《抗肿瘤化合物及其制备方法与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗肿瘤化合物及其制备方法与应用.pdf（21页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102617588 A (43)申请公布日 2012.08.01 C N 1 0 2 6 1 7 5 8 8 A *CN102617588A* (21)申请号 201210067370.8 (22)申请日 2012.03.14 CGMCC No.5240 2011.09.20 C07D 493/08(2006.01) C12P 17/18(2006.01) A61K 31/357(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人中国科学院微生物研究所 地址 10010。
2、1 北京市朝阳区大屯路甲3号 (72)发明人张立新 宋福行 陈彩霞 郭徽 刘雪婷 代焕琴 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人关畅 (54) 发明名称 抗肿瘤化合物及其制备方法与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种抗肿瘤化合物及其制备方 法与应用。本发明所提供的抗肿瘤化合物其结构 式如式I所示：式I。本发明 提供的化合物LS1924A，属于新结构化合物，具有 较好的抗肿瘤活性，适宜于抗肿瘤先导化合物研 究或制备抗肿瘤药物。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图10页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 。
3、(12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 10 页 1/1页 2 1.一种化合物，其结构式如式I所示： 式I。 2.权利要求1所述的化合物的制备方法，包括如下步骤： 在液体培养基中发酵链霉菌(Streptomyces sp.)LS1924 CGMCC No.5240，得到发酵 液；分离所述发酵液，即得到权利要求1所述的化合物。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述分离所述发酵液的方法包括如下步 骤： 1)先将所述发酵液离心，分别收集上清液和沉淀； 2)先将步骤1)得到的上清液经大孔吸附树脂进行吸附层析，收集层析洗脱液，将步骤 1)得到的沉淀用甲醇。
4、浸泡，收集甲醇提取液；再合并所述洗脱液和所述甲醇提取液，得到 合并产物，即得到权利要求1所述的化合物。 4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于： 步骤1)中，所述离心为48000转/min离心15min； 步骤2)中，所述经大孔吸附树脂进行吸附层析为将所述上清液流过大孔吸附树脂进 行吸附，再用洗脱缓冲液进行洗脱。 5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于： 步骤2)中，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20或X-5； 所述吸附层析的洗脱缓冲液为乙醇； 所述甲醇浸泡时间为10小时。 6.一种用于抗肿瘤的药物，其活性成分为权利要求1所述的化合物。 7.权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤。
5、的药物中的应用。 8.根据权利要求6所述的药物或权利要求7所述的应用，其特征在于： 所述抗肿瘤体现为抑制肿瘤细胞的生长； 所述肿瘤为人肝癌，所述肿瘤细胞具体为人肝癌HepG2细胞。 9.链霉菌(Streptomyces sp.)LS1924，其保藏号为CGMCC No.5240。 权 利 要 求 书CN 102617588 A 1/7页 3 抗肿瘤化合物及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤化合物及其制备方法与应用。 背景技术 0002 据世界卫生组织统计，癌症是一个世界性的主要的死亡原因，全世界范围内因癌 症而死亡的人数呈逐年递增的态势，2008年。
6、癌症死亡人数达760万(约占所有死亡人数的 13)，预计到2030年，全球癌症死亡人数将增加45。因此对于癌症的治疗来讲面临着 非常严峻的挑战。发现并研究具有高效、低毒的抗肿瘤药物至关重要。 发明内容 0003 本发明的一个目的是提供一种化合物。 0004 本发明所提供的化合物，其结构式如式I所示： 0005 0006 式I。 0007 本发明的另一个目的是提供上述化合物的制备方法。 0008 本发明所提供的所述化合物的制备方法，包括如下步骤： 0009 在液体培养基中发酵链霉菌(Streptomyces sp.)LS1924 CGMCC No.5240，得到发 酵液；分离所述发酵液，即得到权。
