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1、(10)申请公布号 CN 102851311 A (43)申请公布日 2013.01.02 C N 1 0 2 8 5 1 3 1 1 A *CN102851311A* (21)申请号 201210042295.X (22)申请日 2012.02.24 C12N 15/85(2006.01) C12N 15/873(2010.01) A61D 19/04(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (71)申请人浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38号 (72)发明人周继勇 缪云根 逄大欣 曹晶晶 金玉兰 欧阳红生 周芳 袁婷 (74)专利代理机构杭州求是。
2、专利事务所有限公 司 33200 代理人杜军 (54) 发明名称 一种抗猪圆环病毒2型病转基因猪的构建方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种抗猪圆环病毒2型病转基 因猪的构建方法。目前在该病的防治领域，从技 术上取得的效果上收效甚微。本发明方法首先设 计能有效阻止猪圆环病毒2型病增殖和复制的靶 向基因shRNA；其次获得能有效阻止猪圆环病毒2 型病感染的胚胎成纤维细胞克隆；然后借助核移 植、胚胎移植技术和常规育种技术培育抗圆环病 毒2型转基因猪；最后检测抗圆环病毒2型病转 基因猪基因组中目的插入基因。本发明从遗传的 角度根除猪圆环2型病毒的感染，减少养猪的疫 病控制成本，减少猪圆环病毒对环境。
3、的污染，为生 命科学研究提供合格的实验用猪，从根本改变疫 病控制的传统策略，开启一个疫病控制研究的新 时代。 (51)Int.Cl. 权利要求书3页 说明书5页 附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/3页 2 1.一种抗猪圆环病毒2型病转基因猪的构建方法，其特征在于如下步骤： 步骤(1).设计能有效阻止猪圆环病毒2型病增殖和复制的靶向基因shRNA； 1-1.根据PCV2型病毒的基因组序列，以Rep基因和Cap基因为目的基因，在每个目 的基因内选取一段19bp长的核酸序列；该核酸序列不在5和3非翻译区，且起始。
4、密码子 后75bp；将选取的19bp核酸序列，与猪的基因组进行比对，确定该19bp核酸序列是特异性 的，只针对目的基因，与其他基因没有相似性；根据以上原则设计针对Rep基因的靶向基因 shRNA 139对， 针对Cap基因的靶向基因shRNA 134对； 1-2.体外靶向基因shRNA活性检测；将合成的针对Rep基因和针对Cap基因的靶向 基因shRNA序列经退火反应形成具有粘性末端的双链，且直接连接到线性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上，构建成RNA干扰载体；将上述RNA干扰载体中的DNA，在转 染试剂脂质体2000介导下导入PK15细胞，转染24小。
5、时后对经转染的PK15细胞进行荧光 观察，对成功转染的PK15细胞接种PCV2型病毒，接毒4872小时后将上清悬液和PK15 细胞分开收集，通过免疫荧光的方法分别测上清悬液和PK15细胞中的病毒TCID 50 ，以病毒 TCID 50 值判断靶向基因shRNA活性及对PCV2型病毒的抑制作用，病毒TCID 50 值越大，靶向 基因shRNA活性弱，对PCV2型病毒的抑制作用越小； 所述的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体购置于Clonetech公司； 步骤(2).获得能有效阻止猪圆环病毒2型病感染的胚胎成纤维细胞克隆； 2-1. 构建抗猪圆环病毒2型病转基因载。
