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1、(10)申请公布号 CN 103013493 A (43)申请公布日 2013.04.03 C N 1 0 3 0 1 3 4 9 3 A *CN103013493A* (21)申请号 201210441256.7 (22)申请日 2012.11.07 C09K 11/06(2006.01) C07F 5/02(2006.01) G01N 21/76(2006.01) (71)申请人中国科学院理化技术研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村东路29 号 (72)发明人陈玉哲 牛丽亚 杨清正 吴骊珠 佟振合 (74)专利代理机构北京正理专利代理有限公司 11257 代理人张文祎 (54) 。
2、发明名称 一种可选择性检测生物巯基化合物的荧光化 学传感器、制备方法及应用 (57) 摘要 一种可选择性检测生物巯基化合物的荧光化 学传感器，其特征在于，它具有如下所示的结构 式：式中，R为以下结构中 的一种：本发 明的荧光化学传感器具有所用原料易得，合成方 法简单，反应条件容易控制等优点，并且产物分子 量子产率高，能选择性识别含巯基化合物，并将半 胱氨酸与谷胱甘肽和同型半胱氨酸区分开来，灵 敏度高。 (51)Int.Cl. 权利要求书3页 说明书9页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 9 页 附图 4 页 1/3页 2 1.一种。
3、可选择性检测生物巯基化合物的荧光化学传感器，其特征在于，它具有如下所 示的结构式： 式中，R为以下结构中的一种： 2.如权利要求1所述的式（）荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步 骤： 称取BODIPY主体化合物溶于乙腈中，加入对硝基苯硫酚和三乙胺，室温下搅拌，得到 式（）所示的荧光传感器分子； 所述BODIPY主体化合物的结构式为： 3.根据权利要求2所述的式（）荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下 步骤： 称取1摩尔当量的BODIPY主体化合物溶于乙腈中，加入1.5-2摩尔当量的对硝基苯硫 酚和2-10摩尔当量的三乙胺，室温下搅拌5-15分钟，得到式（）所示的荧光传感。
4、器分子。 4.如权利要求1所述的式（）荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步 骤： 称取BODIPY主体化合物溶于乙腈中，通N 2 ，加入对硝基苯酚和三乙胺，N 2 保护下回流， 得到式（）所示的荧光传感器分子； 所述BODIPY主体化合物的结构式为： 权 利 要 求 书CN 103013493 A 2/3页 3 5.根据权利要求4所述的式（）荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下 步骤： 称取1摩尔当量的BODIPY主体化合物溶于乙腈中，通N 2 ，加入2-10摩尔当量的对硝基 苯酚和5-20摩尔当量的三乙胺，N 2 保护下回流3-10小时，得到式（）所示的荧光传感器 分子。
5、。 6.根据权利要求3或5所述的荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，所述BODIPY 主体化合物，它的合成包括以下步骤： 向1摩尔当量对甲基苯甲醛和20-25摩尔当量吡咯的混合溶液中缓慢滴加 0.08-0.12摩尔当量的三氟乙酸，室温下搅拌，得到B； 将1摩尔当量B溶于四氢呋喃中，通N 2 ，与2-2.5摩尔当量N-氯代丁二酰亚胺 在-78的条件下反应，得到C； 将1摩尔当量C溶于二氯甲烷中，通N 2 ，接着将1-1.2摩尔当量二氯二氰基对苯醌的 二氯甲烷溶液逐滴加入其中，室温下反应，得到D； 将1摩尔当量D溶于二氯甲烷中，加入8-10摩尔当量三乙胺，室温搅拌，接着加入 15-20摩尔当量三。
