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1、(10)申请公布号 CN 102617442 A (43)申请公布日 2012.08.01 C N 1 0 2 6 1 7 4 4 2 A *CN102617442A* (21)申请号 201110029492.3 (22)申请日 2011.01.27 C07D 209/08(2006.01) A61K 31/404(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人桂林商源植物制品有限公司 地址 541213 广西壮族自治区桂林市八里街 经济开发区灵川大道33号 (72)发明人詹姆斯周 陈东 刘尚钟 (74)专利代理机构北京君尚知识产权代理事务 所(普通合伙) 1120。
2、0 代理人李稚婷 (54) 发明名称 甲烯基双吲哚的制备方法及其应用 (57) 摘要 本发明提供了3，3-甲烯基双吲哚的生产方 法，其包括：将吲哚和对甲苯磺酸溶于由95(重 量)乙醇和水组成的溶剂中，在氮气保护的条件 下，加入甲醛水溶液；在室温下避光反应20-30小 时，优选为24小时；过滤获得步骤(2)反应析出 的固体；和重结晶纯化步骤(3)获得的固体。另 外，本发明还提供了生产的高纯度化合物在制备 药物中的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书11页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 2 页 1。
3、/1页 2 1.3，3-甲烯基双吲哚的生产方法，其包括： (1)将吲哚和对甲苯磺酸溶于由95(重量)乙醇和水组成的溶剂中，在氮气保护的 条件下，加入甲醛水溶液，其中在溶剂中，水和95(重量)乙醇的体积比为11-6，优为 11-3，最优选为11.5； (2)在室温下避光反应20-30小时，优选为24小时； (3)过滤获得步骤(2)反应析出的固体；和 (4)重结晶纯化步骤(3)获得的固体。 2.前述权利要求之任一所述的方法，其中95(重量)乙醇是95(重量)工业乙 醇。 3.前述权利要求之任一所述的方法，其中吲哚和甲醛的摩尔比为1-21，优选为 1.5-1.951，更优选为1.85-1.921。 。
4、4.前述权利要求之任一所述的方法，其中吲哚和对甲苯磺酸的摩尔比为50-2001， 优选为80-1201，更优选为95-1001。 5.前述权利要求之任一所述的方法，其中甲醛水溶液和溶剂中的水的体积比为 18-15，优选为19-12，最优选为110。 6.前述权利要求之任一所述的方法，其中在步骤(3)中，所述固体经过甲醇淋洗，和/ 或，其中在步骤(4)中，重结晶使用的溶剂是乙酸乙酯。 7.前述权利要求之任一所述的方法，其中步骤(3)获得的固体的纯度大于97，优选 大于98，更优选为98.5。 8.前述权利要求之任一所述的方法，其中生产得到的3，3-甲烯基双吲哚的纯度大于 99，优选大于99.3，。
5、更优选为99.5。 9.权利要求8所述的方法制备的高纯度化合物在制备抗癌(如，结肠癌、胃癌，前列腺 癌和肝癌)或抑制癌细胞(如，结肠癌细胞、胃癌细胞，前列腺癌细胞和肝癌细胞)药物中 的应用。 10.权利要求10所述的应用，其中包括， (1)实施权利要求8所述的方法；和 (2)将步骤(1)生产的高纯度化合物与药学上可接受的药物载体配制成药物。 权 利 要 求 书CN 102617442 A 1/11页 3 甲烯基双吲哚的制备方法及其应用 发明领域 0001 本发明属于医药领域，具体而言，本发明涉及3，3-甲烯基双吲哚的生产方法和 药物应用。 背景技术 0002 3，3-甲烯基双吲哚(3，3-me。
6、thylenebis(1H-Indole)(CAS登记号： 1968-05-4)结构如下所示，在自然界中为陆生或海洋生物的代谢产物，具备一定的药用价 值： 0003 0004 现在已经有一些方法来合成3，3-甲烯基双吲哚及其类似物。例如，B.P.Bandgar 等(Bandgar，B.P.；Shaikh，K.A.Tetrahedron Lett.2003，44，1959-1961.)报道了一种以 单质碘为催化剂高效快速合成双吲哚衍生物的方法(反应式如下所示)。但美中不足的是， 反应后处理必须使用大量的Na 2 S 2 O 3 ，对环境有一定的污染，且反应中使用了有毒的乙腈作 为溶剂亦不符合绿色。
