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1、(10)申请公布号 CN 102827054 A (43)申请公布日 2012.12.19 C N 1 0 2 8 2 7 0 5 4 A *CN102827054A* (21)申请号 201210315692.X (22)申请日 2012.08.25 C07D 207/16(2006.01) C07K 14/765(2006.01) C07K 14/77(2006.01) C07K 16/44(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人河北农业大学 地址 071001 河北省保定市灵雨寺街289号 (72)发明人刘聚祥 王建平 王丽莉 张会彩 刘静 (74)专。
2、利代理机构保定市燕赵恒通知识产权代 理事务所 13121 代理人周献济 (54) 发明名称 一种L-羟脯氨酸的半抗原、人工抗原、单克 隆抗体及其制备方法与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种L-羟脯氨酸的半抗原、人 工抗原和单克隆抗体及其制备方法与应用。L-羟 脯氨酸的半抗原含有L-羟脯氨酸的分子结构，以 该半抗原与载体蛋白的连接物作为免疫原，可以 产生针对L-羟脯氨酸的抗体。因此，本发明提供 的L-羟脯氨酸半抗原可以制备L-羟脯氨酸的特 异性抗体，用于L-羟脯氨酸的免疫分析和筛选， 提高检测效率，降低检测成本。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书6页 (19)中华人民共和国国家。
3、知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1页 2 1.一种L-羟脯氨酸的半抗原，其分子结构式如式1所示： 式1。 2.一种如权利要求1所述的L-羟脯氨酸半抗原的制备方法，包括如下步骤， (a)将L-羟脯氨酸和对羟基苯甲醛按摩尔比为112在乙醇溶液中加热回流反应 14小时， (b)反应完全后，冷却，抽滤，水洗得到式1结构的L-羟脯氨酸的半抗原： 式1。 3.一种如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中所用L-羟脯氨酸 与对羟基苯甲醛的摩尔比为11，在乙醇中加热回流反应2小时。 4.一种L-羟脯氨酸的人工抗原，其分子结构式如式2所示： 式2。 5.。
4、如权利要求4所述的L-羟脯氨酸的人工抗原，其特征在于，所述的载体蛋白为卵清 蛋白或牛血清白蛋白。 6.如权利要求4或5所述L-羟脯氨酸的人工抗原的制备方法，包括如下步骤： (a)将式1结构的L-羟脯氨酸半抗原溶于蒸馏水中，得到溶液A，将N，N-羰基二咪唑 溶于无水丙酮，得到溶液B，所用式1结构的L-羟脯氨酸半抗原和N，N-羰基二咪唑的摩尔 比为138，将溶液A和溶液B混合搅拌反46小时，得到中间产物C； (b)将所述载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液D，将溶液C滴加到溶液D中， 搅拌反应1114小时，得到式2结构的人工抗原。 7.一种L-羟脯氨酸的单克隆抗体，是能与权利要求4或5所述的L。
5、-羟脯氨酸的人工 抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。 8.如权利要求7所述的L-羟脯氨酸的单克隆抗体的应用，用于L-羟脯氨酸的免疫检 测。 权 利 要 求 书CN 102827054 A 1/6页 3 一种 L- 羟脯氨酸的半抗原、 人工抗原、 单克隆抗体及其制 备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种L-羟脯氨酸的半抗原、人工抗原和单克 隆抗体及其制备方法与应用。 背景技术 0002 胶原蛋白存在于动物的皮肤、骨头、跟腱、软骨、血管和牙齿中，约占哺乳动物总蛋 白的四分之一，将胶原蛋白水解即可制成动物水解蛋白。动物胶原水解蛋白掺入乳及乳制 品后不但会影响口感和风。
6、味，并使氨基酸的比例不合理，营养价值降低，且不易消化，使得 人体吸收利用率降低。有些动物水解蛋白是利用废料、垃圾及毛发等加工成的蛋白质，价格 低廉，含有致癌物、重金属、大量杂菌，尤其“鞣革”下角废料中含有的重金属铬，如果被人体 吸收蓄积，可导致关节疏松、关节肿大，造成人体重金属中毒，对人体危害极大。为此，中国 卫生部将“革皮水解物”列入第二批“食品中可能违法添加的非食用物质名单”。 0003 L-羟脯氨酸是动物胶原蛋白中所特有的氨基酸，在胶原蛋白中含量约10.0 13.4，而在其他蛋白中则不存在。利用这一特性就可进行胶原水解蛋白的监控，即通过检 测L-羟脯氨酸来鉴定乳与乳制品中是否添加了动物胶。
