血塞通软胶囊及其制备工艺 本发明涉及含有三七总皂甙有效剂量的软胶囊剂口服药物及其制备工艺。
三七总皂甙(Panax Notoginseng Saponins)是五加科人参属植物三七(PanaxNotoginseng(Burk.)F.H.Chen)的芦头按一定工艺提取的总皂甙，为淡黄色无定性粉末，味苦微甘，易溶于水.甲醇、乙醇，难溶于丙酮、乙醚和苯，易吸潮。具有活血祛瘀，通脉活络，抑制血小板聚集和增加脑血流量的作用。用于脑血管病后遗症，视网膜中央静脉阻塞，眼前房出血等。三七总皂甙毒性低，副作用极小。
以三七总皂甙为主要有效成分的“血塞通注射液”对脑梗塞和脑溢血后遗症表现的瘫痪有较好疗效，对心、肝、肾、脾和胃功能无损害，也无明显毒副作用。以三七总皂甙为主要有效成分的口服制剂有硬胶囊、冲剂、片剂。片剂和硬胶囊等已有的口服制剂，其中有效成分三七总皂甙在水性介质中溶解速度较慢，溶解过程中易发粘、结块结团，再溶解比较困难；并且三七总皂甙中主要有效成分如Rb1和Rg1等分子量较大，消化道吸收慢而且少，主药大量经粪便排出体外，生物利用度低。因此已有的口服制剂对脑中风、冠心病心绞痛等无法达到理想效果，仅能以强身健体、降低血脂、改善心血管疾病等保健功能应用于临床。注射液临床使用不如口服制剂方便，安全性不如口服制剂。特别是对易污染的中药注射剂，虽经灭菌也很难保证其有效成分的稳定。现许多厂家的“血塞通注射液”产品就常出现变色，结晶或沉淀等质量问题。此外有研究资料表明，心血管病人对钠离子等金属离子较为敏感，特别是大量的钠离子会限制临床的应用范围。血塞通注射液中就有钠离子。再者水针剂安瓿易碎易损，在北方冬天会结冰。
本发明的目的是提供一种以三七总皂甙为主要有效成分的血塞通软胶囊及其制备工艺，产品系口服给药剂型，能够克服已有剂型的缺点，生物利用度高，满足该类剂型在外观、硬度、崩解度等和理化稳定性方面的标准。
本发明产品由药液和囊壳两大部分构成，其特征是药液按重量每粒含有三七总皂甙40-250毫克、并含有溶剂和稳定剂，囊壳中含有明胶10份，甘油3.25-3.35份(重量比)和防腐剂。
溶剂可是液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇、水及植物油(如豆油、花生油、茶油等)中的一种或几种。
防腐剂可是甘油、丙二醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸苄酯、对羟基苯甲酸苯酯中的一种或几种。
稳定剂可是水、甘油、吐温-80、乙氧基氢化蓖麻油(Gremophor RH 40)、大豆卵磷脂、蜂蜡、单硬脂酸铝、乙基纤维素、固态聚乙二醇中的一种或几种。
囊壳的配方中明胶、甘油配比难以掌握。甘油的量太多，囊壳较软，比较容易受挤压变形；甘油的量太少，囊壳较硬、脆，影响软胶囊的质量稳定性及崩解时间。我们对囊壳的明胶、甘油的配比进行了详细的试验研究，最后获得了一个较好地配比。
将适量明胶加入不锈钢溶胶罐中，再加入适量水，密闭，70℃保温3小时，再分别加入试验用量的甘油、防腐剂，搅拌，抽真空脱气2小时，放入明胶保温桶中70℃保温静置过夜，第二天，压胶丸，室温干燥，留样考察三个月，考查囊壳外观和物理性能，结果如下： 指标/试验 内容明胶10kg甘油3.0kg明胶10kg甘油3.2kg明胶10kg甘油3.25-3.35kg明胶10kg甘油3.4kg明胶10kg甘油3.6kg 囊壳外观及 物理性能太硬、易脆太硬、易脆合适较软、易吸潮较软、易吸潮
说明：所筛选出的囊壳配方适用于温暖潮湿的地方。
通过以上试验，可以得出结论，囊壳的配方中应含有明胶10份，甘油3.25-3.35份(重量比)。
胶丸每粒含主药--三七总皂甙的量是确定的；考虑经济因素及制备方便选定每丸的大小，最终可确定实施例的药液配方。
本发明产品的最佳配方中含有：组 份 量(克/粒)三七总皂甙 0.04-0.25溶剂 0.25-0.40稳定剂 0.02-0.05