7、环保的理念。 0005 0006 Shun-Jun Ji等(Ji，S.-J.；Wang，S.-Y.；Zhang，Y.；Loh，T.-P.Tetrahedron 2004，60，2051-2055.)在无溶剂条件下，以单质碘为催化剂，以芳香醛和吲哚为底物高效地 合成了双吲哚衍生物(反应式如下所示)。尽管该方法反应条件温和、反应时间短暂、操作 简便易行、产品收率高，但该方法只适用于芳香醛与吲哚的反应，对脂肪醛和酮类化合物目 前尚未见报道，可见此方法对底物的应用具有一定局限性。 0007 0008 G.V.M.Sharma等(Sharma，G.V.M.；Janardhan Reddy，J.；Sree。
8、 Lakshmi，P.； Radha Krishna，P.Tetrahedron Lett.2004，45，7729-7732.)报道使用1，3，5-三氯三嗪 说 明 书CN 102617442 A 2/11页 4 (TCT)为催化剂合成双吲哚类化合物(反应式如下所示)。但反应中使用了有毒的乙腈作 为溶剂，不符合当前绿色环保、经济实效的合成理念。 0009 0010 Khalil Tabatabaeian等(Tabatabaeian，K.；Mamaghani，M.；Mahmoodi，N.； Khorshidi，A.Can.J.Chem.2006，84，1541-1545.)报道了以RuCl 3。
9、 nH 2 O为催化剂，以甲醇 为溶剂在室温条件下反应25分钟至3个小时，以醛和吲哚为底物合成了双吲哚衍生物(反 应式如下所示)。但该方法使用的催化剂易引起重金属污染，不符合绿色环保的要求。 0011 0012 Habib Firouzabadi等(Firouzabadi，H.；Iranpoor，N.；Jafarpour，M.；Ghaderi， A.J.Mol.Catal.A：Chem.2006，253，249-251.)报道一种在无溶剂条件下，以ZrOCl 2 8H 2 O/ 硅胶为催化剂合成双吲哚衍生物的方法(反应式如下所示)。但对于工业化的大量生产，反 应底物达到充分的接触难以控制。 0。
10、013 0014 Shokoufeh Mehrazma等(Mehrazma，S.；Azizi，N.；Saidi，M.R.Lett.Org. Chem.2006，3，161-164.)报道了一种在无溶剂条件下，吲哚与羰基化合物反应生成双吲哚 衍生物的方法(反应式如下所示)。但LiClO 4 热不稳定，在高温下易分解发生爆炸。由于 高氯酸盐的热不稳定性，使其制备和应用都存在着一定危险性，因此其推广使用受到了一 定的限制。 0015 0016 Zeng Xiao-Fei等(Zeng，X.-F.；Ji，S.-J.Lett.Org.Chem.2006，3，374-378.)报 道了一种在无溶剂条件下，以。
11、固体超酸SO 4 2- /TiO 2 为催化剂合成双吲哚衍生物的方法(反应 式如下所示)。但催化剂的制作相当繁琐，且对反应底物的选择具有一定的局限性，因此，该 方法只具备一定的理论意义，缺乏实用性。 说 明 书CN 102617442 A 3/11页 5 0017 0018 An，Li-Tao等(An，L.-T.；Ding，F.-Q.；Zou，J.-P.；Lu，X.-H.；Zhang，L.-L.Chin. J.Chem.2007，25，822-827)报道了一种在无溶剂条件下，以胺基磺酸为催化剂高效合成双 吲哚衍生物的方法(反应式如下所示)。尽管该方法高效环保、经济实效，但对于工业化大 生产，。
