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1、(10)申请公布号 CN 102399768 A (43)申请公布日 2012.04.04 C N 1 0 2 3 9 9 7 6 8 A *CN102399768A* (21)申请号 201110360254.0 (22)申请日 2011.11.15 C12N 9/42(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 1/19(2006.01) A23L 2/84(2006.01) A21D 8/04(2006.01) A23K 1/165(2006.01。
2、) C12R 1/84(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人中国农业科学院饲料研究所 地址 100086 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人姚斌 黄火清 杨培龙 刘琼 罗会颖 柏映国 王亚茹 石鹏君 孟昆 袁铁铮 (74)专利代 理机构北京法思腾知识产权代理有 限公司 11318 代理人高宇 杨小蓉 (54) 发明名称 一种低温木聚糖酶BA-XYL11A及其基因和应 用 (57) 摘要 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉 及一种低温木聚糖酶BA-XYL11A及其基因和应 用。本发明提供了一种低温木聚糖酶BA-XYL11A， 其具有如SEQ。
3、 IDNO.1或2所示的氨基酸序 列，且本发明还提供了编码上述低温木聚糖酶 BA-XYL11A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、 4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌 株及其应用。本发明的低温木聚糖酶BA-XYL11A 所以在工业和农业上的应用可以节省大量的能 源。本发明的低温木聚糖酶是一种性质优良的、 适合于在食品、饲料工业中应用新的低温木聚糖 酶。其最适pH为5.0，在pH 3-6都有较高的酶活 性；在低温下有很高的催化活性，催化效率要比 其它的低温木聚糖酶高，即使在0时仍然具有 约27的相对活性。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。
4、发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 3 页 附图 3 页 CN 102399767 A 1/1页 2 1.一种低温木聚糖酶BA-XYL11A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。 2.一种低温木聚糖酶基因BA-xyl11A，其特征在于，编码权利要求1所述的木聚糖酶。 3.根据权利要求2所述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3、4或5所示。 4.包含权利要求2或3所述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A的重组载体。 5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pPIC9-BA-xyl11A。 6。
5、.包含权利要求2或3所述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A的重组菌株。 7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。 8.一种制备低温木聚糖酶BA-XYL11A的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶BA-XYL11A的表达；以及 3)回收并纯化所表达的木聚糖酶BA-XYL11A。 9.权利要求1所述低温木聚糖酶BA-XYL11A的应用。 权 利 要 求 书CN 102399768 A CN 102399767 A 1/9页 3 一种低温木聚糖酶 BA-XYL11A 及其基因和应用 。
6、技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种低温木聚糖酶BA-XYL11A及其基因 和应用。 背景技术 0002 半纤维素作为植物细胞壁的主要组分，是陆生植物中继纤维素之后含量最丰富的 碳水化合物，约占植物干重的35。其中木聚糖是半纤维素中的代表性组分，是自然界中含 量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews.2005，29：3-23.)。但是木聚糖是一种杂聚多糖，它的 主链是由吡喃木糖通过-1，4糖苷键连接而形成的，在主链的吡喃木糖环的2号，3号和5 号位有不同的取代基。
7、。这些取代基包括4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸残基、-L-阿拉伯糖残 基、O-乙酰基等，其中-L-阿拉伯糖残基上又可与阿魏酸和香豆酸等酚酸酯化。 0003 木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶，它能够随机地切割木聚糖 主链骨架-1，4糖苷键，最后生成木糖、寡聚木糖或带有侧链的寡聚木糖。虽然木聚糖的 完全降解需要多种酶的协同作用，包括：-D-木糖苷酶、-D-葡萄糖醛酸苷酶、-L-阿 拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶等酶；但是在木聚糖的降解过程中，内 切-1，4-D-木聚糖酶，也就是我们通常所说的木聚糖酶，从木聚糖的主链内部随机切割 吡喃木糖残基之间的-1，4-连接键，发挥的作用。