7、利要求1所述的化合物。 0010 所述液体培养基由以下成分组成： 0011 葡萄糖、稷粉、棉籽蛋白粉、3-(N-吗啉基)丙磺酸和水； 0012 以上成分在所述液体培养基中的浓度分别为： 0013 1升培养基中含5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3-(N-吗啉基)丙磺酸，调pH 7.0-7.5，在本发明的实施例中具体为1升培养基中含10g葡 萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和20g 3-(N-吗啉基)丙磺酸，调pH 7.0。 0014 所述分离所述发酵液的方法包括如下步骤： 0015 1)先将所述发酵液离心，分别收集上清液和沉淀； 0016 2)先将步骤。
8、1)得到的上清液经大孔吸附树脂进行吸附层析，收集层析洗脱液，将 步骤1)得到的沉淀用甲醇浸泡，收集甲醇提取液；再合并所述洗脱液和所述甲醇提取液， 得到合并产物，即得到上述的化合物。 0017 上述方法中，步骤1)中，所述离心为48000转/min(离心腔直径45cm)离心 说 明 书CN 102617588 A 2/7页 4 15min； 0018 步骤2)中，所述经大孔吸附树脂进行吸附层析为将所述上清液流过大孔吸附树 脂进行吸附，再用洗脱缓冲液进行洗脱； 0019 所述大孔吸附树脂的型号为HP-20或X-5； 0020 所述吸附层析的洗脱缓冲液为乙醇； 0021 所述甲醇浸泡的时间为10小时。
9、，浸泡在室温(25)下进行。 0022 在上述分离后，还包括将所述合并产物依次进行如下纯化的步骤： 0023 A、将上述得到的合并产物进行硅胶柱层析分离，得到一次纯化产物； 0024 B、将步骤A得到的一次纯化产物进行凝胶色谱分离，得到二次纯化产物； 0025 C、将步骤B得到的二次纯化产物进行HPLC分离，得到式I所示化合物。 0026 步骤A)中，所述硅胶柱层析分离为将所述合并产物流过硅胶柱以进行吸附，再用 洗脱缓冲液进行洗脱，收集体积比为8020石油醚和丙酮混合液洗脱得到的洗脱液，即得 到一次纯化产物； 0027 所述洗脱缓冲液为体积比为9010-5050的石油醚和丙酮混合液，所述洗 脱。
10、为梯度洗脱；所述体积比为9010-5050的石油醚和丙酮混合液具体为体积比为 9010石油醚和丙酮混合液、体积比为8020石油醚和丙酮混合液、体积比为7030 石油醚和丙酮混合液、体积比为6040石油醚和丙酮混合液、体积比为5050石油醚和 丙酮混合液； 0028 步骤B)中，所述凝胶色谱分离为将所述一次纯化产物流入凝胶柱，再用洗脱缓冲 液进行洗脱，收集洗脱液，再经TLC分析，显色的洗脱液即为二次纯化产物； 0029 所述凝胶柱为Sephadex LH-20，所述洗脱缓冲液为体积比为11的氯仿和甲醇 混合液； 0030 TLC分析的展层溶剂为体积比为31的石油醚和丙酮混合液，TLC分析在254。
11、nm 紫外光下监测。 0031 步骤C)中，所述HPLC为将所述二次纯化产物流过色谱柱以进行吸附，再用洗脱缓 冲液进行洗脱，收集21.4min洗脱液，得到式I所示化合物； 0032 所述HPLC的条件为Agilent ZORBAX-XDB反相色谱柱，RP-C18，5m，9.4*250mm， 检测波长254nm。 0033 所述洗脱缓冲液为体积百分含量为65的甲醇水溶液。 0034 本发明的又一个目的是提供一种用于抗肿瘤的药物。 0035 本发明所提供的用于抗肿瘤的药物，其活性成分为上述化合物。 0036 上述化合物在制备抗肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。 0037 本发明的又一个目的。
12、是提供一种制备用于抗肿瘤的药物的方法。 0038 本发明所提供的制备用于抗肿瘤的药物的方法，为将上述化合物作为活性成分制 备得到用于抗肿瘤的药物。 0039 在上述药物、应用或方法中，所述抗肿瘤体现为抑制肿瘤细胞的生长； 0040 所述肿瘤为人肝癌，所述肿瘤细胞具体为人肝癌HepG2细胞。 0041 本发明提供的链霉菌(Streptomyces sp.)LS1924也属于本发明的保护范围； 0042 链霉菌(Streptomyces sp.)LS1924，其保藏号为CGMCC No.5240。 说 明 书CN 102617588 A 3/7页 5 0043 链霉菌(Streptomyces s。
13、p.)LS1924已于2011年09月20日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5240。 0044 本发明的实验证明，本发明提供的化合物，属于新结构化合物，具有中等的抗肿瘤 活性，适宜于抗肿瘤先导化合物研究或制备抗肿瘤药物。本发明所用的微生物发酵方法选 择了能产生具有优异抗肿瘤活性化合物的链霉菌Streptomyces sp.LS1924，提取方法成 熟，工艺简便，所得产物产率高，经核磁共振、红外光谱、质谱检测，其结构正确。 附图说明 0045 图1为。