7、原水解蛋白。 0004 目前，针对L-羟脯氨酸的测定方法主要有比色法、高效液相色谱法、高效液相色 谱-质谱联用法、氨基酸自动分析仪测定法等。但是，以上方法测定乳及乳制品中的L-羟脯 氨酸，各有不足。比色法特异性不强、操作繁琐、精密度较差，测量结果易受多种因素影响。 高效液相色谱法需要柱前衍生化，操作复杂。高效液相色谱-质谱联用法和氨基酸自动分 析仪测定法的耗材贵、成本高使不少实验室望而止步。 0005 而免疫分析方法有很高的精确度、灵敏性和特异性，且对技术要求不高，具有检测 时间短，适用于大批量测定等优点。到目前为止，还没有文献报道采用免疫法检测L-羟脯 氨酸。制备针对L-羟脯氨酸的特异性抗体。
8、，可以为建立针对L-羟脯氨酸的免疫检测法或 研发快速检测产品，开展乳制品中水解蛋白快速现场检测和大规模普查奠定基础。 发明内容 0006 本发明的目的之一是提供一种L-羟脯氨酸的半抗原。 0007 本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的： 0008 一种L-羟脯氨酸的半抗原，其分子结构式如式1所示： 0009 0010 式1。 说 明 书CN 102827054 A 2/6页 4 0011 本发明的目的之二是提供上述L-羟脯氨酸半抗原的制备方法。 0012 一种L-羟脯氨酸的半抗原的制备方法，包括如下步骤， 0013 (a)将L-羟脯氨酸和对羟基苯甲醛的摩尔比设置为112，在乙醇溶液中加 热。
9、回流反应14小时， 0014 (b)反应完全后，冷却，抽滤，水洗得到式1结构的L-羟脯氨酸半抗原： 0015 0016 式1。 0017 一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤(a)中所用L-羟脯氨酸与对羟基苯甲 醛的摩尔比为11，在乙醇中加热回流反应2小时。 0018 本发明的目的之三是提供一种L-羟脯氨酸的人工抗原。 0019 本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的： 0020 一种L-羟脯氨酸的人工抗原，由前述的L-羟脯氨酸半抗原与载体蛋白结合而成， 其分子结构式如式2所示： 0021 0022 式2。 0023 一种优选技术方案，其特征在于：所述的载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。 。
10、0024 本发明的目的之四是提供上述L-羟脯氨酸的人工抗原的制备方法。 0025 L-羟脯氨酸人工抗原的制备方法，包括如下步骤： 0026 (a)将式1结构的L-羟脯氨酸的半抗原溶于蒸馏水中，得到溶液A，将N，N-羰基 二咪唑溶于无水丙酮，得到溶液B，所用式1结构的L-羟脯氨酸半抗原和N，N-羰基二咪唑 的摩尔比为1：38，将溶液A和溶液B混合搅拌反应46小时，得到中间产物C； 0027 (b)将所述载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液D，将溶液C滴加到溶液 D中，搅拌反应1114小时，得到式2结构的人工抗原。 0028 本发明的目的之五是提供一种L-羟脯氨酸的单克隆抗体。 0029 本发。
11、明的上述目的是通过以下技术方案达到的： 0030 一种L-羟脯氨酸的单克隆抗体，是能与前述的L-羟脯氨酸的人工抗原发生特异 性免疫反应的免疫球蛋白。 0031 本发明的目的之六是提供上述L-羟脯氨酸单克隆抗体的应用。 0032 本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的： 0033 所述单克隆抗体用于L-羟脯氨酸的免疫检测。 0034 L-羟脯氨酸的分子结构比较简单，直接与载体蛋白连接作为免疫原去免疫动物不 会产生特异性的抗体。因此，必须要将L-羟脯氨酸的结构进行复杂化，即增大分子量、扩大 说 明 书CN 102827054 A 3/6页 5 分子结构。上述基于L-羟脯氨酸的半抗原含有L-羟脯氨。
12、酸的分子结构，以该半抗原与载 体蛋白连接制备免疫原，可以产生针对L-羟脯氨酸的抗体。因此，本发明提供的L-羟脯氨 酸化合物可以制备L-羟脯氨酸的特异性抗体，用于L-羟脯氨酸的免疫分析和筛选，提高检 测效率，降低检测成本。 0035 下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的 限制。 具体实施方式 0036 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业渠道获得。 0037 实施例1 0038 实验1：式1结构的半抗原的合成实例1 0039 25mL圆底烧瓶中加入131mg(0.001mol)L-羟脯氨酸和122m。