6、体；经步骤1-2筛选出有效阻止猪圆环病毒 2型病感染的靶向基因shRNA,构建抗猪圆环病毒2型病转基因载体pGK-zsGFP-shRNA和 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA； 2-2. 克隆胚胎成纤维细胞；将步骤2-1构建的抗猪圆环病毒2型病转基因载体 pGK-zsGFP-shRNA和PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA分别用转染试剂脂质体2000转染猪胚 胎成纤维细胞；转染24小时后，猪胚胎成纤维细胞经胰酶消化后用有限稀释法克隆；在荧 光显微镜下观察这些经克隆的猪胚胎成纤维细胞GFP的表达情况，选取含GFP的猪胚胎成 纤维细胞； 步骤(3) 借助核移植。
7、、胚胎移植技术和常规育种技术培育抗圆环病毒2型转基因猪； 3-1猪卵母细胞的采集和成熟培养；将猪的卵巢用39含双抗的磷酸缓冲液洗涤多 次，然后将卵巢放置于39水浴锅中，用带有18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上26mm 的卵泡，将抽取的卵泡液注入无菌捡卵杯中，用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗涤两次；在 实体显微镜下用捡卵针挑选出细胞质均匀，并包裹有两层以上致密卵丘细胞的卵丘卵母 细胞复合体，并将它放在卵母细胞成熟液中，在5%CO 2 ，39下培养4244小时，然后加入 透明质酸酶，漩涡振荡1分钟； 3-2制备供体细胞；将步骤2-2构建的表达GFP的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐中取 出，迅速进行复苏；。
8、复苏后，猪胚胎成纤维细胞长至8090%的汇合状态时，加入从培养箱 中取出胰酶消化细胞，制成细胞悬液；将细胞悬液分装到1.5ml的离心管中，用含10%血清 的PVA-TL-HEPES缓冲液洗一遍，然后离心力250g离心10分钟，重悬在0.5ml的磷酸缓 冲液中，如此处理后的猪胚胎成纤维细胞即为供体细胞，并放入4冰箱内备用；进行核移 植操作前20min，将制备好的供体细胞从冰箱中取出放入39培养箱中孵育，用移液枪吸 取10l的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，用石蜡油覆盖； 权 利 要 求 书CN 102851311 A 2/3页 3 3-3. 采用盲吸法为成熟卵母细胞去核，在直径100mm培养皿加。
9、入100l显微操作液 滴，再用矿物油覆盖，39预热后把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入显微操作液滴，然 后在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜上用内径2030m，外径120150m 的固定吸管吸持成熟卵母细胞，用内径2025m的去核/注射针使第一极体处于钟表4 点钟位置，并从3点钟处进针，吸取第一极体及其临近1030可能含有卵母细胞核的胞 质； 3-4. 去核的成熟卵母细胞的注核操作；在显微操作台培养皿的中央滴内置入去核的 成熟卵母细胞，每次置入1015个，培养皿中央滴周围的几个滴内置入供体细胞；首先 用内径为1520m的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台，将去核的成熟卵 母细胞置于。
10、视野下，并用固定针固定，用注核针拨动去核的成熟卵母细胞，找到步骤3-3去 核时在透明带留下的进针口，使进针口在3点钟位置并将内径为1520m的注射针通 过该进针口插入到透明带下，将供体细胞注入去核的成熟卵母细胞的卵周隙内，构成一个 卵-供体细胞复合体，而后缓慢抽出注核针，并整理透明带，使供体细胞与去核的成熟卵母 细胞膜相互接触，便于之后重组胚的融合； 3-5.融合；将卵-供体细胞复合体移入融合液中，洗涤三次后移入融合槽中，用毛细实 心玻璃管拨动卵-供体细胞复合体，使其接触面与电流方向垂直，然后对卵-供体细胞复合 体进行电击，电击参数为：120 volts，30us， 2puls；将激活后的卵-。
11、供体细胞复合体迅速 移入基础培养液中洗涤35次，然后置入39、 5%CO 2 、100%湿度培养箱中培养4小时； 3-6.胚胎移植入代孕母猪；选择发情的母猪，于手术当天早上对母猪禁食；手术前绑 定母猪，并采用戊巴比妥钠水溶液结合异氟烷方法麻醉；手术部位选择在倒数第二对乳头 中间部位，用清水清洗手术部位及四周，擦干后用碘酒对手术部位及四周进行消毒，消毒后 用75%酒精脱碘；盖上创巾布并暴露手术部位，沿腹中线依次切开皮肤、皮下肌肉，然后用 刀柄或大的止血钳钝性分离皮下脂肪和腹膜；用手探入腹腔，寻找到子宫和卵巢，并慢慢 牵引出腹腔，并用浸有37生理盐水的纱布给卵巢和子宫保温保湿；固定输卵管，将装有 。