12、固相操作较难以控制。 0019 0020 Javad Azizian等(Azizian，J.；Teimouri，F.；Mohammadizadeh，M.R.Catal. Commun.2007，8，1117-1121.)报道了一种在无溶剂条件下，以氯化铵为催化剂合成双吲哚 衍生物的方法(反应式如下所示)。尽管该方法操作简便、高效实效，但大量使用的氯化铵 无疑对环境造成一定的污染。 0021 0022 Alireza Hasaninejad等(Hasaninej ad，A.；Zare，A.；Sharghi，H.；Shekouhy， M.；Khalifeh，R.；Beni，A.S.；Zare，A.。
13、R.M.Can.J.Chem.2007，85，416-420.)报道了一种 在无溶剂条件下，以硅氯化物为催化剂高效快速合成双吲哚衍生物的方法(反应式如下所 示)。该方法快速高效、易于操作，适于在短时间内合成双吲哚甲烷衍生物，但对于工业化大 生产，固相操作较难以控制。 0023 0024 Vinod T.Kamble等(Kamble，V.T.；Kadam，K.R.；Joshi，N.S.；Muley，D.B.Catal. Commun.2007，8，498-502.)报道一种以HClO 4 -SiO 2 为催化剂，高效快速合成双吲哚衍生物 的方法(反应式如下所示)。 0025 说 明 书CN 10。
14、2617442 A 4/11页 6 0026 WANG，Shun-Yi等(Wang，S.-Y.；Ji，S.-J.；Su，X.-M.Chin.J.Chem.2008，26， 22-24.)报道了以Meldrums acid为催化剂，在室温条件下以水做溶剂在超声辐射下反应 3-8小时，以醛(酮)和吲哚为底物合成了双吲哚衍生物(反应式如下所示)。该方法虽然 避免使用有毒的有机溶剂，使用的催化剂较便宜，反应条件温和，粗产品经过滤便可得到， 但需要在超声波辐射下，才能得到收率较高的产物，该方法不适宜工业化生产。 0027 0028 Sharmin V等(Nadkarni，S.V.；Gawande，M.B。
15、.；Jayaram，R.V.；Nagarkar， J.M.Catal.Commun.2008，9，1728-1733.)报道了一种以PO 4 3- /ZrO 2 为催化剂，在无溶剂条件 下，高效率合成双吲哚衍生物的方法(反应式如下所示)。但是催化剂的制作过程比较繁 琐。 0029 0030 Jitendra R等(Satam，J.R.；Parghi，K.D.；Jayaram，R.V.Catal.Commun.2008，9， 1071-1078.)报道了一种在无溶剂条件下，使用多相催化剂高效合成双吲哚衍生物的方法 (反应式如下所示)。但是，催化剂制作过程比较繁琐，而且价格相对不菲。 0031 0。
16、032 经过大量的研究，本发明人获得了一种新的3，3-甲烯基双吲哚的生产方法，可 以在室温下进行，使用工业乙醇作为溶剂，而且不使用复杂的催化剂体系，降低了生产成 本，减轻了环境污染；并通过有效地通过控制溶剂中水和工业乙醇的比例，减少了副产物的 生成，降低了析出的固体产物对杂质的包裹能力，极大地方便了纯化过程，只用通过重结晶 等简单措施即可提纯至药用级的纯度水平。另外，本发明人获得了高纯度的3，3-甲烯基 双吲哚，其可以安全地作为药用级的活性化合物使用，对多种肿瘤均具有显著的杀伤作用。 发明内容 0033 本发明的目的在于提供3，3-甲烯基双吲哚的生产方法，其成本低、对环境友好、 说 明 书CN。
17、 102617442 A 5/11页 7 副产物少、纯化方便、操作简单安全。另外，本发明还提供高纯度的3，3-甲烯基双吲哚以 及其药物应用。 0034 在第一个方面，本发明提供了3，3-甲烯基双吲哚的生产方法，其包括： 0035 (1)将吲哚和对甲苯磺酸溶于由95(重量)乙醇和水组成的溶剂中，在氮气保 护的条件下，加入甲醛水溶液； 0036 (2)在室温下避光反应20-30小时，优选为24小时； 0037 (3)过滤获得步骤(2)反应析出的固体；和 0038 (4)重结晶纯化步骤(3)获得的固体。 0039 在本文中，如未加说明，“室温”指的是20-30，如20-25、25-30，最优选为 2。