8、是最主要和最重要的。它们是木聚糖降 解相关酶中研究最多和最有应用价值的一类酶。 0004 木聚糖酶在多个领域有着重要的应用：作为饲料添加剂可以消除饲料里的木聚糖 的抗营养作用，提高饲料的营养价值和利用率；在造纸工业上，可以用于纸浆的漂白，减少 环境的污染；在食品行业上，可以用来生产功能性低聚木糖、面包发酵等；在能源上，可以 用来水解木聚糖得到的木单糖发酵生产的燃料乙醇等等。此外，木聚糖酶在纺织、医药等其 它行业也有广泛的应用。据报道各种微生物如细菌和真菌等都能产生木聚糖酶。但获得 新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。低温木聚糖酶由于其在低温环境中 具有较高的酶活，相对于中温或高温木聚。
9、糖酶有其特有的应用优势(Gerday et al.Trends Biotechnology.2000，18：103-107)。比如水产动物由于水体环境影响其肠道温度偏低，因 此低温木聚糖酶更适合作为水产饲料添加剂使用以提高养殖鱼类对饲料中营养成分的吸 收。同时，在食品工业中，低温木聚糖酶与果胶酶及纤维素酶同时在低温作用可有效降低果 汁黏度，有效提高果汁口味。因此开发新型的低温木聚糖酶将对推动木聚糖酶在各种工业 中应用。目前报道的低温木聚糖酶为第十和第八家族的木聚糖酶，而对糖苷水解酶第十一 家族的木聚糖酶还未见报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种低温木聚糖酶BA-XYL11A。 0。
10、006 本发明的另一目的是提供编码上述低温木聚糖酶的基因BA-xyl11A。 说 明 书CN 102399768 A CN 102399767 A 2/9页 4 0007 本发明的另一目的是提供包含上述低温木聚糖酶基因的重组载体。 0008 本发明的另一目的是提供包含上述低温木聚糖酶基因的重组菌株。 0009 本发明的另一目的是提供制备上述低温木聚糖酶的方法。 0010 本发明的另一目的是提供上述低温木聚糖酶的应用。 0011 本发明从Bispora antennata CBS 126.38菌株中获得了一种低温木聚糖酶 BA-XYL11A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示： 0012 。
11、MVSFSSLIFV VAAAVGVAAA PSEVLVERGG TPSSTGTNNG FYYSFWTDGA 0013 GDITYTNGAA 60 0014 GQYNVKWSGN NGNFVGGKGW NPGSGRVINY SGTYCPNGNS 0015 YLSIYGWTRN PLIEYYIVEN 120 0016 YGTYNPSSAA TKKGSITVDG SNYDILQTTR TNQPSIDGTK TFQQYWSVRT 0017 SKRSSGSVNT 180 0018 QAHFDAWAKV GMKLGTEFNY LIVATEGYFS SGSATITVS 219 0019 其中，该酶全长21。
12、9个氨基酸，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列 “MVSFSSLIFV VAAAVGVAA”。 0020 因此，成熟的低温木聚糖酶BA-XYL11A的理论分子量为21.7kDa，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.2： 0021 APSEVLVERG GTPSSTGTNN GFYYSFWTDG AGDITYTNGA AGQYNVKWSG 0022 NNGNFVGGKG 60 0023 WNPGSGRVIN YSGTYCPNGN SYLSIYGWTR NPLIEYYIVE NYGTYNPSSA 0024 ATKKGSITVD 120 0025 GSNYDILQTT RTNQPSIDGT KTF。
13、QQYWSVR TSKRSSGSVN TQAHFDAWAK 0026 VGMKLGTEFN 180 0027 YLIVATEGYF SSGSATITVS 200 0028 该木聚糖酶BA-XYL11A的最适pH为5.0，在pH 3.5-6.0的范围内，酶活性均维持 在最大酶活性的50以上。木聚糖酶在pH 4.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理 60min后剩余酶活性在90以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。最适温度为40，在 0-50间具有较高的木聚糖降解活性；在50处理30min，保持40的酶活性，即使在0 时仍然具有约27的相对活性，这为在低温条件应用提供了可能；具有极好的抗胃。
14、蛋白酶 和胰蛋白酶处理能力，经过糜蛋白酶、枯草蛋白酶、胶原蛋白酶、胃蛋白酶、或胰蛋白酶处理 1h后，仍能维持40-70的活性；同时高密度发酵酶活性高，易于工业化生产。该酶的性 质非常适合在饲料食品等行业中应用。 0029 本发明还提供了编码上述低温木聚糖酶BA-XYL11A的基因BA-xyl11A。该酶的全 基因序列如SEQ ID NO.3所示： 0030 atggtatcct tctcctccct catcttcgtt gtcgctgctg ccgttggggt tgctgctgcc 60 0031 ccttctgagg tccttgtaga gcgtggtgga acacctagct ca。
15、acaggaac caacaacggt 120 0032 ttctactatt ctttctggac tgatggagct ggagatatca catataccaa tggagcagct 180 0033 ggacaataca atgtgaaatg gtctggcaac aatggaaact ttgttggagg aaagggatgg 240 0034 aacccaggaa gcggcaggta agaaaatccg attcactttg tcacaaattc ctataaaagc 300 说 明 书CN 102399768 A CN 102399767 A 3/9页 5 0035 aact。