13、g(0.001mol)对羟 基苯甲醛； 0040 加入4mL无水乙醇溶液和数滴乙酸，回流反应2小时，抽干，得产物175.9mg，产 率70。 0041 0042 式1。 0043 该产物熔点245；红外光谱(IR)表征数据：(KBr)V max 3284，3300-2450，3137， 2950，2732，1639，1600，1480，1400，1321，1068，962cm -1 。与L-羟脯氨酸的红外数据比较，多 出了苯环和-CO-N键。 0044 实验2：式1结构的半抗原的合成实例2 0045 25mL圆底烧瓶中加入131mg(0.001mol)L-羟脯氨酸和244mg(0.002mol。
14、)对羟 基苯甲醛； 0046 加入7mL无水乙醇溶液和数滴乙酸，回流反应4小时，抽干，得产物190.9mg，产 率76。 0047 产物结构与表征数据同上。 0048 实验3：式1结构的半抗原的合成实例3 0049 25mL圆底烧瓶中加入131mg(0.001mol)L-羟脯氨酸和183mg(0.0015mol)对羟 基苯甲醛； 0050 加入5mL无水乙醇溶液和数滴乙酸，回流反应1小时，抽干，得产物180.9mg，产 率72。 0051 产物结构与表征数据同上。 0052 实验4：式2结构的人工抗原的合成的实例1 0053 12.6mg(0.05mmol)上述制备的式1结构的化合物溶解于蒸馏。
15、水中，磁力搅拌使 说 明 书CN 102827054 A 4/6页 6 其完全溶解，得到溶液A，将40.5mg(0.25mmol)N，N-羰基二咪唑溶于3mL无水丙酮，得到溶 液B；将A溶液和B溶液混合磁力搅拌反应5小时，得到溶液C； 0054 将65mg(0.001mmol)牛血清白蛋白(BSA)溶解于5mL pH7.2的0.01moL/L的磷 酸缓冲溶液(PBS)中，得到溶液D，将上述溶液C逐滴加入到溶液D中，磁力搅拌反应12小 时； 0055 将上述反应液装入透析袋中，4用生理盐水溶液透析72小时，期间更换透析 液6次；倒掉透析液，将透析袋中的溶液进行离心，转速为4000rpm，时间5分。
16、钟，取上清液， 为式2结构的人工抗原，将式2结构的人工抗原分装于安培瓶中，-20保存。 0056 按照文献报道的2，4，6-三硝基苯磺酸法测定半抗原与载体蛋白的偶联比为 141，证明半抗原与载体蛋白已经偶联。2，4，6-三硝基苯磺酸能与蛋白中的游离氨基反 应，所得产物的浓度与紫外335nm处的吸光度成正比。控制人工抗原与未偶联的载体蛋白 浓度相等，分别与2，4，6-三硝基苯磺酸反应，产物的吸光度不同，说明载体蛋白中的一部 分游离氨基与半抗原发生了反应。以吸光度的差值计算半抗原与载体蛋白的偶联比。 0057 实验5：式2结构的人工抗原的合成的实例2 0058 12.6mg(0.05mmol)上述。
17、制备的式1结构的化合物溶解于蒸馏水中，磁力搅拌使 其 0059 完全溶解，得到溶液A，将24.3mg(0.15mmol)N，N-羰基二咪唑溶于3mL无水丙酮， 0060 得到溶液B；将A溶液和B溶液混合磁力搅拌反应4小时，得到溶液C； 0061 将81mg(0.00125mmol)牛血清白蛋白(BSA)溶解于5mLpH7.2的0.01moL/L的 磷酸缓冲溶液(PBS溶液)中，得到溶液D，将上述溶液C逐滴加入到溶液D中，磁力搅拌反 应11小时； 0062 将上述反应液装入透析袋中，20用生理盐水溶液透析48小时，期间更换透析 液6次；倒掉透析液，将透析袋中的溶液进行离心，转速为4000rpm，。
18、时间5分钟，取上清液， 为式2结构的人工抗原，将式2结构的人工抗原分装于安培瓶中，-20保存。 0063 实验6：式2结构的人工抗原的合成的实例3 0064 12.6mg(0.05mmol)上述制备的式1结构的化合物溶解于蒸馏水中，磁力搅拌使 其 0065 完全溶解，得到溶液A，将64.8mg(0.4mmol)N，N-羰基二咪唑溶于3mL无水丙酮， 0066 得到溶液B；将A溶液和B溶液混合磁力搅拌反应6小时，得到溶液C； 0067 将23mg(0.0005mmol)卵清蛋白溶(OA)解于5mL pH7.2的0.01moL/L的磷酸缓 冲溶液(PBS溶液)中，得到溶液D，将上述溶液C逐滴加入到。