18、5。 0040 经本发明人研究发现，乙醇的纯度，尤其是乙醇中混有的其它醇类杂质(主要是 甲醇)、重金属盐等，对于本发明最终产物的产率和纯度都不会造成显著影响。所以，尽管 可以采用更高纯度的乙醇(如，分析纯的乙醇)稀释优选本发明第一个方面的方法中，95 (重量)乙醇是95(重量)工业乙醇(即，工业酒精)，即标签上是“工业纯”的95乙 醇。这样，使用工业乙醇大大拓宽了原料的来源，降低了原料的使用成本。 0041 优选本发明第一个方面的方法中，在溶剂中，水和95(重量)乙醇的体积比为 11-6，优为11-3，最优选为11.5。经本发明人研究发现，这样的比例可以有效溶 解吲哚原料，同时有效降低了副产物。
19、的种类和数量。 0042 为了使更为昂贵的原料吲哚反应得更为完全，优选在实际生产中甲醛过量。所以， 优选本发明第一个方面的方法中，吲哚和甲醛的摩尔比为1-21，优选为1.5-1.951， 更优选为1.85-1.921。 0043 经本发明人研究发现，使用对甲苯磺酸的反应效果要远远优于使用冰乙酸等常用 试剂，而且本发明人发现，即使对甲苯磺酸用量很少，仍旧能够有效地生产3，3-甲烯基双 吲哚，这样对成本和环境的益处是不言而喻的。所以，优选本发明第一个方面的方法中，吲 哚和对甲苯磺酸的摩尔比为50-2001，优选为80-1201，更优选为95-1001。 0044 常温下甲醛极易挥发，而且吸入人体后。
20、，具有强力的危害作用，因此通常使用甲醛 水溶液来代替，但是水溶液实质上增加了溶剂中的水。为此，经本发明人研究，发现采取一 定比例的甲醛水溶液和溶剂中的水，仍旧能够使得本发明的方法有效进行。所以，优选本发 明第一个方面的方法中，甲醛水溶液和溶剂中的水的体积比为18-15，优选为19-12， 最优选为110。 0045 优选本发明第一个方面的方法中，在步骤(3)中，所述固体经过甲醇淋洗。尽管实 际上用甲醛淋洗的效果最好，但是常温下甲醛极易挥发，而且吸入人体后具有强力的危害 作用，而经过与其他有机溶剂相比，甲醇洗涤的效果(包括除表面杂质和减少产率损失)最 好，因此优选使用甲醇淋洗。淋洗的固体优选不必。
21、经过干燥。 0046 优选本发明第一个方面的方法中，在步骤(4)中，重结晶使用的溶剂是乙酸乙酯。 在本发明的具体实施方式中，重结晶的次数是两次。 0047 优选本发明第一个方面的方法中，步骤(3)获得的固体的纯度大于97，优选大 于98，更优选为98.5。这样纯度的3，3-甲烯基双吲哚已经相当纯，为进一步纯化节 约了成本。当在纯度要求不太高的应用中使用时，可以直接采用步骤(3)获得的固体，而不 说 明 书CN 102617442 A 6/11页 8 必进一步纯化，这也涵盖在本发明的保护范围内。 0048 优选本发明第一个方面的方法中，生产得到的3，3-甲烯基双吲哚的纯度大于 99，优选大于99。
22、.3，更优选为99.5。这样纯度的3，3-甲烯基双吲哚是药用水平级 别的，可以直接配制入药物。 0049 在第二个方面，本发明提供了本发明第一方面的方法制备的化合物(3，3-甲烯 基双吲哚)在制备抗癌(如，结肠癌、胃癌，前列腺癌和肝癌)或抑制癌细胞(如，结肠癌细 胞、胃癌细胞，前列腺癌细胞和肝癌细胞)药物中的应用。优选其中化合物是本发明第一方 面的方法制备的高纯度化合物(3，3-甲烯基双吲哚)，其纯度大于99，优选大于99.3， 更优选大于99.5。 0050 在一个示例性的实施方式中，本发明优选提供的本发明第二个方面的应用包括， 0051 (1)实施本发明第一方面的方法，使得生产得到的3，3。
23、-甲烯基双吲哚的纯度大 于99，优选大于99.3，更优选大于99.5；和 0052 (2)将步骤(1)生产的高纯度化合物与药学上可接受的药物载体配制成药物。 0053 在本文中，药学上可接受的载体指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐剂、 包裹材料或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将 药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、膜剂、丸剂、胶囊(包括 持续释放或延迟释释设形式)、粉剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂和乳液剂、消毒的住射用溶液或 悬浮液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、针剂、自动注射装置或栓剂。例如，以片剂或胶囊的服给 药，上述活性药物组分可。
