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1、(10)申请公布号 CN 104004125 A (43)申请公布日 2014.08.27 C N 1 0 4 0 0 4 1 2 5 A (21)申请号 201410238973.9 (22)申请日 2014.05.30 C08F 212/08(2006.01) C08F 212/14(2006.01) C08F 220/54(2006.01) C08F 220/06(2006.01) C08F 220/14(2006.01) C08F 2/44(2006.01) C08F 2/22(2006.01) C09K 11/02(2006.01) C09K 11/06(2006.01) C09K 。
2、11/88(2006.01) G01N 33/52(2006.01) (71)申请人吉林大学 地址 130012 吉林省长春市前进大街2699 号 (72)发明人林权 杨旭东 陈洁 陈阳 孙源卿 杨雪 杨柏 董凤霞 (74)专利代理机构长春吉大专利代理有限责任 公司 22201 代理人张景林 王恩远 (54) 发明名称 一种pH响应的双荧光功能聚合物纳米微球 及其在肿瘤组织检测中的应用 (57) 摘要 一种pH响应的双荧光功能聚合物纳米微球 及其在肿瘤组织检测中的应用，属于高分子材料 技术领域。首先合成一种复合荧光分子A的乳液 微球，采用种子乳液聚合的方法，将具有pH响应 功能的聚合物引入到微。
3、球的壳层，制备出核壳结 构的乳液微球。进一步将荧光分子B复合到微球 的壳层中，得到具有pH响应的双荧光发射的功能 聚合物纳米微球。该微球在从酸性到碱性的不同 pH值条件下呈现不同的荧光强度和荧光颜色。基 于纳米微球荧光性质的pH响应功能，应用在组织 检测中，正常组织(pH7.4)呈现紫色荧光，肿瘤 组织(pH6.5)呈现粉红色荧光，其可以用于制备 荧光材料，从而在肿瘤细胞和组织检测、药物缓释 等领域具有广阔的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布。
4、号 CN 104004125 A CN 104004125 A 1/1页 2 1.一种pH响应的双荧光发射聚合物纳米微球，其特征在于：由如下步骤制备得到： (1)称取2-10mmol的异丙基丙烯酰胺NIPAM单体溶解于100-200mL的去离子水中，再 加入10-50mmol的聚合单体1，110 -6 -510 -6 mol的荧光分子A，室温和氮气保护下，机械 搅拌30-60min；然后逐渐升温至60-70，加入5-15mL含0.3-0.6mmol引发剂的水溶液，引 发聚合，反应12-24h后得到含荧光分子A的聚合物种子微球；最后通过高速离心除去液相 中未聚合的单体、引发剂等杂质，再将离心得到。
5、的含荧光分子A的聚合物种子微球溶解于 50-100mL去离子水中待用； (2)向步骤(1)的聚合物种子微球溶液中加入10-60mmol的聚合单体1和1-5mmol的 pH响应性聚合单体2，室温和氮气保护下，机械搅拌30-60min，然后逐渐升温至70-85，加 入15mL含0.51.5mmol引发剂的水溶液，引发聚合，反应12-24h后得到核壳结构的聚合 物纳米微球；最后通过高速离心除去液相中未聚合的单体、引发剂等杂质，再将离心得到的 核壳结构聚合物纳米微球溶解于50-100mL去离子水中待用； (3)量取10-30mL步骤(2)得到的核壳纳米微球乳液，称取2-10mol的荧光分子B加 入到该。