血塞通软胶囊的制备工艺包括以下步骤：
工艺1：将三七总皂甙打粉过80-120目筛后，在搅拌状态下逐渐加入到液态聚乙二醇中，加热使溶液保温在50-70℃并搅拌使其溶解，溶解后加入水和甘油等，搅拌使其混合均匀，过滤、脱气后压丸、干燥，即得。
工艺2：将三七总皂甙打粉过80-120目筛后，按处方配比投料，先将稳定剂热溶于部分溶剂内，再将热溶物缓慢地加进预热到35-45℃的剩余溶剂内，边加边搅拌，然后再将各种固体逐一加入，每次加入后充分混合，以保证完全湿润，过胶体磨粉碎后压丸、干燥，即得。
本品为黄色透明软胶囊。
本发明的积极效果是提供了一种以三七总皂甙为主要有效成分的血塞通软胶囊及其制备工艺，产品系口服给药剂型，能够克服已有剂型的缺点，生物利用度高，满足该类剂型在外观、硬度、崩解度等和理化稳定性方面的标准。
本发明按上述工艺制备，其详细组份由下列实施例给出，但本发明的保护范围，不局限于此。实施例1组 份 量(克/粒)三七总皂甙 0.1聚乙二醇 0.33甘油 0.023水 适量胶囊壳 0.17实施例2组 份 量(克/粒)三七总皂甙 0.15异丙醇 0.35乙氧基氢化蓖麻油 0.04甘油 0.03水 适量胶囊壳 0.19实施例3组 份 量(克/粒)三七总皂甙 0.05聚乙二醇 0.2 7乙氧基氢化蓖麻油 0.041甘油 0.04水 适量胶囊壳 0.14实施例4组 份 量(克/粒)三七总皂甙 0.2液态聚乙二醇 0.4固态聚乙二醇 0.018甘油 0.03水 适量胶囊壳 0.19实施例5组 份 量(克/粒)三七总皂甙 0.1玉米油 0.30大豆卵磷脂 0.01蜂蜡 0.03水 适量胶囊壳 0.15实施例6组 份 量(克/粒)三七总皂甙 0.05水 适量吐温-80 0.003豆油 0.17大豆卵磷脂 0.006乙基纤维素(100cps) 0.025胶囊壳 0.12
实施例1至4的胶囊(壳)皮膜液的组成：
明胶 100kg
甘油 35kg
水 适量
对羟基苯甲酸甲酯 0.22kg
对羟基苯甲酸丙酯 0.055kg实施例5至6的胶囊(壳)皮膜液的组成：
明胶 100kg
甘油 33kg
水 适量
对羟基苯甲酸乙酯 0.25kg
实施例的制备工艺为：
工艺1：将三七总皂甙打粉过100目筛后，在搅拌状态下逐渐加入到液态聚乙二醇中，加热使溶液保温在60℃左右并搅拌使其溶解，溶解后加入水和甘油等，搅拌使其混合均匀，过滤、脱气后压丸、干燥，即得。或者：
工艺2：将三七总皂甙打粉过100目筛后，按处方配比投料。先将稳定剂热溶于适量的液体基质内，再将热溶物缓慢地加进预热到40℃的剩余基质内，边加边搅拌，然后再将主药等各种固体逐一加入，每次加入后充分混合，以保证完全湿润，过胶体磨粉碎后压丸、干燥，即得。
根据新药(中药)稳定性试验胶囊剂项下的要求，对血塞通软胶囊三批样品在室温条件、及光照(在光照度为2800LX下照240小时)和湿度影响因素进行了质量观察，并测定了各项数据，结果如下：
表1 970125-1批室温留样初步考察结果 留样时间 (月) 外观 薄层层析 崩解时限 (分钟) Rb1含 量 (％) Rg1含 量 (％) 总皂甙含 量 (％) 0完整胶丸，内含黄色澄明的粘稠 液体 主斑点与对 照品一致 6.5 37.52 28.48 100.05 1 同上 同上 8 37.40 28.21 99.68 3 同上 同上 9.5 37.22 28.07 99.07 6 同上 同上 15 37.01 27.74 98.89 12 同上 同上 17 36.84 27.51 98.02
表2 970125-2批室温留样初步考察结果留样时间 (月) 外观薄层层析崩解时限(分钟)Rb1含 量 (％)Rg1含 量 (％)总皂甙含量 (％) 0完整胶丸，内含黄色澄明的粘稠 液体主斑点与对照品一致 6.5 36.02 29.73 97.82 1 同上同上 7 35.86 29.63 97.53 3 同上同上 8.5 35.75 29.11 97.22 6 同上同上 14 35.90 28.90 97.59 12 同上同上 17 35.01 27.81 96.24