12、卵供体细胞复合体的外径为23mm的玻璃管慢慢从输卵管口插入，经过12个弯曲之 后小心将胚胎吹入输卵管内，并慢慢撤出玻璃管，将输卵管伞重新包住卵巢，回复子宫和输 卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎；常规缝合腹腔，术后将受体母猪单独隔离，连续4天 使用抗生素消炎；每天仔细观察记录受体猪的生理情况，做好发情观察； 3-7. 获得抗圆环病毒2型病转基因猪；胚胎移植后，对未返情的受体猪于2830 天 时，进行首次超声波妊娠检测，之后每周定时检测一次，跟踪胎儿发育情况，直至克隆猪出 生； 步骤(4).抗圆环病毒2型病转基因猪基因组中目的插入基因检测； 4-1.抗圆环病毒2型病转基因猪基因组中绿色荧光蛋白GF。
13、P和新霉素抗性基因 Neomycin r 插入片段的检测；以获得的转基因猪脐带组织为材料抽提基因组，分别设计GFP 引物和Neomycin r 引物序列进行PCR扩增；PCR扩增的条件为94预变性5 分钟, 再以 94/45sec，55/45sec，72/200sec，共35个循环，最后72延长10分钟；有绿色荧光 表现的转基因猪均可从基因组中扩增获得GFP基因和Neomycin r 基因，表明该两基因分别 被重组到猪基因组中； 4-2.抗圆环病毒2型病转基因猪基因组中shRNA插入片段的检测；以获得的转 权 利 要 求 书CN 102851311 A 3/3页 4 基因猪脐带组织为材料抽提基。
14、因组，设计shRNA扩增正反引物序列：正向引物序列： AAGTAACAAAACTTTTATCG和反向引物序列：ATTCCTTCATATTTGCATA，进行PCR扩增，有荧光表 现的转基因猪均可从基因组中扩增获得shRNA基因。 权 利 要 求 书CN 102851311 A 1/5页 5 一种抗猪圆环病毒 2 型病转基因猪的构建方法 技术领域 0001 本发明属于转基因生物技术领域，具体涉及一种抗猪圆环病毒2型病转基因猪的 构建方法。 背景技术 0002 断奶仔猪多系统衰竭综合征（现名猪圆环病毒相关疾病）是1997年由加拿大学者 首先报道的一种新病，是目前在世界范围内广泛流行、对养猪业构成巨大。
15、威胁的一种免疫 抑制性病毒传染病。PCV2型病毒（Porcine Circovirus Type 2，即猪圆环病毒2型）在猪场 引起的极为普遍感染是我国猪场疫病复杂的重要原因，可以说它对养猪产业正常维持带来 了极大的困难，其对我国养猪产业的影响目前受到了仅次于高致病性蓝耳病的空前关注。 为此，PCV2型病毒感染是我国养猪业生产、与猪相关的生命科学研究与产品开发亟待解决 的重大问题，具有时间的紧迫性。 0003 虽然病毒学家和动物传染病学家付出了艰辛的努力，一直在寻求免疫控制PCV2 型病毒技术上的突破，面对猪群如此普遍的感染以及PCV2型病毒独特的生物学特性，目前 在该病的防治领域，从技术上取。
16、得的效果上收效甚微。转基因技术的发展，为其提供了新的 曙光。 发明内容 0004 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抗猪圆环病毒2型病转基因猪 的构建方法，来控制猪圆环病毒2型病感染和减少其危害。 0005 本发明方法实现步骤如下： 步骤(1).设计能有效阻止猪圆环病毒2型病增殖和复制的靶向基因shRNA。 0006 1-1.根据PCV2型病毒的基因组序列，以Rep基因和Cap基因为目的基因，在每个 目的基因内选取一段19bp长的核酸序列；该核酸序列不在5和3非翻译区，且起始密码 子后75bp；将选取的19bp核酸序列，与猪的基因组进行比对，确定该19bp核酸序列是特异 性的，只针对。