6、氟化硼乙醚，在黑暗无光条件下反应，得到E； 称取1摩尔当量的E溶于甲苯中，通N 2 ，加入0.2-0.3摩尔当量的碘化亚铜和 0.12-0.15摩尔当量的双三苯基磷二氯化钯，然后加入1-1.5摩尔当量的三甲基硅乙炔和 15-20摩尔当量的三乙胺，在65条件下反应，得到化合物F； 称取1摩尔当量的F和2-10摩尔当量的G（市售）溶于二氯甲烷中，加入0.1-2摩 尔当量的碘化亚铜，通N 2 ，加入1-1.2摩尔当量的四丁基氟化铵，在0条件下反应，得到 BODIPY主体化合物。 7.根据权利要求6所述的荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，所述BODIPY主体 化合物，它的合成包括以下步骤： 向1摩。
7、尔当量对甲基苯甲醛和20-25摩尔当量吡咯的混合溶液中缓慢滴加 0.08-0.12摩尔当量的三氟乙酸，室温下搅拌10-15分钟，得到B； 将1摩尔当量B溶于四氢呋喃中，通N 2 ，与2-2.5摩尔当量N-氯代丁二酰亚胺 在-78的条件下反应2-3小时，得到C； 将1摩尔当量C溶于二氯甲烷中，通N 2 ，接着将1-1.2摩尔当量二氯二氰基对苯醌的 二氯甲烷溶液逐滴加入其中，室温下反应1-1.5小时，得到D； 将1摩尔当量D溶于二氯甲烷中，加入8-10摩尔当量三乙胺，室温搅拌1-1.5小时， 权 利 要 求 书CN 103013493 A 3/3页 4 接着加入15-20摩尔当量三氟化硼乙醚，在黑。
8、暗无光条件下反应12-15小时，得到E； 称取1摩尔当量的E溶于甲苯中，通N 2 ，加入0.2-0.3摩尔当量的碘化亚铜和 0.12-0.15摩尔当量的双三苯基磷二氯化钯，然后加入1-1.5摩尔当量的三甲基硅乙炔和 15-20摩尔当量的三乙胺，在65条件下反应1-3小时，得到化合物F； 称取1摩尔当量的F和2-10摩尔当量的G（市售）溶于二氯甲烷中，加入0.1-2摩尔 当量的碘化亚铜，通N 2 ，加入1-1.2摩尔当量的四丁基氟化铵，在0条件下反应5-10小时， 反应混合物溶液用饱和食盐水洗涤2-3次，有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去 二氯甲烷，剩余物进行柱层析，得到BODIPY主体。
9、化合物。 8.如权利要求17任一所述的荧光化学传感器的应用，其特征在于，所述荧光化学传 感器能检测含巯基化合物。 9.根据权利要求8所述的荧光化学传感器的应用，其特征在于，所述荧光化学传感器 能将半胱氨酸与谷胱甘肽和同型半胱氨酸区分开来。 权 利 要 求 书CN 103013493 A 1/9页 5 一种可选择性检测生物巯基化合物的荧光化学传感器、 制 备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及一种可选择性检测生物巯基化合物的荧光化学传感器、制备方法及应 用，属于化学传感器技术领域。 背景技术 0002 含巯基的生物分子，如半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH），在 。
10、维持生物体系稳定方面发挥着重要作用。半胱氨酸参与体内生物蛋白酶和体内氧化还原反 应过程，其缺乏会导致如神经中毒、肝损伤、头发脱色、水肿等病症的发生；作为蛋氨酸代谢 的中间产物，同型半胱氨酸是引起血管硬化的一个重要因素，血浆中同型半胱氨酸的含量 偏高可能引发神经管缺陷、骨质疏松症、阿兹海默症、心血管病等一系列疾病；谷胱甘肽作 为细胞内含量最多的含巯基生物分子，是体内重要抗氧化剂，它可以清除体内过量的自由 基，在防卫机体免受自由基伤害、抗肿瘤及抗衰老等方面均具有重要作用。由于它们在生物 系统中扮演着非常重要的角色，所以对它们进行有效的检测显得尤为重要。 0003 检测含巯基化合物传统的分析方法包括。