表3 970125-3批室温留样初步考察结果留样时间(月) 外观 薄层层析崩解时限(分钟)Rb1含 量(％)Rg1含 量(％)总皂甙含量 (％) 0完整胶丸，内含黄色澄明的粘稠 液体主斑点与对 照品一致 7 35.09 29.03 98.61 1 同上 同上 7 34.87 28.54 98.24 3 同上 同上 9 34.94 28.48 98.42 6 同上 同上 14 34.38 28.61 97.98 12 同上 同上 18 34.06 28.32 96.79
表4光对血塞通胶丸的影响 批号 外观 薄层层析崩解时限(分钟) Rb1含 量 (％) Rg1含 量 (％) 总皂甙含量 (％) 970125- 1 完整胶丸，内含 黄色澄明的液体 无变化 15 36.91 28.03 99.22 970125- 2 同上 同上 13 35.77 29.32 97.36 970125- 3 同上 同上 14 34.80 28.19 98.23
表5湿度对血塞通胶丸的影响 项目条件 批号 外观 薄层 层析 崩解时 限(分 钟) Rb1含 量 (％) Rg1含 量 (％) 总皂甙 含量 (％) 970125 -125℃ RH75％ 970125-2 (密封) 970125-3完整胶丸，内含黄色澄明的粘稠液体 同上 同上无变化无变化无变化 10 10 9 37.28 35.82 34.91 28.31 29.28 28.66 99.81 97.43 98.19 970125 -125℃ RH90％970125-2(密封) 970125-3完整胶丸，内含黄色澄明的粘稠液体 同上 同上无变化无变化无变化 12 12 10 37.03 35.23 34.41 28.14 28.72 27.84 99.89 97.24 97.52
注：软胶囊剂的崩解时限规定为：1小时以内(中国药典一九九五年版二部附录64页)。含量限为90-110％。
本发明通过下面试验证明其性能：一、动物急性毒性试验
材料：
1、血塞通胶丸：每丸含三七总皂甙100mg。昆明制药股份有限公司研究开发中心提供，批号：970125-2.加热，加蒸馏水溶解稀释至所需剂量浓度，38℃水溶恒温备用；
2、实验动物：ICR小鼠由云南省天然药物药理重点实验室提供，(云卫动管第A12号)雌雄各半，W:19-21g，观察饲养环境与该室普通小鼠相同。
试验方法及给药方案：
正式试验前预试，按孙氏改良寇氏综合计算法设计给药方案，共分五组，按0.4ml/10g灌胃，6h内连续给药2次，药液0.8等比稀释，最大剂量组2次给药剂量为10g/kg，动物随机分组，每组10只，药前面2h停食，药后正常饲养观察，并记录中毒表现及死亡情况，死亡动物剖检，肉眼观察各主要脏器的中毒性病变，存活动物继续饲养观察一周。
试验结果：
高剂量组第一次给药后6h内即有部分动物死亡，动物死亡多发生在药后24h以内，部分动物稀便，不进食，镇静。死亡动物肠胃充液，充气，肠系膜充血。48h不死亡动物即可健康存活，一周内逐日恢复正常，给药情况及结果见下表：
血塞通胶丸小鼠急性毒性试验(ig) 组别 剂量(mg/kg) 动物数(只)死亡数(只)存活数(只) 1 2 3 4 5 10000 8000 6400 5200 4100 10 10 10 10 10 9 7 5 2 0 1 3 5 8 10LD50=6730mg/kgLD5095％可信限为6730±1260mg/kg二、动物长期毒性试验
材料和方法：
1、药物：血塞通胶丸由昆明制药股份有限公司提供，批号：970125-1，规格为100mg/丸，每045ml含主药100mg。
2、动物：SD大鼠80只，雌雄各半，由云南省天然药物药理重点实验室提供(云卫动管第A12号)。
