪蛋白0.5gL -1 ，VB11mgL -1 ，。
40、VB21mgL -1 ，pH 5.8；具体配方见表3。 0078 继代培养条件是在温度24-26、黑暗培养20天。 0079 将上述1中在最佳诱导培养基中得到的来源于同一种子的诱导愈伤组织分别接 种到如下表3中的培养基中，依次进行第一代、第二代、第三代继代培养；且三次继代培养 采用同一种培养基，统计每一次继代后的胚性愈伤组织（深黄色，质地很坚硬）的诱导率；其 中，胚性愈伤组织表面深黄色，质地坚硬；非胚性愈伤组织表面浅白色，质地很松软，结果如 表3所示： 0080 第一次继代培养胚性愈伤组织诱导率=（第一次继代培养得到的胚性愈伤组织数 /接种在第一次继代培养基上的愈伤组织数）*100%； 008。
41、1 第二次继代培养胚性愈伤组织诱导率为（第二次继代培养得到的胚性愈伤组织数 /接种在第二次继代培养基上的愈伤组织数）*100%； 0082 表3日本结缕草愈伤组织继代培养基 0083 说 明 书CN 102907322 A 10 8/12页 11 0084 通过上述培养基的摸索，愈伤组织继代培养的方法具体如下： 0085 （1）第一次继代培养 0086 第一次继代培养首先要调整激素水平，即降低生长素2,4-D的浓度，并增加分裂 素6-BA和ABA的浓度；另外，还要通过增加蔗糖和琼脂浓度来调节培养基的渗透压，使继 代培养的愈伤状态发生转变；因此第一代继代培养基为在MS培养基中添加终浓度为1mg/。
42、 L 2,4-D、终浓度为0.2mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L ABA、终浓度为40gL -1 蔗糖、终浓 度为9.0gL -1 琼脂、终浓度为0.5gL -1 水解酪蛋白、终浓度为1mgL -1 VB 1 和终浓度为 1mgL -1 VB 2 ；用水补足体积；调节pH值为5.8(在方法中为MiA培养基)。 0087 第一次继代培养条件：温度25暗培养20天。 0088 第一次继代培养方法如下：将上述1中在最佳诱导培养基中得到的来源于同一种 子的诱导愈伤组织从种子上剥离下来，在第一次继代培养基上划出网格，将每一个种子的 愈伤组织建立一个愈伤组织系，进行第一次继代培养（图2a），得到。
43、第一次继代愈伤组织系。 0089 （2）第二次继代培养 0090 由于第一次继代培养基为高渗培养基不利于高频再生系的创制，而使愈伤组织变 得过于硬实，不利于分化，因此第二次继代培养基为在第一次继代培养基的基础上逐步降 低了培养基的渗透压，具体为将第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35gL -1 、琼脂终 浓度调整为8.0gL -1 ，其他成分和浓度不变(在方法中为MiB培养基)，用水补足体积，调 节pH值为5.8。 0091 第二次继代培养的条件：温度25暗培养20天； 0092 第二次继代培养的方法：将选取上述（1）中在最佳第一次继代培养基中得到的来 源于同一种子的第一次继代愈伤组织系中的。
44、胚性愈伤组织；上述（1）中在第一次继代培养 基中得到的来源于同一种子的第一次继代愈伤组织系直接转移至第二次继代培养基上，进 行第二次继代培养，得到第二次继代愈伤组织系。 0093 上述选取上述（1）中在最佳第一次继代培养基中得到的来源于同一种子的第一次 继代愈伤组织系中的胚性愈伤组织为剥离松软、选取增殖明显或质地变硬的第一次继代愈 伤组织系，这对筛选高频再生愈伤系非常重要，有利于创制高比例的高频再生愈伤系。 0094 结果如图2b所示，每个第二次继代愈伤组织系中约75%以上为胚性愈伤系，表现 说 明 书CN 102907322 A 11 9/12页 12 为颜色鲜艳，为浅黄色，质地硬实，为颗粒。
45、状。 0095 （3）第三次继代培养 0096 为了在保持高再生能力的基础上使胚性愈伤组织迅速增殖，创制出较多的高频再 生系，有利于后期植株再生或遗传转化利用，因此第三次继代培养基配方是在第二次继代 培养基的基础上逐步降低了培养基的渗透压，具体为将第二次继代培养基中的蔗糖终浓度 调整为30gL -1 、琼脂终浓度调整为7.0gL -1 ，其他成分和浓度不变（在方法中为MiC培养 基）。 0097 第三次继代培养条件：温度25暗培养20天。 0098 第三次继代培养方法：将选取上述（2）中在最佳第二次继代培养基中得到的来源 于同一种子的第二次继代愈伤组织系转移至第三次继代培养基上，进行第三次继代。
46、培养， 得到第三次继代愈伤组织系，即为再生愈伤组织系。 0099 结果如图2C，再生愈伤组织系的重量约为1.0-2.0g/系，再生能力也达到最佳。 0100 通过电子扫描显微镜观察确定再生愈伤组织系的表面结构，以诱导愈伤组织（肉 眼观察为非胚性）为对照，结果如图3所示，3a-3b为扫描电镜鉴定的经过三次继代培养得 到的再生愈伤组织系表面结构；c-g扫描电镜鉴定的诱导愈伤组织的表面结构；可以看出， 再生愈伤组织系的表面呈紧密排列的细胞团，放大可见球形或心型等胚状体类似物或细胞 团（图3c-g），表明这些愈伤组织已具备胚性，均为胚性愈伤组织；而诱导愈伤组织表面无 明显成型细胞团（图3a-b），均为。
47、非胚性愈伤组织。 0101 二、再生愈伤组织系的分化培养 0102 通过调整优化分化培养基成分，再生愈伤组织系不仅快速再生出芽，而且每块愈 伤组织再生出的芽较多。 0103 不同分化培养基是在液体MS培养基的基础上优化了不同分裂素（0.05-1.0mg/ L6-BA、0.2-0.5mg/L KT、0-0.5mg/L ZT和0-0.2mg/L GA3）的组合配比，培养基添加蔗糖浓 度为30gL -1 ，琼脂7.0gL -1 ，水解酪蛋白0.5gL -1 ，VB 1 1mgL -1 ，VB 2 1mgL -1 ，pH 5.8，分 化培养基配比见表4。 0104 表4日本结缕草愈伤组织分化培养基 0。
48、105 0106 分化培养条件：在温度24-26、光照强度1000-3000umol m -2 s -1 及光照14h/黑暗 10h的条件下培养1个月。 说 明 书CN 102907322 A 12 10/12页 13 0107 分化率=（出芽的愈伤组织数/接种分化培养基的再生愈伤组织系数）*100%。 0108 分化培养的方法如下： 0109 将上述一的（3）中在最佳第三次继代培养基中得到的来源于不同的种子的再生愈 伤组织系均编号，把稍大的愈伤组织块用无菌镊子夹碎，直径大小约为0.3-0.5cm；然后将 上述一的（3）中在第三次继代培养基中得到的来源于同一的种子的再生愈伤组织系（同质 再生愈伤组织系）转移至不同分化培养基上，进行分化培养，得到分化出芽的愈伤组织。分 化培养条件为在温度25、光照强度2000umol m -2 s -1 及光照14h/黑暗10h的条件下培养 1个月。 0110 统计各处理再生愈伤组织系的分化率，结果如表4。 0111 根据上述结果，确定最佳分化培养基为Yufen3培养基，具体为在液体MS培养 基上添加了终浓度为1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT、终浓度为0.5mg/L ZT，终浓 度为30gL -1 蔗糖，终。