24、以与一种口服的无毒的药物学可接受的惰性载体组合在一起，如 乙醇、等渗葡萄糖溶液、甘油、生理盐水或其组合。 0054 本发明取得了如下有益效果： 0055 (1)以水和工业酒精(95)作溶剂，价格便宜，安全实惠，避免了使用价格较贵、 有毒的有机溶剂； 0056 (2)使用对甲苯磺酸作催化剂价格便宜，对环境的污染较小； 0057 (3)反应于室温进行，不需提供加热和冷凝装置，即节约了水电，也无安全隐患； 0058 (4)产品双吲哚甲烷难溶于水和乙醇，反应过程中主产物便从体系中析出，含有极 少量副产物的粗产品只需过滤便可得到，进一步重结晶便可纯化，反应操作简便易行； 0059 (5)纯化的淋洗过程只。
25、需使用甲醇，避免了甲醛使用对人体造成的吸入伤害，进一 步简化了操作步骤，更带来了安全性； 0060 (6)本发明获得的3，3-甲烯基双吲哚纯度高，可以直接配制成药物使用，而且可 以对多种肿瘤均具有显著的杀伤能力。 附图说明 0061 图1比较例1的TLC图谱。 0062 图2比较例2的TLC图谱。 0063 图3比较例3的TLC图谱。 0064 图4比较例4的TLC图谱。 0065 图5实施例1的TLC图谱。 0066 图6实施例2的核磁共振氢谱。 说 明 书CN 102617442 A 7/11页 9 0067 本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容 均纳入本。
26、文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。 0068 为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指 出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论 述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的了，如水对乙醇的稀 释等。 具体实施方式 0069 比较例1冰乙酸参与的甲烯基双吲哚的高温合成 0070 合成反应方程式如下： 0071 0072 合成过程如下： 0073 四口圆底玻璃烧瓶上安装机械搅拌器、温度计以及通入氮气后，加入11.7克吲 哚、3.0克冰乙酸和250ml水。在搅拌下，于室温条件下开始滴加4m。
27、L 40(重量)甲醛水 溶液，边加热边滴加，滴加完毕后，加热升温至90，于90避光反应5小时，反应过程中会 析出固体产物。 0074 产物的鉴定： 0075 取上述反应过程中剩余的反应液和取样的原料液进行薄层色谱(TLC)监测，其 中，展开剂：正己烷(V)乙酸乙酯(V)21。TLC结果(如图1所示)显示：反应底物 吲哚已基本反应完毕，反应液中除主产物点3，3-甲烯基双吲哚以外，还有三个副产物点。 0076 从TLC检测结果可以看出，反应中产生的副产物比较多，较大程度地影响了产率。 反应温度过高可能是导致副产物过多的主要原因。比较例2冰乙酸参与的甲烯基双吲哚的 常温合成 0077 合成反应方程式。
28、如下： 0078 0079 合成过程如下： 0080 四口圆底玻璃烧瓶上安装机械搅拌器、温度计以及通入氮气后，加入11.7克吲 哚、3.0克冰乙酸和250ml水。机械搅拌下，于室温(25-30)条件下滴加4mL 40(重 量)甲醛水溶液，滴加完毕后，于25-30避光反应24小时，反应过程中会析出固体产物。 说 明 书CN 102617442 A 8/11页 10 0081 产物的鉴定： 0082 取上述反应过程中剩余的反应液和取样的原料液进行薄层色谱(TLC)监测，其 中，展开剂：正己烷(V)乙酸乙酯(V)21。TLC结果(如图2所示)显示：反应底物 吲哚大量剩余，但产物点只有两个，而且副产物。