17、目的基因，与其他基因没有相似性；根据以上原则设计针对Rep基因的靶向基 因shRNA 139对， 针对Cap基因的靶向基因shRNA 134对。 0007 1-2.体外靶向基因shRNA活性检测；将合成的针对Rep基因和针对Cap基因 的靶向基因shRNA序列经退火反应形成具有粘性末端的双链，且直接连接到线性化的 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上，构建成RNA干扰载体；将上述RNA干扰载体中 的DNA，在转染试剂脂质体2000（Lipofectamine TM 2000，Invitrogen）介导下导入PK15细 胞，转染24小时后对经转染的PK15细胞进。
18、行荧光观察，对成功转染的PK15细胞接种PCV2 型病毒，接毒4872小时后将上清悬液和PK15细胞分开收集，通过免疫荧光的方法分别 测上清悬液和PK15细胞中的病毒TCID 50 ，以病毒TCID 50 值判断靶向基因shRNA活性及对 PCV2型病毒的抑制作用，病毒TCID 50 值越大，靶向基因shRNA活性弱，对PCV2型病毒的抑 制作用越小。 说 明 书CN 102851311 A 2/5页 6 0008 所述的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体购置于Clonetech公司。 0009 步骤(2).获得能有效阻止猪圆环病毒2型病感染的胚胎成纤维细胞克。
19、隆。 0010 2-1. 构建抗猪圆环病毒2型病转基因载体。经步骤1-2筛选出有效阻止猪圆环 病毒2型病感染的靶向基因shRNA,构建抗猪圆环病毒2型病转基因载体pGK-zsGFP-shRNA 和PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA（构建方法见专利号：ZL200910152602.8，发明名称：用 于生产转基因猪的piggyBac转座载体及其构建方法）。 0011 2-2. 克隆胚胎成纤维细胞。将步骤2-1构建的抗猪圆环病毒2型病转基因 载体pGK-zsGFP-shRNA和PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA分别用转染试剂脂质体2000 （Lipofe ct。
20、amine TM 2000，Invitrogen）转染猪胚胎成纤维细胞；转染24小时后，猪胚胎成 纤维细胞经胰酶消化后用有限稀释法克隆。在荧光显微镜下观察这些经克隆的猪胚胎成纤 维细胞GFP的表达情况，选取含GFP的猪胚胎成纤维细胞。 0012 步骤(3) 借助核移植、胚胎移植技术和常规育种技术培育抗圆环病毒2型转基因 猪。 0013 3-1猪卵母细胞的采集和成熟培养。将猪的卵巢用39含双抗的磷酸缓冲液 （Phosphate Buffered Saline，PBS）洗涤多次，然后将卵巢放置于39水浴锅中，用带有 18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上26mm的卵泡，将抽取的卵泡液注入无菌捡卵杯中。
21、， 用4-羟乙基哌嗪乙磺酸（PVA-TL-HEPES）缓冲液洗涤两次。在实体显微镜下用捡卵针挑选 出细胞质均匀，并包裹有两层以上致密卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体，并将它放在卵 母细胞成熟液中，在5%CO 2 , 39下培养4244小时，然后加入透明质酸酶，漩涡振荡1分 钟。 0014 3-2制备供体细胞。将步骤2-2构建的表达GFP的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐 中取出，迅速进行复苏。复苏后，猪胚胎成纤维细胞长至8090%的汇合状态时，加入从培 养箱中取出胰酶消化细胞，制成细胞悬液。将细胞悬液分装到1.5ml的离心管中，用含10% 血清的PVA-TL-HEPES缓冲液洗一遍，然后离心力250g离心。
22、10分钟，重悬在0.5ml的磷 酸缓冲液中，如此处理后的猪胚胎成纤维细胞即为供体细胞，并放入4冰箱内备用。进行 核移植操作前20min，将制备好的供体细胞从冰箱中取出放入39培养箱中孵育，用移液 枪吸取10l的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，用石蜡油覆盖。 0015 3-3. 采用盲吸法为成熟卵母细胞去核，在直径100mm培养皿加入100l显微 操作液滴，再用矿物油覆盖，39预热后把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入显微操作 液滴，然后在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜上用内径2030m，外径120 150m的固定吸管吸持成熟卵母细胞，用内径2025m的去核/注射针使第一极体处于 钟表4点钟。