16、cactaa tcttctccgc gcttcagagt catcaactac tccggcacct actgccctaa 360 0036 tggcaatagc tacctttcca tctacggttg gaccagaaac cctcttatcg agtactacat 420 0037 tgtcgaaaac tacggcacct acaacccttc tagtgctgct acgaagaagg gctccatcac 480 0038 cgttgacggc tcaaactacg atattctcca gactacccgt accaaccagc cttccatcga 540 0039 tggt。
17、accaag acctttcagc agtactggtc tgtccgaacg agcaagcgct ccagtggatc 600 0040 tgtcaacact caagctcatt tcgacgcatg ggccaaggtt ggaatgaagt tgggcacgga 660 0041 attcaactac ttgatcgttg caaccgaggg atacttcagc agcggatcag caactatcac 720 0042 cgtttcatag 730 0043 本发明通过PCR的方法分离克隆了这一木聚糖酶基因BA-xyl11A，DNA全序列分析 结果表明，木聚糖酶BA-xyl1。
18、1A结构基因全长730bp，含有1个内含子，+258328bp，为其 内含子序列，cDNA长660bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示： 0044 atggtatcct tctcctccct catcttcgtt gtcgctgctg ccgttggggt tgctgctgcc 60 0045 ccttctgagg tccttgtaga gcgtggtgga acacctagct caacaggaac caacaacggt 120 0046 ttctactatt ctttctggac tgatggagct ggagatatca catataccaa tggagcagct 180 0。
19、047 ggacaataca atgtgaaatg gtctggcaac aatggaaact ttgttggagg aaagggatgg 240 0048 aacccaggaa gcggcagagt catcaactac tccggcacct actgccctaa tggcaatagc 300 0049 tacctttcca tctacggttg gaccagaaac cctcttatcg agtactacat tgtcgaaaac 360 0050 tacggcacct acaacccttc tagtgctgct acgaagaagg gctccatcac cgttgacggc 420 0。
20、051 tcaaactacg atattctcca gactacccgt accaaccagc cttccatcga tggtaccaag 480 0052 acctttcagc agtactggtc tgtccgaacg agcaagcgct ccagtggatc tgtcaacact 540 0053 caagctcatt tcgacgcatg ggccaaggtt ggaatgaagt tgggcacgga attcaactac 600 0054 ttgatcgttg caaccgaggg atacttcagc agcggatcag caactatcac cgtttcatag 660 0。
21、055 其中，信号肽的碱基序列为： 0056 “atggtatcct tctcctccct catcttcgtt gtcgctgctg ccgttggggt tgctgct”， 0057 因此，编码成熟木聚糖酶的基因序列如SEQ ID NO.5所示： 0058 gccccttctg aggtccttgt agagcgtggt ggaacaccta gctcaacagg aaccaacaac 60 0059 ggtttctact attctttctg gactgatgga gctggagata tcacatatac caatggagca 120 0060 gctggacaat acaatgtga。
22、a atggtctggc aacaatggaa actttgttgg aggaaaggga 180 0061 tggaacccag gaagcggcag agtcatcaac tactccggca cctactgccc taatggcaat 240 0062 agctaccttt ccatctacgg ttggaccaga aaccctctta tcgagtacta cattgtcgaa 300 0063 aactacggca cctacaaccc ttctagtgct gctacgaaga agggctccat caccgttgac 360 0064 ggctcaaact acgatattc。
23、t ccagactacc cgtaccaacc agccttccat cgatggtacc 420 0065 aagacctttc agcagtactg gtctgtccga acgagcaagc gctccagtgg atctgtcaac 480 0066 actcaagctc atttcgacgc atgggccaag gttggaatga agttgggcac ggaattcaac 540 0067 tacttgatcg ttgcaaccga gggatacttc agcagcggat cagcaactat caccgtttca 600 0068 tag 603 0069 该酶属于糖基水。
24、解酶第11家族。将木聚糖酶基因BA-xyl11A的cDNA 序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，与Glomerella graminicolaM1.001(EFQ27362)来源的一个预测的内切-1，4-木糖苷酶具有最高的氨 说 明 书CN 102399768 A CN 102399767 A 4/9页 6 基酸序列一致性为71。说明BA-xyl11A是一种新的木聚糖酶基因。 0070 本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A的重组载体，优选为 pPIC-BA-xyl11A。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之 间，使其核苷酸。