29、点相对比例极小。即使继续延长反应时间， TLC结果显示反应趋于平衡时，反应底物吲哚大量剩余。 0083 从TLC检测结果可以看出，反应温度降低至室温，虽然副产物种类和数量有所减 少，但是反应进行得相当不完全，反应底物吲哚大量剩余，难以产业上推广应用。 0084 比较例3对甲苯磺酸和水参与的甲烯基双吲哚的室温合成 0085 合成反应方程式如下： 0086 0087 合成过程如下： 0088 将11.7克吲哚、0.25克对甲苯磺酸加入四口瓶中后，加入250ml水，于氮气保护下 机械搅拌，滴加4ml 40(重量)甲醛水溶液。滴加完毕后于室温(25-30)反应24小 时，反应过程中会析出固体产物。 0。
30、089 产物的鉴定： 0090 取上述反应过程中剩余的反应液和取样的原料液进行薄层色谱(TLC)监测，其 中，展开剂：正己烷(V)乙酸乙酯(V)21。TLC结果(如图3所示)显示：反应液中 除主产物和副产物，还有未参与反应的一定量的吲哚，另外，析出的固体产物中除主产物和 副产物，也包裹有未参与反应的一定量的吲哚。即使延长反应时间，加快机械搅拌的速度， 仍有未参与反应的吲哚存在。 0091 反应无法进行完全的可能原因是，反应产物中会包裹未参加反应的吲哚，在一定 程度上影响了反应的完全进行。 0092 比较例4对甲苯磺酸和工业乙醇参与的甲烯基双吲哚的室温合成 0093 合成反应方程式如下： 009。
31、4 0095 合成过程如下： 0096 将29.5克吲哚、0.45克对甲苯磺酸加入四口瓶中后，加入100ml质量分数为95 的工业酒精使反应底物吲哚完全溶解，于氮气保护下机械搅拌，滴加10ml40(重量)甲醛 水溶液，滴加完毕于室温(25-30)反应24小时，反应过程中会析出固体产物。 说 明 书CN 102617442 A 10 9/11页 11 0097 产物的鉴定： 0098 取上述反应过程中剩余的反应液和取样的原料液进行薄层色谱(TLC)监测，其 中，展开剂：正己烷(V)乙酸乙酯(V)21。TLC结果(如图4所示)显示：吲哚基本 上被反应完全，但有一种副产物生成，而且副产物产率相对很高。
32、。 0099 这表明，使用高浓度的工业醇这一极性相对较低的溶剂，会使得副产物产率大大 提高，难以实际推广应用。 0100 实施例1对甲苯磺酸以及一定比例的水和工业乙醇参与的甲烯基双吲哚的室温 合成 0101 合成反应方程式如下： 0102 0103 合成过程如下： 0104 将29.5克吲哚、0.45克对甲苯磺酸加入四口瓶中后，加入150mL质量分数为95 的工业酒精和100mL水使反应底物吲哚完全溶解，于氮气保护和机械搅拌下，滴加10mL 40甲醛水溶液，滴加完毕于室温(25-30)反应24小时，反应过程中会析出固体产物。 0105 产物的鉴定： 0106 取上述反应过程中剩余的反应液和取样。
33、的原料液进行薄层色谱(TLC)监测，其 中，展开剂：正己烷(V)乙酸乙酯(V)21。TLC结果(如图5所示)显示：反应液中 吲哚几乎全部转化，副产物只有一种而且相对比例很低。同时固体产物中也几乎没有包裹 吲哚，干燥后共得到固体产物26.4g，产率85，纯度为98.5。采用分析纯乙醇用水稀释 至95，参照上述方法进行，未见产物产率和纯度上的提高。从图1-5的结果来看，采用实 施例1制备的产物明显优于采用比较例1-4制备的产物。 0107 结果表明，采用上述方法制备，相对于比较例，反应时进行得最完全的，而且副产 物的量是最少的，解决了反应产物包裹吲哚的问题，这极大地方便了后期纯化，其中使用工 业乙。
34、醇并不影响效果。 0108 实施例2甲烯基双吲哚的纯化 0109 实施例1进行的反应体系，进行过滤，分离出固体产物，即为粗产品；分离出的反 应液经减压蒸馏回收其中的乙醇。 0110 实验发现，固体产物直接进行重结晶，其中的水份将极大影响重结晶纯化的收率 以及纯度，因此需要进行淋洗。取实施例1分离出的湿固体产物31.7g(即，不必干燥也不 影响结晶效率)，在减压抽滤下用120mL甲醇对粗产品进行淋洗。 0111 将淋洗后的固体产物混合于60mL乙酸乙酯，搅拌下加热至70-78溶解，然后自 然降温至室温，过滤析出固体。然后，固体加入50mL乙酸乙酯，加热至70-78溶解，然后 搅拌后自然降温至室温。