23、位置，并从3点钟处进针，吸取第一极体及其临近1030可能含有卵母细胞 核的胞质。 0016 3-4. 去核的成熟卵母细胞的注核操作。在显微操作台培养皿的中央滴内置入去 核的成熟卵母细胞，每次置入1015个，培养皿中央滴周围的几个滴内置入供体细胞。首 先用内径为1520m的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台，将去核的成熟 卵母细胞置于视野下，并用固定针固定，用注核针拨动去核的成熟卵母细胞，找到步骤3-3 去核时在透明带留下的进针口，使进针口在3点钟位置并将内径为1520m的注射针通 过该进针口插入到透明带下，将供体细胞注入去核的成熟卵母细胞的卵周隙内，构成一个 说 明 书CN 10285。
24、1311 A 3/5页 7 卵-供体细胞复合体，而后缓慢抽出注核针，并整理透明带，使供体细胞与去核的成熟卵母 细胞膜相互接触，便于之后重组胚的融合。 0017 3-5.融合。将卵-供体细胞复合体移入融合液中，洗涤三次后移入融合槽中，用毛 细实心玻璃管拨动卵-供体细胞复合体，使其接触面与电流方向垂直，然后对卵-供体细胞 复合体进行电击，电击参数为：120 volts，30us， 2puls。将激活后的卵-供体细胞复合体 迅速移入基础培养液中洗涤35次，然后置入39、 5%CO 2 、100%湿度培养箱中培养4小 时。 0018 3-6.胚胎移植入代孕母猪。选择发情的母猪，于手术当天早上对母猪禁食。
25、。手术 前绑定母猪，并采用戊巴比妥钠水溶液结合异氟烷方法麻醉。手术部位选择在倒数第二对 乳头中间部位，用清水清洗手术部位及四周，擦干后用碘酒对手术部位及四周进行消毒，消 毒后用75%酒精脱碘。盖上创巾布并暴露手术部位，沿腹中线依次切开皮肤、皮下肌肉，然 后用刀柄或大的止血钳钝性分离皮下脂肪和腹膜。用手探入腹腔，寻找到子宫和卵巢，并慢 慢牵引出腹腔，并用浸有37生理盐水的纱布给卵巢和子宫保温保湿。固定输卵管，将装 有卵供体细胞复合体的外径为23mm的玻璃管慢慢从输卵管口插入，经过12个弯 曲之后小心将胚胎吹入输卵管内，并慢慢撤出玻璃管，将输卵管伞重新包住卵巢，回复子宫 和输卵管到腹腔，并撒入抗生。
26、素抗菌消炎。常规缝合腹腔，术后将受体母猪单独隔离，连续 4天使用抗生素消炎。每天仔细观察记录受体猪的生理情况，做好发情观察。 0019 3-7. 获得抗圆环病毒2型病转基因猪。胚胎移植后，对未返情的受体猪于28 30 天时，进行首次超声波妊娠检测，之后每周定时检测一次，跟踪胎儿发育情况，直至克隆 猪出生。 0020 步骤(4).抗圆环病毒2型病转基因猪基因组中目的插入基因检测。 0021 4-1.抗圆环病毒2型病转基因猪基因组中绿色荧光蛋白GFP和新霉素抗性基因 Neomycin r 插入片段的检测。以获得的转基因猪脐带组织为材料抽提基因组（模板），分别设 计GFP引物（CMV+GFP1689。
27、bp）和Neomycin r 引物序列（670bp）进行PCR扩增。PCR扩 增的条件为94预变性5 分钟, 再以 94/45sec，55/45sec，72/200sec，共35个 循环，最后72延长10分钟。有绿色荧光表现的转基因猪均可从基因组中扩增获得GFP基 因和Neomycin r 基因，表明该两基因分别被重组到猪基因组中。 0022 4-2.抗圆环病毒2型病转基因猪基因组中shRNA插入片段的检测。以获得的转 基因猪脐带组织为材料抽提基因组（模板），设计shRNA扩增正反引物序列：正向引物序列： AAGTAACAAAACTTTTATCG和反向引物序列：ATTCCTTCATATTTGC。