6、核壳纳米微球乳液中，在30-40，氮气保护的条件下，磁力搅拌下反应3-8h；最后 通过高速离心除去液相未复合的荧光分子B，获得荧光分子A和B复合的双荧光核壳聚合物 纳米微球； 其中，聚合单体1是苯乙烯、氟代苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯； pH响应性聚合单体2是丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸纳或甲基丙烯酸二甲 氨基乙酯； 荧光分子A是稀土配合物RaXnYm、半导体纳米晶、罗丹明B或金属纳米簇；其中，Ra为 铕、铽、铥、镧、铒或镱；第一配体X是噻吩甲酰三氟丙酮、乙酰丙酮、二苯甲酰甲烷或水杨 酸，n1-3；第二配体Y是1,10-邻菲罗啉，m0-1； 荧光分子B是溴化(N,。
7、N,N-三乙基-3-(4-(1,2-二苯基-2-(4-(2-三乙基胺)乙氧 基)乙烯基)乙烯基)苯基)丙基胺、溴化2,2,2-(4,4,4-(2-(4-(3-s三乙胺) 丙基)苯基)1,1,2-三苯基乙烯基三氧)三(N,N,N-三乙基乙胺)、六苯基噻咯、硅杂环戊 二烯、1,1-二对-(二乙基氨甲基)苯-2,3,4,5-四苯并硅杂环戊二烯或3-(4-(1,2-二 苯基-2-(4-磺基乙氧基)苯基)乙烯基)丙基-1-磺酸钠。 2.一种pH响应的双荧光发射聚合物纳米微球，其特征在于：半导体纳米晶为CdTe、 CdSe、CdS、PbS、PbSe或PbTe。 3.一种pH响应的双荧光发射聚合物纳米微球，。
8、其特征在于：金属纳米簇为Au纳米簇 或Ag纳米簇。 4.一种pH响应的双荧光发射聚合物纳米微球，其特征在于：引发剂是过硫酸钾K 2 S 2 O 8 、 过硫酸铵(NH 4 ) 2 S 2 O 8 、过硼酸钠NaBO 3 4H 2 O、过硫酸钠Na 2 S 2 O 8 或偶氮二异丁氰AIBN。 5.一种在肿瘤组织检测中应用的荧光材料，其特征在于：是由权利要求14任何一 项所述的双荧光核壳聚合物纳米微球制备得到。 权 利 要 求 书CN 104004125 A 1/5页 3 一种 pH 响应的双荧光功能聚合物纳米微球及其在肿瘤组 织检测中的应用 技术领域 0001 本发明属于高分子材料技术领域，具。
9、体涉及一种pH响应的双荧光功能聚合物纳 米微球及其用于制备肿瘤组织检测中应用的荧光材料。 背景技术 0002 智能材料是对环境具有可感知、可响应并具有功能发现能力的新型材料。主要有 温度敏感、pH敏感、电敏感、光、磁及生物敏感性水凝胶材料。智能材料虽然研究、开发的历 史不长，但是由于其独特的性能不仅在工农业生产及日常生活方面得到了广泛应用，而且 对发展高新技术起着重要作用。近年来，智能材料的研究工作空前活跃，其中具有智能行为 的新型高分子及其水凝胶发展最为迅速。这类高分子能感知出周围环境条件，如温度、酸 度、压力、声波、电场、磁场、光波等变化，同时产生性能改变。因此，在化学传感器、转化器、 微。
10、型开关、人工肌肉、药物缓释、固定化酶等领域具有良好的应用前景。 0003 在过去几十年，细胞标记技术的发展备受关注，目前，多种可注射材料已经用于细 胞标记的研究中，包括：有机分子，荧光蛋白和无机量子点。但是他们自身都存在着一定的 局限性，有机分子的摩尔吸收系数较低，荧光蛋白的稳定性较差，而无机量子点由于其结构 中含有大量的重金属元素而具有很高的生物毒性，这些因素都限制着这些材料在细胞标记 中的应用。具有响应功能、荧光稳定，而且生物毒性较低荧光聚合物材料逐渐受到研究者的 重视，并在细胞标记中发挥着重要的作用。 0004 在传统荧光标记的检测中主要采用的是具有单一荧光颜色的成像材料，而生物环 境下。