25、序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施 方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶 切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒 pPIC9-BA-xyl11A。 0071 本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶基因BA-xyl11A的重组菌株，所述菌株为 酵母菌、大肠杆菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/BA-xyl11A。 0072 本发明还提供了一种制备上述低温木聚糖酶BA-XYL11A的方法，包括以下步骤： 0073 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株。
26、； 0074 2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶BA-XYL11A表达；以及 0075 3)回收并纯化所表达的木聚糖酶BA-XYL11A。 0076 其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将 重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/ BA-xyl11A。 0077 本发明还提供了上述低温木聚糖酶BA-XYL11A的应用，优选该酶在水解木聚糖及 其在食品、饲料工业中的应用。 0078 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在食品、饲料工业中应用新的低温木聚糖酶。低温。
27、木聚糖酶在室温有非常高的活性， 因其不需要外加能量供酶促反应，所以在工业和农业上的应用可以节省大量的能源。本发 明的木聚糖酶最适pH为5.0，在pH 3-6都有较高的酶活性；在低温下有很高的催化活性， 催化效率要比其它的低温木聚糖酶高，即使在0时仍然具有约27的相对活性。在食品 工业中，低温木聚糖酶与果胶酶及纤维素酶同时在低温作用可有效降低果汁黏度，有效提 高果汁口味，同时在面包的发酵过程中添加低温木聚糖酶(面包发酵一般在20度左右) 可以改善面包的品质，增加面包的口感。在饲料工业中，低温木聚糖酶可以作为水产饲料添 加剂使用，降低饲料的黏度，增加营养物质的吸收。 附图说明 0079 图1在毕赤。
28、酵母菌中表达的本发明重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1：蛋白 质Marker；2：含有木聚糖酶基因的毕赤酵母菌培养上清液浓缩液；3：纯化的重组木聚糖 酶；4：脱糖基后的木聚糖酶。 0080 图2本发明重组木聚糖酶的最适pH。 0081 图3本发明重组木聚糖酶的pH稳定性。 0082 图4本发明重组木聚糖酶的最适温度。 0083 图5本发明重组木聚糖酶的热稳定性。 具体实施方式 0084 试验材料和试剂 说 明 书CN 102399768 A CN 102399767 A 5/9页 7 0085 1、菌株及载体：真菌Bispora antennata CBS 126.38，保存于荷兰真。
29、菌保藏所 (CBS)其保藏号为：CBS 126.38。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen 公司。 0086 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。 燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。 0087 3、培养基： 0088 (1)真菌Bispora antennata CBS 126.38培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃 薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH 5.0。 0089 (2)大肠杆菌培养基LB(1蛋白胨、0.5酵母提取物、1NaCl，pH 7.0)。 。
30、0090 (3)BMGY培养基：1酵母提取物，2蛋白胨，1.34YNB，0.00004Biotin，1 甘油(V/V)。 0091 (4)BMMY培养基：除以0.5甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。 0092 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照分子克隆实验 指南(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。 0093 实施例1真菌Bispora antennata CBS 126.38产酶特性 0094 将Bispora antennata CBS 126.38经麦芽提取物培养基培养后，接种于诱导培养 基中(0.2。
31、MgSO 4 7H 2 O，0.1KH 2 PO 4 ，0.1CuSO 4 5H 2 O，0.1CaCl 2 ，0.5蛋白胨，1玉 米芯粉，1麸皮，pH 5.0)，30培养34d，测定其产纤维素酶和半纤维素酶的活性。经 测定该菌为高产木聚糖酶菌株。 0095 实施例2真菌Bispora antennata CBS 126.38木聚糖酶编码基因BA-xyl11A的 克隆 0096 提取真菌Bispora antennata CBS 126.38基因组DNA： 0097 将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65水浴锅裂。