19、溶液D中，磁力搅拌反应14小 时； 0068 将上述反应液装入透析袋中，20用生理盐水溶液透析84小时，期间更换透析 液6次；倒掉透析液，将透析袋中的溶液进行离心，转速为4000rpm，时间5分钟，取上清液， 为式2结构的人工抗原，将式2结构的人工抗原分装于安培瓶中，-20保存。 0069 实施例2：抗体的制备与鉴定 0070 1)免疫动物制备抗血清 0071 以上述式2结构的人工抗原作为免疫原分别免疫Balb/c小鼠，用0.15mol/L的 NaCl溶液将免疫原稀释成1mg/mL的浓度，加等量氟氏完全佐剂制成油包水的乳化剂，于 说 明 书CN 102827054 A 5/6页 7 Babl/。
20、c小鼠的背部皮内多点注射进行首免；间隔2周，取同样量抗原加等量氟氏不完全佐 剂乳化后进行背部皮下多点注射，为加强免疫；共加强免疫5次，最后一次加强免疫不加佐 剂，腹腔注射。 0072 最后一次免疫后3天将小鼠摘除眼球取血，每只小鼠可取血约2mL，将采集的血液 样本在4冰箱中放置5-6小时，然后5000rpm离心10分钟，分离血清。 0073 2)抗体的纯化 0074 采用辛酸-硫酸铵盐析法对上述步骤1)获得的抗血清进行纯化。辛酸在偏酸性 的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来，上清中只有IgG。实验设三次重复， 结果表明，采用上述方法IgG的回收率达90以上。 0075 3)抗血清最。
21、低检测限(LOD值)和半数抑制量(IC 50 )的检测 0076 用方阵滴定法确定上述步骤2)获得的抗体和上述实施例1制备的人工抗原的工 作浓度。 0077 用不同浓度的L-羟脯氨酸标准品溶液做实验溶液，浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、 0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8(标准品溶液的浓度单位为g/mL)。采用8组平行试验(n 8)。 0078 间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)：用上述工作浓度的式2结构的人工抗原包被 酶标板，将实验溶液与抗体溶液同时加入酶标板小孔中，同时设置零标准孔(将添加的实 验溶液用高纯水代替，其它一致)和空白对照孔(将添加的抗体溶液换成高纯。
22、水，其它一 致)，37温育0.5小时，倒出孔内液体，用洗涤液(10x PBST)洗涤2-5次，将酶标板倒置 在吸水纸上拍打；加入酶标二抗溶液于酶标板小孔中，37温育0.5小时，用洗涤液重复洗 3-5次，吸干；加入底物显色溶液到酶标板小孔中，室温下反应10-15分钟，用酶标仪在波长 450nm处测定吸光度值(OD)。以吸光度为纵坐标，以标准品实验溶液浓度的对数(Log)为 横坐标，绘制半对数标准曲线图。 0079 根据标准曲线得出10抑制量(LOD)和半数抑制量(IC 50 )。 0080 抑制率按下式计算； 0081 0082 式中：ODmax为不加标准品实验溶液时的吸光值(即零标准孔)，OD。
23、x为标准品浓 度为x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。 0083 结果表明，上述抗体对L-羟脯氨酸的半数抑制量(IC 50 )为0.2g/mL，最低检测限 (LOD)为0.05g/mL，在0.1-12.8g/mL范围内，抑制率与L-羟脯氨酸浓度的对数值呈显 著的线性关系，相关系数为r0.9984。 0084 4)抗体的特异性检测 0085 抗血清的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力 的比较。常用交叉反应率作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗体的特异性越好。 0086 将L-羟脯氨酸的几种类似物(脯氨酸、D-羟脯氨酸)进行系列稀释，然后与上述 步骤2)获得的抗体进行反应，制作标准曲线。在曲线上分别找出这几种类似物产生50抑 说 明 书CN 102827054 A 6/6页 8 制时的半数抑制量(IC 50 )，计算抗体与L-羟脯氨酸类似物的交叉反应率。 0087 交叉反应率()(L-羟脯氨酸的半数抑制量/其它类似物的半数抑制 量)100。 0088 实验设三次重复，取三次重复的平均值作为实验结果。结果表明，上述步骤2)获 得的抗体只识别L-羟脯氨酸，特异性很好，与脯氨酸和D-羟脯氨酸均没有交叉反应性。因 此，可以作为检测试剂对L-羟脯氨酸进行免疫分析。 说 明 书CN 102827054 A 。