11、：质谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、 电化学方法等。但这些方法普遍存在操作复杂、仪器昂贵等缺点。而荧光化学传感器由于 其具有灵敏度高、操作简单、成本低廉，以及可以进行原位和活体检测等优点被广泛应用于 含巯基化合物的检测中。近年来，一些反应型硫醇传感器相继被报道，但由于含巯基化合物 结构和性质的相似，能将半胱氨酸和同型半胱氨酸、谷胱甘肽这三种物质区分开来的传感 器分子还非常少。 发明内容 0004 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种可选择性检测生物巯基化合物的荧 光化学传感器，该传感器能将半胱氨酸与同型半胱氨酸和谷胱甘肽区分开来。 0005 本发明要解决的第二个技术问题是一种可选择性检测生。
12、物巯基化合物的荧光化 学传感器的制备方法。 0006 本发明要解决的第三个技术问题是一种可选择性检测生物巯基化合物的荧光化 学传感器的应用。 0007 本发明提供一种可选择性检测生物巯基化合物的荧光化学传感器，它具有如下所 示的结构式： 0008 说 明 书CN 103013493 A 2/9页 6 0009 式中，R为以下结构中的一种： 0010 0011 式（）荧光化学传感器的制备方法，包括如下步骤： 0012 称取BODIPY主体化合物溶于乙腈中，加入对硝基苯硫酚和三乙胺，室温下搅拌， 得到式（）所示的荧光传感器分子； 0013 所述BODIPY主体化合物的结构式为： 0014 0015。
13、 式（）荧光化学传感器的制备方法，包括如下步骤： 0016 称取BODIPY主体化合物溶于乙腈中，通N 2 ，加入对硝基苯酚和三乙胺，N2保护下 回流，得到式（）所示的荧光传感器分子； 0017 所述BODIPY主体化合物的结构式为： 0018 说 明 书CN 103013493 A 3/9页 7 0019 一种可选择性检测生物巯基化合物的荧光化学传感器的制备方法，包括以下步 骤： 0020 式（）所示的荧光传感器分子的合成：称取1摩尔当量的BODIPY主体化合物 溶于乙腈中，加入1.5-2摩尔当量的对硝基苯硫酚和2-10摩尔当量的三乙胺，室温下搅拌 5-15分钟，减压蒸馏除去溶剂，残留物进行。
14、柱层析，得到式（）所示的荧光传感器分子； 0021 式（）所示的荧光传感器分子的合成：称取1摩尔当量的BODIPY主体化合物 溶于乙腈中，通N2，加入2-10摩尔当量的对硝基苯酚和5-20摩尔当量的三乙胺，回流3-10 小时，减压蒸馏除去溶剂，残留物进行柱层析得到式（）所示的荧光传感器分子； 0022 所述BODIPY主体化合物的结构式为： 0023 0024 它的合成可参考相关文献。 0025 例如：BODIPY主体化合物A的合成包括以下步骤： 0026 向1摩尔当量对甲基苯甲醛和20-25摩尔当量吡咯的混合溶液中缓慢滴加 0.08-0.12摩尔当量的三氟乙酸，室温下搅拌10-15分钟，得到。
15、B； 0027 将1摩尔当量B溶于四氢呋喃中，通N 2 ，与2-2.5摩尔当量N-氯代丁二酰亚胺 在-78的条件下反应2-3小时，得到C； 0028 将1摩尔当量C溶于二氯甲烷中，通N 2 ，接着将1-1.2摩尔当量二氯二氰基对苯 醌的二氯甲烷溶液逐滴加入其中，室温下反应1-1.5小时，得到D； 0029 将1摩尔当量D溶于二氯甲烷中，加入8-10摩尔当量三乙胺，室温搅拌1-1.5 小时，接着加入15-20摩尔当量三氟化硼乙醚，在黑暗无光条件下反应12-15小时，得到E； 0030 称取1摩尔当量的E溶于甲苯中，通N 2 ，加入0.2-0.3摩尔当量的碘化亚铜和 说 明 书CN 1030134。