32、解20min，每隔10min混匀一次，在 4下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异 丙醇，于室温静置5min后，4下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70的乙醇洗涤两 次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20备用。 0098 根据第十一家族木聚糖酶基因的保守(P-L-I/V/A/M-E-Y-Y和 T-F-QN-Q-Y-W-S)序列设计合成了简并引物P1，P2 0099 P1：5-TAC/TA/CTGA/G/TSA/T/G/CC/GTC/G/TTAC/TGGC/G/T TGG-3； 0100 P2：5-ACCAGTAC/TTGA/C/。
33、G/TTA/C/G/TA/GAAA/C/G/TGT-3。 0101 以Bispora antennata CBS 126.38总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数 为：94变性5min；然后94变性30sec，48退火30sec，72延伸1min，30个循环后72 保温10min。得到一约200bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术 有限公司测序。 0102 根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计 方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每 说 明 书CN 102399768。
34、 A CN 102399767 A 6/9页 8 两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22-30nt，退火温度在6065。并将 它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物) 见表1。 0103 表1.木聚糖酶BA-xyl11A TAIL-PCR特异性引物 0104 0105 通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博 生物技术有限公司测序。 0106 实施例3木聚糖酶基因的RT-PCR分析 0107 提取Bispora antennata CBS 126.38的总RNA，利用反转录酶得到c。
35、DNA的一条 链，然后设计恰当的引物(Xyl11A F：5-ATGGTATCCTTCTCCTCCCTCATC-3，Xyl11A R： 5-CTATGAAACGGTGATAGTTGCT-3)扩增该单链cDNA，获得木聚糖酶的cDNA序列，扩增得 到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。 0108 通过比较木聚糖酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有1个内含子，cDNA长 660bp，编码219个氨基酸和一个终止密码子，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列。所 测出的基因BA-xyl11A的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的木聚糖酶氨基酸序列 最高一致性为71，证明从Bispora 。
36、antennata CBS 126.38中分离克隆得到的编码木聚糖 酶的基因为新基因。 0109 实施例4重组木聚糖酶的制备。 0110 将毕赤酵母表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码木聚糖酶的基 因BA-xyl11A双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段(不含信号肽片段， SEQ ID NO.5)与表达载体pPIC9连接，获得含有Bispora antennata CBS126.38木聚糖酶 基因BA-xyl11A的重组质粒pPIC9-BA-xyl11A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母 菌株GS115/BA-xyl11A。同样，将。
37、包含有信号肽序列的木聚糖酶BA-XYL11A的cDNA(SEQ ID NO.4)通过酶切、连接方法插入已去除-因子信号肽序列的表达载体pPIC9中，获得含自 身信号肽序列的编码木聚糖酶的基因BA-xyl11A的重组质粒pPIC9-BA-xyl11A-1并转化毕 赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/BA-xyl11A-1。 0111 挑取GS115/BA-xyl11A和GS115/BA-xyl11A-1重组菌株，分别接种于300mLBMGY 培养液中，30250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于100mLBMMY培养基重悬， 30250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收。
38、集上清。测定木聚糖酶的活力。GS115/BA-xyl11A 说 明 书CN 102399768 A CN 102399767 A 7/9页 9 菌株所产重组木聚糖酶的表达量为516U/mL，相比之下，GS115/BA-xyl11A-1菌株所产重组 木聚糖酶的表达量低于前者。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到 了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其目标蛋白质的含量达到总蛋白的90以上，达 到电泳纯。 0112 实施例5重组木聚糖酶的活性分析 0113 DNS法：具体方法如下：在pH 4.5，40条件下，1mL的反应体系包括100L适当 的稀释酶液，900L底物，反应。