11、背景荧光信号对其有很大程度上的干扰，导致检测效果容易出现误差。为了解决这个 问题，构筑双荧光发射的成像材料很有必要。特别是对于肿瘤组织和正常组织来说，pH值 是区别二者的重要生理指标。在肿瘤组织中pH呈酸性状态(pH6.5),而正常组织的pH呈 中性状态(pH7.4)。因此，制备一种具有pH响应性双发射功能的荧光纳米微球，来对正 常细胞和肿瘤细胞进行区别成像，进而实现对癌症进行诊断和治疗是医学界和化学界一个 值得期待的目标。 发明内容 0005 本发明的目的之一是提供一种pH响应的双荧光发射纳米微球。 0006 本发明首先合成一种复合荧光分子A的乳液微球，接着以得到的乳液微球为种 子，采用种子。
12、乳液聚合的方法，将具有pH响应功能的聚合物引入到微球的壳层，制备出核 壳结构的乳液微球。进一步将荧光分子B复合到微球的壳层中，得到具有pH响应的双荧光 发射的功能聚合物纳米微球。复合在壳层的荧光分子B与聚合物的作用受到环境pH的调 控，荧光性质变化；而组装在核内的荧光分子A的荧光性质不受pH的影响，保持荧光性质不 变。导致聚合物核壳纳米微球从酸性到碱性的不同pH值条件下呈现不同的荧光强度和荧 光颜色。在中性和碱性的条件下，纳米微球的核层荧光分子A(红光)和壳层荧光分子B(蓝 说 明 书CN 104004125 A 2/5页 4 光)同时发光，整体呈现二者的复合荧光(紫色)；随着pH降低，酸性条。
13、件下，壳层荧光分 子B的荧光逐渐减弱，而纳米微球核层的荧光分子A发光(红光)不变；基于纳米微球荧 光性质的pH响应功能，应用在组织检测中，正常组织(pH7.4)呈现紫色荧光，肿瘤组织 (pH6.5)呈现粉红色荧光，其可以用于制备荧光材料，从而在肿瘤细胞和组织检测、药物缓 释等领域具有广阔的应用前景。 0007 本发明所述的具有pH响应的双荧光发射聚合物纳米微球，其由如下步骤制备得 到： 0008 (1)称取2-10mmol的异丙基丙烯酰胺NIPAM单体溶解于100-200mL的去离子水 中，再加入10-50mmol的聚合单体1，110 -6 -510 -6 mol的荧光分子A，室温和氮气保护下。
14、， 机械搅拌30-60min；然后逐渐升温至60-70，加入5-15mL含0.3-0.6mmol引发剂的水溶 液，引发聚合，反应12-24h后得到含荧光分子A的聚合物种子微球；最后通过高速离心除去 液相中未聚合的单体、引发剂等杂质，再将离心得到的含荧光分子A的聚合物种子微球溶 解于50-100mL去离子水中待用； 0009 (2)将步骤(1)的聚合物微球继续进行种子乳液聚合：向步骤(1)的聚合物种子 微球溶液中加入10-60mmol的聚合单体1和1-5mmol的pH响应性聚合单体2，室温和氮气 保护下，机械搅拌30-60min，然后逐渐升温至70-85，加入15mL含0.51.5mmol引发剂。
15、 的水溶液，引发聚合，反应12-24h后得到核壳结构的聚合物纳米微球；最后通过高速离心 除去液相中未聚合的单体、引发剂等杂质，再将离心得到的核壳结构聚合物纳米微球溶解 于50-100mL去离子水中待用； 0010 (3)量取10-30mL步骤(2)得到的核壳纳米微球乳液，称取2-10mol的荧光分子 B加入到该核壳纳米微球乳液中，在30-40，氮气保护的条件下，磁力搅拌下反应3-8h；最 后通过高速离心除去液相未复合的荧光分子B，获得荧光分子A和B复合的双荧光核壳聚合 物纳米微球。 0011 本发明的目的是之二是提供一种在肿瘤组织检测中应用的荧光材料，其是以前面 所述的双荧光核壳聚合物纳米微球。