16、93 A 4/9页 8 0.12-0.15摩尔当量的双三苯基磷二氯化钯，然后加入1-1.5摩尔当量的三甲基硅乙炔和 15-20摩尔当量的三乙胺，在65条件下反应1-3小时，得到化合物F 0031 称取1摩尔当量的F和2-10摩尔当量的G（市售）溶于二氯甲烷中，加入0.1-2 摩尔当量的碘化亚铜，通N 2 ，加入1-1.2摩尔当量的四丁基氟化铵，在0条件下反应5-10 小时。反应混合物溶液用饱和食盐水洗涤2-3次，有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸 馏除去二氯甲烷，剩余物进行柱层析，得到BODIPY主体化合物A。 0032 本发明提供一种可选择性检测生物巯基化合物的荧光化学传感器的应用，上述荧。
17、 光化学传感器可用来检测含巯基化合物。 0033 进一步地，所述可选择性检测生物巯基化合物的荧光化学传感器能够将半胱氨酸 与谷胱甘肽和同型半胱氨酸区分开来。 0034 所述荧光化学传感器用来检测含巯基化合物，是在乙腈/4-羟乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES）缓冲溶液（v/v=2/8,20mM,pH=7.4）中，用所述荧光化学传感器对含巯基化合物进行 检测。 0035 本发明具有以下优点： 0036 本发明的荧光化学传感器具有所用原料易得，合成方法简单，反应条件容易控制 等优点，并且产物分子量子产率高，能选择性识别含巯基化合物，并将半胱氨酸与谷胱甘肽 和同型半胱氨酸区分开来，灵敏度高。 附图说明 0。
18、037 图1为式所示荧光化学传感器(10mol/L)在乙腈/HEPES缓冲溶液（v/ v=2/8,20mM,pH=7.4）中对不同浓度的Cys响应的吸收光谱。 0038 图2为式所示荧光化学传感器在乙腈/HEPES缓冲溶液（v/v=2/8,20mM,pH=7.4） 中对不同浓度的Cys响应的荧光发射光谱。 0039 图3为式所示荧光化学传感器在乙腈/HEPES缓冲溶液（v/v=2/8,20mM,pH=7.4） 中对不同浓度的GSH响应的荧光发射光谱。 0040 图4为式所示荧光化学传感器在乙腈/HEPES缓冲溶液（v/v=2/8,20mM,pH=7.4） 中对不同浓度的Hcy响应的荧光发射光谱。
19、。 0041 图5为式所示荧光化学传感器在乙腈/HEPES缓冲溶液（v/v=2/8,20mM,pH=7.4） 中对Cys、GSH、Hcy和其他19种氨基酸响应的荧光发射光谱。 0042 图6为式所示荧光化学传感器在乙腈/HEPES缓冲溶液（v/v=2/8,20mM,pH=7.4） 对Cys、GSH、Hcy和其他19种氨基酸的选择性荧光发射光谱。 0043 图7为式所示荧光化学传感器在乙腈/HEPES缓冲溶液（v/v=2/8,20mM,pH=7.4） 中对Cys、GSH和Hcy的吸收光谱。 0044 图8为式所示荧光化学传感器在乙腈/HEPES缓冲溶液（v/v=2/8,20mM,pH=7.4） 。
20、中对Cys、GSH和Hcy的荧光发射光谱。 具体实施方式 0045 下面结合实施例和附图对本发明进行具体说明。 0046 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 说 明 书CN 103013493 A 5/9页 9 0047 实施例1 0048 一种可选择性检测生物巯基化合物的荧光化学传感器的制备方法、应用： 0049 （1）BODIPY主体化合物的合成： 0050 称取8g（66.6mmol）对甲基苯甲醛，加入100mL（1441mmol）吡咯，搅拌过程中 向其中缓慢滴加三氟乙酸0.5mL（6.7mmol），室温下搅拌10分钟，减压蒸馏除去吡咯得到黑 色粘稠液体，。
21、对残余物进行柱层析得到式（B）所示化合物： 0051 0052 将2g（8.5mmol）式B所示化合物溶于100mL四氢呋喃中，通N 2 ，冷却到-78， 加入2.3g（17.2mmol）N-氯代丁二酰亚胺，在-78条件下搅拌2小时，然后置于冰箱中冷 藏18小时，将溶剂蒸出，残留物用100mL二氯甲烷稀释，用蒸馏水洗3次，有机层用无水硫 酸镁干燥，过滤，柱层析得到式C所示化合物： 0053 0054 称取1.6g（5.3mmol）式C所示化合物溶解在50mL二氯甲烷中，通N 2 ，然后在搅 拌过程中将1.2g（5.3mmol）二氯二氰基对苯醌溶解于20mL二氯甲烷的溶液逐滴加入到化 合物C的溶。