39、10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm 测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1mol还原糖的酶量。 0114 实施例6重组木聚糖酶BA-XYL11A的性质测定 0115 1、重组木聚糖酶BA-XYL11A的最适pH和pH稳定性的测定方法如下： 0116 将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。 底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中40下进行木聚糖酶活力 测定。结果(图2)表明，BA-XYL11A的最适pH为5.0，在pH 3.5-6.0的范围内，酶活性均 维持在最大酶活性的。
40、40以上。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37处理60min， 再在pH 5.0缓冲液体系中40下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明木聚 糖酶在pH 4.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在90以上， 这说明此酶具有较好的pH稳定性。 0117 2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下： 0118 木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)缓冲液体 系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在 40下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为40。酶的 热稳定性。
41、性试验表明(图5)，重组酶在40时稳定性非常好，50下保温30min，剩余酶活 性为39.6，即使在0，仍具有约27的相对活性。 0119 3、木聚糖酶的K m 值测定方法如下： 0120 用不同浓度的木聚糖(4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，Sigma From birchwood)为 底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)缓冲液体系中，40下测定酶活性，计算出其 在40下的k m 值。经测定，此木聚糖酶在40下以木聚糖为底物的k m 值为11.3mg/mL，最 大反应速度V max 为10570.8mol/minmg。 0121 4、不同金属离子化学试剂对BA。
42、-XYL11A酶活的影响测定如下： 0122 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性 的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在40、pH 5.0条件下测定酶活性。结果(表 2)表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组木聚糖酶的活力有一定的激活作 用，但是Cu 2+ 、Pb 2+ 、Zn 2+ 有一定的抑制其活力。当Co 2+ ，Cu 2+ ，Pb 2+ ，Fe 3+ 浓度为5mmol时可以 部分抑制BA-XYL11A活力。-巯基乙醇在1mmol和5mmol时能分别使重组酶活力增加到 原来的1.2和1.15倍。 0123 表2.各种化学试剂对木聚糖。
43、酶BA-XYL11A活力的影响 说 明 书CN 102399768 A CN 102399767 A 8/9页 10 0124 0125 0126 注：“-”代表无法检测。 0127 5、木聚糖酶抗蛋白酶能力测定如下： 0128 用重组的纯化蛋白BA-XYL11A(100g/mL)分别与约150U的胰蛋白酶(pH 7.0， 25)、10U的-糜蛋白酶(pH 7.8，25)、10U的胶原蛋白酶(pH 74，37)、5U的枯草 杆菌蛋白酶A(pH 7.5，37)、或胃蛋白酶(pH 2.0，37)中处理60min后，按标准方法 在最适温度和最适pH下检测已处理酶的剩余酶活。对照酶液用配制蛋白酶液的相。
44、应缓冲 液处理相同的时间，以其酶活作为对照计算相对酶活。经过各种蛋白酶处理一小时后的 BA-XYL11A酶活力变化结果表明：70.7(胰蛋白酶)，711(-糜蛋白酶)，66.2(枯 草杆菌溶素A)和42.6(胃蛋白酶)；从以上结果可以看出：BA-XYL11A对这四种蛋白酶 都有较好的抵抗能力。 0129 6、重组木聚糖酶BA-XYL11A的底物特异性。 0130 该酶可以有效地降解不同来源的木聚糖，例如桦木和榉木木聚糖，同时该酶对不 可溶性木聚糖(Insoluble xylan)和羧甲基纤维素钠也具有弱的活性，但对于大麦-葡 聚糖、微晶纤维素等底物没有活性(表3)。 说 明 书CN 10239。
45、9768 A CN 102399767 A 9/9页 11 0131 表3.木聚糖酶BA-XYL11A底物特异性分析 0132 说 明 书CN 102399768 A CN 102399767 A 1/3页 12 0001 0002 序 列 表CN 102399768 A CN 102399767 A 2/3页 13 0003 序 列 表CN 102399768 A CN 102399767 A 3/3页 14 序 列 表CN 102399768 A CN 102399767 A 1/3页 15 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102399768 A CN 102399767 A 2/3页 16 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102399768 A CN 102399767 A 3/3页 17 图5 说 明 书 附 图CN 102399768 A 。