14、本发明所述化合物LS1924A的紫外谱图。 0046 图2为本发明所述化合物LS1924A的红外谱图。 0047 图3为本发明所述化合物LS1924A的质谱图。 0048 图4为本发明所述化合物LS1924A溶于Acetone-d 6 中的 1 H-NMR谱图。 0049 图5为本发明所述化合物溶于LS1924A溶于Acetone-d 6 中的 13 C-NMR谱图。 0050 图6为本发明所述化合物LS1924A溶于Acetone-d 6 中的DEPT135图谱。 0051 图7为本发明所述化合物LS1924A溶于Acetone-d 6 中的 1 H- 1 HCOSY谱。 0052 图8为本。
15、发明所述化合物LS1924A溶于Acetone-d 6 中的HSQC谱图。 0053 图9为本发明所述化合物LS1924A溶于Acetone-d 6 中的HMBC谱图。 0054 图10为本发明所述化合物LS1924A对HepG2细胞的生长抑制曲线。 具体实施方式 0055 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 0056 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0057 实施例1、化合物LS1924A的获得 0058 可溶性淀粉购自北京化工厂，产品目录号为K0800034；葡萄糖购自北京现代东方 精细化学品有限公司(HG)。稷粉购自农贸市场。棉籽。
16、蛋白粉(药媒)购自北京中棉紫光生 物科技有限公司。MOPS即3-(N-吗啉基)丙磺酸，购自北京江晨生物。HP-20大孔吸附树 脂(三菱)：购自北京慧德易科技有限公司。Agilent Zorbax XDB C-8column：购自北京慧 德易科技有限公司。Agilent ZORBAX XDB C-18column：购自北京慧德易科技有限公司。 0059 一、链霉菌(Streptomyces sp.)LS1924 CGMCC No.5240的发现及鉴定 0060 菌株来源样品：采自江西瑶里原始森林(海拔850米)的泥土样品。 0061 菌株分离方法：湿热稀释涂布法，具体操作方法如下： 0062 取。
17、1.0g土样，将其放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，180rpm摇2h，于 20KHz、100W功率超声2min；取1.0ml悬浊液，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，混 匀；取1.0ml悬浊液，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，混匀；系列稀释10 -3 和10 -4 ； 盖紧管盖，于100保温1h，取0.2ml涂板。 0063 菌株分离培养基的组成如下(以下均为质量百分比)： 0064 Starch 2、L-天冬素0.05、KNO 3 0.1、K 2 HPO 4 H 2 O 0.05、NaCl 0.05、 MgSO 4 7H 2 O 0.05、CaCO 3 0.。
18、1、Agar 1.8和H 2 O；PH值为7.5。 说 明 书CN 102617588 A 4/7页 6 0065 分离得到菌株LS2151，于25甘油冻存管-80保藏。 0066 菌株16S rRNA序列测定及其系统发育分析方法如下： 0067 用TINAamp Bacteria DNA Kit试剂盒，按试剂盒说明提取菌株 LS2151基因组DNA，用通用引物(27f: 5-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492r： 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)对其进行16S rDNA扩序。16S rDNA的PCR扩增反应在 TaKaRa PCR Thermal Cy。
19、cler上进行25L扩增体系：0.4L 20M引物，2.5L 10 缓冲液(TaKaRa，中国大连)，2.5L 2.5nM dNTP(TaKaRa，Dalian，China)，2UrTap聚合酶 (TaKaRa，中国大连)，1L DNA模板，94初次变性5分钟，然后94变性1min，循环30 次，55退火1分钟，72延伸1分钟15秒，最后72延伸10min.将PCR扩增产物连接到 pMD18-T载体上转入大肠杆菌DH5感受态细胞中，挑选阳性克隆送测序公司，结果为16S rDNA的核苷酸序列为序列表中的序列1。 0068 利用CLSSTAL W序列分析软件对将获得的16S rRNA序列进行多序列。