22、液中，滴加完毕后室温下继续搅拌1小时。反应溶液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2 次，取有机层用无水硫酸镁干燥，减压除去二氯甲烷，残留物进行柱层析得到式D所示化合 物： 0055 说 明 书CN 103013493 A 6/9页 10 0056 称取1.1g（3.6mmol）式D所示化合物溶于120mL二氯甲烷中，加入5mL（36mmol） 三乙胺，室温下搅拌1小时，再加入7mL（57mmol）三氟化硼乙醚复合物，在黑暗无光条件下 搅拌12小时，反应溶液用蒸馏水洗涤2次，有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去 溶剂，残留物进行柱层析，得到式E所示化合物： 0057 0058 称取500mg（1.4m。
23、mol）式E所示化合物溶于15mL甲苯中，加入55mg（0.28mmol） 碘化亚铜和140mg（0.2mmol）双三苯基磷二氯化钯，通N 2 ，加入200mg（2.1mmol）三甲基硅 乙炔和4mL（28mmol）三乙胺，在65条件下反应2小时，除去溶剂，柱层析得到式F所示化 合物： 0059 0060 称取100mg（0.25mmol）式F所示化合物和280mg（1.28mmol）化合物G（结 构式如下所示）溶于二氯甲烷中，通N 2 ，加入80mg（0.25mmol）四丁基氟化铵三水和48mg （0.25mmol）碘化亚铜，在0条件下反应5-10小时。反应混合物溶液用饱和食盐水洗涤 说 明。
24、 书CN 103013493 A 10 7/9页 11 2-3次，有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去二氯甲烷，剩余物进行柱层析，得到 BODIPY主体化合物A。 0061 0062 0063 （2）称取100mg（0.18mmol）BODIPY主体化合物A溶于乙腈中，加入55mg（0.36mmol） 对硝基苯硫酚和125L（0.9mmol）三乙胺，室温下搅拌5-15分钟。减压蒸馏除去溶剂，残 留物进行柱层析得到式（）所示的荧光传感器分子： 0064 0065 配制1mmol/L的式（）所示化合物的乙腈溶液。 0066 式（）所示化合物对Cys的吸收、发射光谱测试：使用乙腈/HEPES缓。
25、冲溶液（v/ v=2/8,20mM,pH=7.4）分别配制0、10、20、40、60、80、100、200、300、500mol/L的Cys溶液。 取2mL上述不同浓度的Cys溶液于10个比色皿中，向比色皿中加入20L式（）所示化合 物的乙腈溶液，所得式（）所示化合物溶液浓度为10mol/L；在37条件下反应40分钟 后检测溶液的吸收光谱，如图1所示；检测荧光发射光谱，如图2所示。 0067 式（）所示化合物对GSH的荧光发射光谱测试：使用乙腈/HEPES缓冲溶液（v/ v=2/8,20mM,pH=7.4）分别配制0、10、20、40、60、80、100、150、200、300mol/L的GS。
26、H溶液。 说 明 书CN 103013493 A 11 8/9页 12 取2mL上述不同浓度的GSH溶液于10个比色皿中，向比色皿中加入20L式（）所示化合 物的乙腈溶液，所得式（）所示化合物溶液浓度为10mol/L；在37条件下反应40分钟 后检测溶液的荧光发射光谱，如图3所示。 0068 式（）所示化合物对Hcy的荧光发射光谱测试：使用乙腈/HEPES缓冲溶液（v/ v=2/8,20mM,pH=7.4）分别配制0、10、20、40、60、80、100、150、200、300、500mol/L的Hcy溶 液。取2mL上述不同浓度的Hcy溶液于11个比色皿中，向比色皿中加入20L式（）所示 化。