28、ATA（该序列包含载体序列LTR 和酶切位点，C5，U6启动子的序列，可扩增出310bp），进行PCR扩增，有荧光表现的转基因 猪均可从基因组中扩增获得shRNA基因。 0023 本发明有益效果如下： 抗猪圆环病毒2型病转基因猪的培育将从遗传的角度根除猪圆环病毒的感染，减少养 猪的疫病控制成本，减少猪圆环病毒对环境的污染，为生命科学研究提供合格的实验用猪， 同时，抗猪圆环病毒2型病转基因猪开发成功将从根本改变疫病控制的传统策略，开启一 个疫病控制研究的新时代。因此，利用转基因技术，从育种的角度开辟控制猪圆环病毒2型 感染和减少其危害的技术，是未来的重要发展趋势。 说 明 书CN 1028513。
29、11 A 4/5页 8 附图说明 0024 图1转基因重组载体pGK-zsGFP-shRNA图； 图2转基因猪基因组中扩增获得shRNA基因序列。 具体实施方式 0025 下面将结合附图对本发明作进一步说明。 0026 步骤(1).设计能有效阻止猪圆环病毒2型病增殖和复制的靶向基因shRNA； 1-1.根据PCV2型病毒的基因组序列，以Rep基因和Cap基因为目的基因，在每个目 的基因内选取一段19bp长的核酸序列；该核酸序列不在5和3非翻译区，且起始密码子 后75bp；将选取的19bp核酸序列，与猪的基因组进行比对，确定该19bp核酸序列是特异性 的，只针对目的基因，与其他基因没有相似性；根。
30、据以上原则设计针对Rep基因的靶向基因 shRNA 139对， 针对Cap基因的靶向基因shRNA 134对。 0027 1-2.体外靶向基因shRNA活性检测；将合成的针对Rep基因和针对Cap基因 的靶向基因shRNA序列经退火反应形成具有粘性末端的双链，且直接连接到线性化的 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上，构建成RNA干扰载体；将上述RNA干扰载体中 的DNA，在转染试剂脂质体2000（Lipofectamine TM 2000，Invitrogen）介导下导入PK15细 胞，转染24小时后对经转染的PK15细胞进行荧光观察，对成功转染的PK15细。
31、胞接种PCV2 型病毒，接毒4872小时后将上清悬液和PK15细胞分开收集，通过免疫荧光的方法分别 测上清悬液和PK15细胞中的病毒TCID 50 ，以病毒TCID 50 值判断靶向基因shRNA活性及对 PCV2型病毒的抑制作用，病毒TCID 50 值越大，靶向基因shRNA活性弱，对PCV2型病毒的抑 制作用越小。 0028 所述的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体购置于Clonetech公司。 0029 步骤(2).获得能有效阻止猪圆环病毒2型病感染的胚胎成纤维细胞克隆。 0030 2-1. 构建抗猪圆环病毒2型病转基因载体。经步骤1-2筛选出有效阻止猪。
32、圆环 病毒2型病感染的靶向基因shRNA,构建抗猪圆环病毒2型病转基因载体pGK-zsGFP-shRNA 和PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA（构建方法见专利号：ZL200910152602.8，发明名称：用 于生产转基因猪的piggyBac转座载体及其构建方法），如图1所示。 0031 2-2. 克隆胚胎成纤维细胞。将步骤2-1构建的抗猪圆环病毒2型病转基因 载体pGK-zsGFP-shRNA和PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA分别用转染试剂脂质体2000 （Lipofectamine TM 2000，Invitrogen）转染猪胚胎成纤维细胞；转染2。
33、4小时后，猪胚胎成 纤维细胞经胰酶消化后用有限稀释法克隆。在荧光显微镜下观察这些经克隆的猪胚胎成纤 维细胞GFP的表达情况，选取含GFP的猪胚胎成纤维细胞。 0032 步骤(3) 借助核移植、胚胎移植技术和常规育种技术培育抗圆环病毒2型转基因 猪； 3-1猪卵母细胞的采集和成熟培养。将猪的卵巢用39含双抗的磷酸缓冲液 （Phosphate Buffered Saline，PBS）洗涤多次，然后将卵巢放置于39水浴锅中，用带有 18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上26mm的卵泡，将抽取的卵泡液注入无菌捡卵杯中， 用4-羟乙基哌嗪乙磺酸（PVA-TL-HEPES）缓冲液洗涤两次。在实体显微镜下用捡。