16、为主要成份制备得到。 0012 在裸鼠的皮下组织中接种肿瘤细胞(舌鳞癌细胞、宫颈癌细胞)，7天后细胞经过 扩散增殖形成肿瘤组织后，将步骤(3)得到的双荧光核壳聚合物纳米微球配制成浓度为 1-5mg/mL的水溶液，量取10-40L分别注射入裸鼠的肿瘤组织和正常的皮下组织，24h后 分别进行切片处理，然后通过激光共聚焦显微镜进行成像。 0013 上述方法中，聚合单体1是苯乙烯(St)、氟代苯乙烯(F-St)、甲基丙烯酸甲酯 (MMA)或甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)； 0014 上述方法中，pH响应性聚合单体2是丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸甲酯 (MA)、甲基丙烯酸纳(NaMA)或。
17、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)； 0015 上述方法中，引发剂是过硫酸钾(K 2 S 2 O 8 )、过硫酸铵(NH 4 ) 2 S 2 O 8 )、过硼酸钠 (NaBO 3 4H 2 O)、过硫酸钠(Na 2 S 2 O 8 )或偶氮二异丁氰(AIBN)； 0016 上述方法中，荧光分子A可以是稀土配合物RaXnYm，其中稀土离子Ra可以是：铕 (Eu)、铽(Tb)、铥(Tm)镧(La)、铒(Er)、镱(Yb)；第一配体X可以是：噻吩甲酰三氟丙酮 (TTA)、乙酰丙酮(acac)、二苯甲酰甲烷(DBM)、水杨酸(sal)，n13的整数，表示配体 的数目；第二配体Y可以是1,10-邻菲。
18、罗啉(Phen)，m01的整数，表示配体的数目；荧 说 明 书CN 104004125 A 3/5页 5 光分子A还可以是半导体纳米晶(CdTe、CdSe、CdS、PbS、PbSe、PbTe、Ag 2 S)、罗丹明B(RhB)、 金属纳米簇(Au、Ag纳米簇)等； 0017 上述方法中，荧光分子B是溴化(N,N,N-三乙基-3-(4-(1,2-二苯 基-2-(4-(2-三乙基胺)乙氧基)乙烯基)乙烯基)苯基)丙基胺(TAPE)、溴化 2,2,2-(4,4,4-(2-(4-(3-s三乙胺)丙基)苯基)1,1,2-三苯基乙烯基三氧)三 (N,N,N-三乙基乙胺)(TTAPE)或六苯基噻咯(HPS)。
19、、硅杂环戊二烯(silacyclopentadiene) 及其衍生物1,1-二对-(二乙基氨甲基)苯-2,3,4,5-四苯并硅杂环戊二烯(A 2 HPS)、 3-(4-(1,2-二苯基-2-(4-磺基乙氧基)苯基)乙烯基)丙基-1-磺酸钠(TPE)。 0018 本发明具有如下优点：1、这种双荧光发射功能的纳米微球具有灵敏的pH响应功 能。其荧光强度和荧光颜色随环境pH智能调控。2、该响应性荧光纳米微球的尺寸小在纳 米级，适合应用于多种检测；3、该响应性荧光纳米微球的粒径尺寸可在100-500纳米可控； 4、所制备的pH响应荧光纳米微球的pH响应范围为4.0-7.6呈现不同荧光颜色；5、这种pH。
20、 响应荧光纳米微球在较宽的pH范围内具有很好的响应功能，是一种新型pH检测的光学器 件；6.这种pH响应荧光纳米微球可以通过荧光性质区分检测正常和癌细胞组织，获得生物 检测功能和应用。 附图说明 0019 图1：为实施例1制备的EuPS/PNIPAM-PAA/TAPE核壳结构纳米微球的扫描电镜照 片；纳米微球粒径均匀大约为252nm。 0020 图2：为实施例1制备的EuPS/PNIPAM-PAA/TAPE核壳纳米微球在pH:4-7.6范围 变化的荧光光谱图；微球在波长468nm和613nm处具有优良的荧光发射性能，随着pH值减 小，在613nm处的荧光基本保持稳定，在468nm处的荧光强度逐。