20、比对分析。 并利用MEGA4.0软件中的邻接法生成系统发育树，步缺值设定：1000。根据菌落形态特征及 16S rRNA基因序列，结果表明LS1924属于链霉菌，与模式菌株Streptomycesmicroflavus， Streptomyces griseorubiginosus，Streptomyces fulvorobeus在16S rRNA基因序列相 似性均为100。 0069 链霉菌(Streptomyces sp.)LS1924已于2011年09月20日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所。
21、，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5240。 0070 二、发酵制备化合物LS1924A 0071 1、种子培养 0072 (1)将斜面培养基在121下灭菌25分钟，制成斜面，于37恒温培养3天。至表 面水分稍干，无杂菌生长时，将链霉菌(Streptomyces sp.)LS1924 CGMCC No.5240菌种孢 子接种于斜面培养基，于28培养8天，至气生菌丝丰满，无染菌时即可收取使用，即得到 斜面菌种。 0073 所述斜面培养基由以下成分组成： 0074 可溶性淀粉、L-天冬酰胺、KNO 3 、K 2 HPO 4 H 2 O、NaCl、MgSO 4 7H 2 O和水； 00。
22、75 以上成分在所述斜面培养基中浓度分别为(g/L)： 0076 可溶性淀粉25g/L、L-天冬酰胺0.4g/L、KNO 3 0.8g/L、K 2 HPO 4 H 2 O 0.4g/L、NaCl 04g/L和MgSO 4 7H 2 O 06g/L； 0077 所述斜面培养基的pH值为7.0。 0078 (2)在多个500ml玻璃瓶中分别装入100ml种子培养基，加棉塞，于121下灭菌 25分钟，由斜面挖块接种。于28在旋转摇床旋转培养(转速为180rpm)72小时，得到种 子液。 0079 所述种子培养基由以下成分组成： 0080 可溶性淀粉、L-天冬酰胺、KNO 3 、K 2 HPO 4 H。
23、 2 O、NaCl、MgSO 4 7H 2 O和水； 0081 以上成分在所述种子培养基中浓度分别为： 0082 可溶性淀粉25g/L、L-天冬酰胺0.4g/L、KNO 3 0.8g/L、K 2 HPO 4 H 2 O 0.4g/L、NaCl 0.4g/L和MgSO 4 7H 2 O 0.6g/L； 说 明 书CN 102617588 A 5/7页 7 0083 所述种子培养基的pH值为7.5。 0084 2、发酵培养 0085 然后配制发酵培养基(1L培养基成份：10g葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和 20g 3-(N-吗啉基)丙磺酸，其余为水，pH值为7.0)。在1000ml的三角瓶。
24、中分装250ml发 酵培养基，灭菌后按照2(体积百分比)的接种量将上述步骤1得到的种子液接种于发酵 培养基，于28旋转培养(转速为180rpm)7天后收获发酵液。发酵液为容器内的所有物 质。 0086 二、分离纯化抗肿瘤化合物并鉴定 0087 1、分离纯化抗肿瘤化合物 0088 1)离心 0089 将上述实验一得到的发酵液于4条件下进行离心，8000转/min(离心腔直径 45cm，GL-21M湘仪高速冷冻离心机)，离心15min，分别收集上清液和菌体。 0090 2)分离提取 0091 将上述上清液通过三菱HP-20大孔吸附树脂(购自北京慧德易科技有限公司)(1 升)吸附，用乙醇进行洗脱，收。
25、集乙醇洗脱液； 0092 将上述沉淀用甲醇在室温(25)浸泡10小时，得到甲醇提取液； 0093 将上述甲醇提取液和上述乙醇洗脱液合并，浓缩，得粗提物15g。 0094 3)纯化 0095 A、硅胶柱层析 0096 将上述得到的粗提物过硅胶柱层析(硅胶的粒径为300目，用石油醚/丙酮从 9010到5050梯度洗脱(先用9010洗100ml，再8020洗100ml，再分别用 7030、6040、5050各100ml洗脱)；收集石油醚/丙酮8020部分洗脱液，得到 一次纯化产物。 0097 B、凝胶色谱 0098 将上述石油醚/丙酮8020部分洗脱液通过Sephadex LH-20凝胶色谱柱 (1。
26、.5100cm，普通玻璃柱，室温(25)，用氯仿-甲醇11(体积比)洗脱，收集洗脱液。 0099 将上述洗脱液用TLC分析(展层溶剂为石油醚/丙酮31，在254nm紫外光下监 测，呈红色色斑的组分即为所要产物)，得到二次纯化产物。 0100 C、HPLC 0101 将上述二次纯化产物通过HPLC纯化，Agilent ZORBAX-XDB反相色谱柱，RP-C18， 5m，9.4*250mm。甲醇水6535做流动相，检测波长254nm，收集21.4min处化合物，命 名为化合物LS1924A。 0102 2、鉴定化合物LS1924A 0103 将上述得到的LS1924A进行鉴定，其理化性质如表1所。