27、合物的乙腈溶液，所得式（）所示化合物溶液浓度为10mol/L；在37条件下反应40 分钟后检测溶液的荧光发射光谱，如图4所示。 0069 19种其他氨基酸及Cys、GSH和Hcy溶液的配制：使用乙腈/HEPES缓冲溶液（v/ v=2/8,20mM,pH=7.4）分别配制1mmol/L的甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨 酸（Leu）、异亮氨酸（IIe）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、天冬氨酸（Asp）、 组氨酸（His）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）、谷氨酰胺（Gln）、甲硫氨酸 （Met）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（。
28、Thr）、丝氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、Cys、GSH和Hcy溶液。 0070 式（）所示化合物对含巯基化合物以及Cys选择性响应的荧光发射光谱测试：取 2mL上述氨基酸、Cys、GSH、Hcy以及空白溶液于23个比色皿中，向比色皿中分别加入20L 式（）所示化合物的乙腈溶液，所得式（）所示化合物溶液浓度为10mol/L；37条件 下1小时后检测荧光发射光谱，如图5所示；用图5中565nm波长处的荧光强度作图，如图 6所示。从图5和图6中可以看出，式（）所示化合物对含巯基化合物有选择性响应，且能 够把Cys与GSH和Hcy区分开来。 0071 实施例2 0072 一种选择性检测生物巯基化。
29、合物的荧光化学传感器的制备方法： 0073 （1）BODIPY主体化合物的合成：同实施例1； 0074 （2）称取100mg（0.18mmol）BODIPY主体化合物A溶于乙腈中，通N 2 ，加入125mg （0.9mmol）对硝基苯酚和250L（1.8mmol）三乙胺，N 2 保护下回流5小时。减压蒸馏除去 溶剂，残留物进行柱层析得到式（）所示的荧 0075 光传感器分子： 0076 0077 配制1mmol/L的式（）所示化合物的乙腈溶液。 0078 式（）所示化合物对Cys的吸收、发射光谱测试：使用乙腈/HEPES缓冲溶液（v/ 说 明 书CN 103013493 A 12 9/9页 1。
30、3 v=2/8,20mM,pH=7.4）分别配制1mmol/L的Cys、GSH和Hcy溶液和空白溶液。取2mL上述不 同溶液于4个比色皿中，向比色皿中加入20L式（）所示化合物的乙腈溶液，所得式（） 所示化合物溶液浓度为10mol/L；在37条件下1小时后检测溶液的吸收光谱，如图7所 示；检测荧光发射光谱，如图8所示。可以看出，式（）所示化合物对含巯基化合物有选择 性响应，且能够把Cys与GSH和Hcy区分开来。 0079 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，并非对本发明的实 施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它 不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方 案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。 说 明 书CN 103013493 A 13 1/4页 14 图1 图2 说 明 书 附 图CN 103013493 A 14 2/4页 15 图3 图4 说 明 书 附 图CN 103013493 A 15 3/4页 16 图5 图6 说 明 书 附 图CN 103013493 A 16 4/4页 17 图7 图8 说 明 书 附 图CN 103013493 A 17 。