35、，固体产物析出后，弃去液体，用10mL冷乙酸乙酯洗涤固体，减压干 燥固体产物，共得3，3-甲烯基双吲哚产物18.6g，纯度99.5。该产物熔点167，其 说 明 书CN 102617442 A 11 10/11页 12 核磁共振氢谱如图6所示，核磁数据如下：4.1322(s，2H)，6.8924(t，2H)，7.0025(t，2H)， 7.1240(s，2H)，7.3206(d，2H)，7.5215(d，2H)，10.7153(s，2H)。 0112 实施例3甲烯基双吲哚的药物应用试验 0113 本试验的所有细胞系均可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)。 0114 1，Colon38细胞的。
36、体外杀伤实验 0115 来源：Colon38细胞是小鼠结肠癌细胞，为贴壁细胞。 0116 培养基：164090(培养液)+NCS(新生牛血清)10+1ml青霉素链霉素混合液 0117 培养条件：在5CO 2 的37培养箱中培养。每3天传代一次，2-3次传代后细胞 进入对数生长期的时候开始试验。 0118 实验步骤：(1)取对数生长期培养细胞，吹散均匀，制备单细胞悬液； 0119 (2)以含10FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度为210 5 /mL，于96孔细胞培 养板接种，每孔100L，置于37、5CO 2 培养箱培养24h； 0120 (3)取实施例2的化合物，溶于二甲基亚砜(DMS。
37、O)，化合物浓度分别为：1g/ml、 3g/ml、9g/ml、27g/ml、81g/ml。 0121 (4)24h后分组加药； 0122 (5)继续培养72小时； 0123 (6)用PBS洗板，每孔加入20ul MTS溶液并加100ul10FBS的RPMI1640，继续培 养2小时； 0124 (7)用酶标仪A570nm比色，测定OD值，给药孔与对照孔OD值比较，得出半抑制浓 度(IC50)。 0125 2，SGC-7901细胞的体外杀伤实验 0126 如上述方法1的过程进行测定，其中使用SGC-7901细胞(人胃癌细胞，为贴壁细 胞)代替Colon38细胞。 0127 3，H22细胞的体外杀。
38、伤实验 0128 来源：H22细胞是小鼠肝癌细胞，为悬浮细胞。 0129 培养基：RPMI1640培养基和10胎牛血清，并加入青链霉素(1) 0130 培养条件：在5CO 2 的37培养箱中培养。每3天传代一次，2-3次传代后细胞 进入对数生长期的时候开始试验。 0131 实验步骤：(1)取对数生长期培养细胞，吹散均匀，制备单细胞悬液； 0132 (2)以含10FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度为210 5 /mL，于96孔细胞培 养板接种，每孔50L，置于37、5CO2培养箱孵育； 0133 (3)取实施例2的化合物，溶于二甲基亚砜(DMSO)，化合物浓度分别为：1g/ml、 3g/。
39、ml、9g/ml、27g/ml、81g/ml 0134 (3)次日分组加药，将孔内培养液补足至100L； 0135 (4)继续培养72小时； 0136 (5)每孔加入5mg/mLMTT溶液10L，继续培养3-4小时； 0137 (6)每孔加入100L10HCl-SDS溶液，37孵育过夜； 0138 (7)振荡10min，使结晶充分溶解，于Model 550酶标仪，A570nm比色，测定OD值， 给药孔与对照孔OD值比较，得出半抑制浓度(IC50)。 说 明 书CN 102617442 A 12 11/11页 13 0139 4，PC-3细胞的体外杀伤实验 0140 如上述方法1的过程进行测定，其中使用PC-3细胞(前列腺癌细胞，为贴壁细胞) 代替Colon38细胞。 0141 上述方法1-4的结果如下表所示，表明该药物具有极大的肿瘤细胞杀伤能力。 0142 说 明 书CN 102617442 A 13 1/2页 14 图1图2图3图4图5 说 明 书 附 图CN 102617442 A 14 2/2页 15 图6 说 明 书 附 图CN 102617442 A 15 。