27、示： 0104 (1)外观：白色无定形粉末。 0105 (2)溶解性：易溶于甲醇，氯仿，丙酮，DMSO，乙腈。 0106 (3)旋光值：LS1924A的值分别为+147。测试仪器为Perkin-Elmer Model343polarimeter。采用钠光谱D线(589.3nm)测定，测定管长度1dm。溶剂为乙醇，浓 说 明 书CN 102617588 A 6/7页 8 度0.085g/100mL。 0107 (4)紫外光谱：见图1。LS1924A乙醇溶液的紫外光谱在325和259nm处有最大吸 收峰。紫外光谱测试仪器为Mariner System 5304instrument。 0108 (5。
28、)红外光谱：LS1924A红外光谱在3510，3447(OH)，2964(CH 3 )，2928(CH 2 )，2849， 1681(CO)，1659，1596，1485，1468，1437，1281，1242，1199，1070，1082，1046，960，933， 919，896，849(CH 2 )cm -1 有特征吸收峰，见图2。 0109 红外光谱测试仪器为Nicolet 5700FT-IR Microscope spectrometer (FT-IR Microscope Transmission)。 0110 (6)质谱：图3是LS1924A的HRESIMS质谱图，显示其M+H 。
29、+ 峰为m/z 339.1228， M+Na + 峰为m/z 361.1072；并提供LS1924A的最可能分子式为C 20 H 19 O 5 。HRESIMS测试采 用BrukerAPEX III7.0T spectrometer。甲醇为溶剂。 0111 (7)核磁共振谱：图4是LS1924A的 1 H-NMR谱图。图5是LS1924A的 13 C-NMR谱 图。图6为LS1924A溶于Acetone-d 6 中的DEPT135图谱。根据化合物的 1 H-NMR， 13 C-NMR， 1 H- 1 H COSY(图7)，HSQC(图8)和HMBC(图9)，对两化合物的核磁共振谱进行了研究并对。
30、 13 C信号进行了归属，见表2。并最终确定结构如式I所示： 0112 0113 (式I) 0114 表1化合物1924A的理化性质 0115 0116 表2LS1924A的 13 C和 1 H NMR核磁信号归属(100MHz，Acetone-d 6 ) 说 明 书CN 102617588 A 7/7页 9 0117 0118 0119 化合物LS1924A的NMR测试采用Bruker 500MHz仪器( 1 H 400MHz； 13 C 100MHz)； 溶剂为Acetone-d6。 0120 实施例2、检测化合物LS1924A的抗肿瘤活性 0121 MTT法检测了由实施例1得到的化合物L。
31、S1924A对人肝癌HepG2细胞(购自中国 医学科学院医学细胞中心)的生存抑制活性，MTT法具体操作为：取对数生长期人肝癌细胞 HepG2(购自中国医学科学院医学细胞中心)，消化后计数。310 3 个/孔(190l)接种于 96孔细胞培养板中。24h待细胞贴壁后加入10l不同浓度的待测样品溶液，使待测样品在 每组孔里的最终浓度分别为1g/ml、2g/ml、5g/ml、10g/ml、20g/ml和50g/ml， 每组至少有3个平行孔，处理细胞到指定时间。测定前每孔加入20l MTT溶液(MTT用无 菌PBS缓冲液配成5mg/ml的溶液)，37孵育4h后，小心吸除上清液，每孔加入200l的 二甲。
32、亚砜DMSO，振荡15min，使结晶物充分溶解、混匀。用酶标仪测定570nm处吸光度值。将 各测试孔的OD值减去本底OD值(完全培养基加MTT，无细胞)，各平行孔的OD值取平均数。 细胞存活率(加药细胞OD值-本底OD值)/(对照细胞OD值-本底OD值)100。 每检测点取3个平行孔的平均值，绘制抑制曲线(见图10)，计算IC 50 值。 0122 结果显示其IC 50 值为13.3g/mL，可以看出化合物LS 1924A对于人肝癌HepG2细 胞有抑制作用。 说 明 书CN 102617588 A 1/2页 10 0001 序 列 表CN 102617588 A 10 2/2页 11 000。
33、2 序 列 表CN 102617588 A 11 1/10页 12 图1 说 明 书 附 图CN 102617588 A 12 2/10页 13 图2 说 明 书 附 图CN 102617588 A 13 3/10页 14 图3 说 明 书 附 图CN 102617588 A 14 4/10页 15 图4 说 明 书 附 图CN 102617588 A 15 5/10页 16 图5 说 明 书 附 图CN 102617588 A 16 6/10页 17 图6 说 明 书 附 图CN 102617588 A 17 7/10页 18 图7 说 明 书 附 图CN 102617588 A 18 8/10页 19 图8 说 明 书 附 图CN 102617588 A 19 9/10页 20 图9 说 明 书 附 图CN 102617588 A 20 10/10页 21 图10 说 明 书 附 图CN 102617588 A 21 。