21、渐降低。 0021 图3：为实施例1制备的EuPS/PNIPAM-PAA/TAPE核壳纳米微球随pH:7.6-4逐渐 减小，分别呈现紫色、青色、粉色、红色等不同的荧光颜色。表明这种荧光纳米微球具有灵敏 的pH响应性。 0022 图4：为实施例1制备的EuPS/PNIPAM-PAA/TAPE核壳纳米微球在正常组织和肿瘤 组织(舌鳞癌组织)的荧光共聚焦显微镜照片。在正常组织呈现紫色荧光，而在肿瘤组织 呈现粉色荧光。 具体实施方式 0023 实施例1： 0024 (1)称取.4.42mmol的NIPAM单体溶解于185mL去离子水中，加入到500mL的 三颈瓶中，加入1.410 -6 mol的稀土配。
22、合物Eu(TTA) 3 Phen，5mL的苯乙烯(St)，室温和氮 气保护下，机械搅拌(400rpm)30min，然后逐渐升温至70，加入15mL含引发剂过硫酸钾 (KPS)0.3mmol的水溶液于体系中，引发聚合。反应进行12h结束。得到含稀土配合物的聚 合物种子微球。通过高速离心(18500r/min)除去液相中未聚合的单体、引发剂等杂质，再 溶解于100mL去离子水中待用。 0025 (2)将步骤(1)得到的种子微球溶液缓慢倒入500mL的三颈瓶中，以此为种子，通 过种子乳液聚合合成EuPS/PNIPAM-PAA核壳微球，向体系中加入40mmol NIPAM，3mmol的 说 明 书CN。
23、 104004125 A 4/5页 6 AA，室温和氮气保护下，机械搅拌(300rpm)30min，然后逐渐升温至70，加入15mL含引发 剂过硫酸钾(KPS)0.3mmol的水溶液于体系中，引发聚合。反应进行12h结束，得到含稀土 配合物的核壳结构聚合物纳米微球。通过高速离心(18800r/min)除去液相未聚合的单体、 引发剂等杂质，溶解于100mL去离子水中待用。 0026 (3)量取10mL步骤(2)得到的EuPS/PNIPAM-PAA纳米微球倒入100mL的三颈瓶 中，称取微量的TAPE分子5.2mol放入核壳纳米微球乳液中，在35，氮气保护的条件下， 磁力搅拌反应3h。通过高速离心。
24、处理，除去液相未复合上的TAPE分子，获得荧光分子TAPE 和Eu(TTA) 3 Phen复合的双荧光核壳纳米微球。将得到的荧光纳米微球溶于25mL水中。 0027 (4)在裸鼠的皮下组织中接种舌鳞癌细胞，7天后细胞经过扩散增殖形成肿瘤组 织后，将步骤(3)得到的双荧光核壳聚合物纳米微球配制成浓度为2mg/mL的溶液，量取 20L分别注入肿瘤的裸鼠的肿瘤组织和正常的皮下组织，24h后分别进行切片处理，然后 通过激光共聚焦显微镜进行成像。 0028 实施例2： 0029 (1)称取5mmol的NIPAM单体溶解于100mL去离子水中，加入到500mL的三颈瓶 中，加入1.510 -6 mol的C。
25、dTe，5mL的氟代苯乙烯(F-St)，室温下在氮气保护下，机械搅拌 (400rpm)30min，然后逐渐升温至70，加入10mL含引发剂过硫酸钠(Na 2 S 2 O 8 )0.3mmol的水 溶液于体系中，引发聚合，反应进行12h结束。得到的含CdTe的聚合物种子微球通过高速 离心(18500r/min)除去液相中未聚合的单体、引发剂等杂质，再溶解于100mL去离子水中 待用。 0030 (2)将步骤(1)得到的种子微球乳液缓慢倒入500mL的三颈瓶中，以此为种子， 通过种子乳液聚合合成CdTe-PFS/PNIPAM-PMAA核壳微球，向体系中加入45mmol NIPAM， 3.5mmol。