34、卵针挑选 出细胞质均匀，并包裹有两层以上致密卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体，并将它放在卵 说 明 书CN 102851311 A 5/5页 9 母细胞成熟液中，在5%CO 2 , 39下培养4244小时，然后加入透明质酸酶，漩涡振荡1分 钟。 0033 3-2制备供体细胞。将步骤2-2构建的表达GFP的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐 中取出，迅速进行复苏。复苏后，猪胚胎成纤维细胞长至8090%的汇合状态时，加入从培 养箱中取出胰酶消化细胞，制成细胞悬液。将细胞悬液分装到1.5ml的离心管中，用含10% 血清的PVA-TL-HEPES缓冲液洗一遍，然后离心力250g离心10分钟，重悬在0.5ml的磷 酸。
35、缓冲液中，如此处理后的猪胚胎成纤维细胞即为供体细胞，并放入4冰箱内备用。进行 核移植操作前20min，将制备好的供体细胞从冰箱中取出放入39培养箱中孵育，用移液 枪吸取10l的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，用石蜡油覆盖。 0034 3-3. 采用盲吸法为成熟卵母细胞去核，在直径100mm培养皿加入100l显微 操作液滴，再用矿物油覆盖，39预热后把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入显微操作 液滴，然后在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜上用内径2030m，外径120 150m的固定吸管吸持成熟卵母细胞，用内径2025m的去核/注射针使第一极体处于 钟表4点钟位置，并从3点钟处进针，吸取第一极。
36、体及其临近1030可能含有卵母细胞 核的胞质。 0035 3-4. 去核的成熟卵母细胞的注核操作。在显微操作台培养皿的中央滴内置入去 核的成熟卵母细胞，每次置入1015个，培养皿中央滴周围的几个滴内置入供体细胞。首 先用内径为1520m的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台，将去核的成熟 卵母细胞置于视野下，并用固定针固定，用注核针拨动去核的成熟卵母细胞，找到步骤3-3 去核时在透明带留下的进针口，使进针口在3点钟位置并将内径为1520m的注射针通 过该进针口插入到透明带下，将供体细胞注入去核的成熟卵母细胞的卵周隙内，构成一个 卵-供体细胞复合体，而后缓慢抽出注核针，并整理透明带，使供体。
37、细胞与去核的成熟卵母 细胞膜相互接触，便于之后重组胚的融合。 0036 3-5.融合。将卵-供体细胞复合体移入融合液中，洗涤三次后移入融合槽中，用毛 细实心玻璃管拨动卵-供体细胞复合体，使其接触面与电流方向垂直，然后对卵-供体细胞 复合体进行电击，电击参数为：120 volts，30us， 2puls。将激活后的卵-供体细胞复合体 迅速移入基础培养液中洗涤35次，然后置入39、 5%CO 2 、100%湿度培养箱中培养4小 时。 0037 3-6.胚胎移植入代孕母猪。选择发情的母猪，于手术当天早上对母猪禁食。手术 前绑定母猪，并采用戊巴比妥钠水溶液结合异氟烷方法麻醉。手术部位选择在倒数第二对 。
38、乳头中间部位，用清水清洗手术部位及四周，擦干后用碘酒对手术部位及四周进行消毒，消 毒后用75%酒精脱碘。盖上创巾布并暴露手术部位，沿腹中线依次切开皮肤、皮下肌肉，然 后用刀柄或大的止血钳钝性分离皮下脂肪和腹膜。用手探入腹腔，寻找到子宫和卵巢，并慢 慢牵引出腹腔，并用浸有37生理盐水的纱布给卵巢和子宫保温保湿。固定输卵管，将装 有卵供体细胞复合体的外径为23mm的玻璃管慢慢从输卵管口插入，经过12个弯 曲之后小心将胚胎吹入输卵管内，并慢慢撤出玻璃管，将输卵管伞重新包住卵巢，回复子宫 和输卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎。常规缝合腹腔，术后将受体母猪单独隔离，连续 4天使用抗生素消炎。每天仔细观察记录受体猪的生理情况，做好发情观察。 说 明 书CN 102851311 A 1/1页 10 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102851311 A 10 。