26、的MAA，室温和氮气保护下，机械搅拌(300rpm)30min，然后逐渐升温至70，加入 15mL含引发剂过硫酸钠(Na 2 S 2 O 8 )0.6mmol的水溶液于体系中，引发聚合。反应进行12h结 束，得到含CdTe的核壳结构聚合物纳米微球。通过高速离心(18800r/min)除去液相未聚 合的单体、引发剂等杂质，溶解于100mL去离子水中待用。 0031 (3)量取10mL步骤(2)得到的CdTe-PFS/PNIPAM-PMAA纳米微球倒入100mL的三 颈瓶中，称取微量的d-TPE分子5.2mol放入核壳纳米微球乳液中，在35，氮气保护的条 件下，磁力搅拌反应5h。通过高速离心处理，。
27、除去液相中未复合的HPS分子，获得荧光分子 HPS和CdTe复合的双荧光核壳结构聚合物纳米微球。将得到的荧光纳米微球溶于350mL水 中。 0032 (4)在裸鼠的皮下组织中接种舌鳞癌细胞，7天后细胞经过扩散增殖形成肿瘤组 织后，将步骤(3)得到的双荧光核壳聚合物纳米微球配制成浓度为3mg/mL的溶液，量取 30L分别注入肿瘤的裸鼠的肿瘤组织和正常的皮下组织，24h后分别进行切片处理，然后 通过激光共聚焦显微镜进行成像。 0033 实施例3： 0034 (1)称取5mmol的NIPAM单体溶解于190mL去离子水中，加入到500mL的三颈瓶中， 加入210 -6 mol的RhB，5mL的苯乙烯。
28、(St)，室温和氮气保护下，机械搅拌(400rpm)30min， 然后逐渐升温至70，加入10mL含引发剂过硫酸铵(APS)0.3mmol的水溶液于体系中，引发 聚合，反应进行12h结束。得到的含RhB的聚合物种子微球。通过高速离心(18500r/min) 说 明 书CN 104004125 A 5/5页 7 除去液相未聚合的单体、引发剂等杂质，再溶解于100mL去离子水中待用。 0035 (2)将步骤(1)得到的种子微球溶液缓慢倒入500mL的三颈瓶中，并以此为种 子，通过种子乳液聚合合成RhB-PS/PNIPAM-PMAA核壳微球，向体系中加入40mmol NIPAM， 3.2mmol的M。
29、AA，室温和氮气保护下，机械搅拌(300rpm)30min，然后逐渐升温至70，加入 15mL含引发剂过硫酸铵(APS)0.6mmol的水溶液于体系中，引发聚合。反应进行12h结束， 得到含RhB的核壳结构聚合物纳米微球。通过高速离心(18800r/min)除去液相未聚合的 单体、引发剂等杂质，溶解于100mL去离子水中待用。 0036 (3)量取10mL步骤(2)得到的RhB-PS/PNIPAM-PMAA纳米微球倒入100mL的三颈 瓶中，称取微量的d-TPE分子5.2mol放入核壳纳米微球乳液中，在35，氮气保护的条 件下，磁力搅拌反应5h。通过高速离心处理，除去液相未复合的TTAPE分子，获得荧光分子 TTAPE和RhB复合的双荧光核壳聚合物纳米微球。将得到的荧光纳米微球溶于30mL水中。 0037 (4)在裸鼠的皮下组织中接种宫颈癌细胞，7天后细胞经过扩散增殖形成肿瘤组 织后，将步骤(3)得到的双荧光核壳聚合物纳米微球配制成浓度为5mg/mL的溶液，量取 10L分别注入肿瘤的裸鼠的肿瘤组织和正常的皮下组织，24h后分别进行切片处理，然后 通过激光共聚焦显微镜进行成像。 说 明 书CN 104004125 A 1/2页 8 图1 图2 说 明 书 附 图CN 104004125 A 2/2页 9 图3 图4 说 明 书 附 图CN 104004125 A 。