3、方法：将动物随机分成4组，每组20只，雌雄各半，分笼饲养，投药前观察一周，待各组动物活动、进食、粪便等情况均无异常，然后开始投药。
(1)小剂量组：按150mg/kg/日给药。
(2)中剂量组：按450mg/kg/日给药。
(3)大剂量组：按750mg/kg/日给药。
(4)对照组：给予空白溶剂。
上述四组均按0.3375ml/100g，每天上午灌胃一次，共计56天，中间不停药。
检查项目：每周称体重，并随之调整给药剂量，笼旁观察皮毛、眼、鼻、粘膜、呼吸、行为、活动、进食、饮水和二便性状等；用药结束后，采血检查五项血液学指标：红细胞(RBc)，白细胞(WBc)，血小板(PLT)，血色素(Hb)及白细胞分类；
11项血液生化指标：丙氨酸氨基转移酶(ALT)，血清谷草转氨酶(AST)，血清总蛋白(TP)，血清尿素氮(BUN)，肌酐(Crea)，总胆固醇(T-CH0)，血糖(Glu)，白蛋白(ALB)。
AST/ALT,A/G；2/3的动物作病理学检查：系统尸检；心，肝，脾，肺，肾，脏器系数；脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺，胸腺，卵巢，睾丸，子宫组织学光镜检查和1/3的动物留存观察2周。
试验结果：
1、血塞通软胶丸各个剂量组及空白溶剂对照组在56天试验期内均活动正常，行为活泼，毛色光润，未见粪便异常，无一死亡。
2、四组动物体重增长情况基本一致。
3、血液学检查，血塞通各个剂量组与对照组比较均无差异性。
4、血液生化检测，除小剂量雄鼠ALT高于对照组外，其余与对照组比较均无差异性。
5、四组动物的脑，心，脾，肺，肾，肾上腺，胸腺，卵巢，睾丸，子宫等11种脏器外观正常，病理解剖学及病理组织学检查均无特殊的病理学改变。
血塞通软胶丸成人用量15mg/kg/日，据此，大鼠长期毒性试验，大、中、小剂量分别相当于成人用量的50,30。及10倍，故采用大剂量的1/50作为临床用药的上限，即15mg/kg/日是安全的。
鉴于本品小鼠LD50(6730mg/kg)为临床推荐剂量的400倍以上，56天长期毒性试验各项指标无异常，故留存动物免作病理学检查，且可免作犬的长期毒性试验。
三、血塞通的主要药效学实验：
实验材料：
(一)药物：血塞通胶丸(昆明制药股份有限公司，批号：970125，实验时取囊心药液用生理盐水稀释)血塞通注射液(昆明制药股份有限公司，批号：970351-07)
(二)动物：小鼠，昆明种，大鼠，SD种，均购自云南省天然药物药理重点实验室家兔，雌雄各半，2.0-3.0kg，购自昆明医学院动物科。
(三)其它：722型可见光分光光度计，BS-631型血小板聚集仪，MP120-1型电子天平，试剂均为分析纯或药用规格(其中，血小板活化因子及花生四烯酸为Sigma公司产品，二磷酸腺苷为瑞士进口分装)。
实验方法
(-)脑缺血保护实验
1、参照文献方法制备不完全性脑缺血模型(结扎颈总动脉合并降压法)：用戊巴妥钠麻醉大鼠，分离出左右颈动脉及股动脉。联接血压测量装置，结扎左右颈总动脉并从股动脉放血降压至5.3-6.00kPa(40-45mmHg)(假手术对照组不结扎动脉亦不放血)，在维持该血压使脑缺血30min后将血重新注入大鼠恢复大脑灌注，此时鼠脑既遭受缺血损伤，亦产生再灌注损伤。
(1)脑缺血后脑含水量的测定：取雄性大鼠55只(264±17g)随机分为5组，实验前6小时口服灌胃受试药物(假手术对照组及脑缺血模型组灌胃同量生理盐水，下同)，实验时再灌胃给药一次，既按上法制备缺血模型，在恢复血液灌注后再十二指肠给药一次，3小时后断头取前脑，称重，置110℃烤至恒重，计算脑含水量％(脑含水量％=(湿重-干重)/湿重×100％)。
(2)脑缺血后脑毛细血管通透性的测定：取大鼠55只(244±16g，雌雄各半)，随机分为5组，实验前6小时口服灌胃受试药物，实验时再灌胃给药一次，按上法制备缺血模型，在结扎颈总动脉前10min分别静注伊文思兰60mg/kg，在恢复血液灌注后再十二指肠给药一次，5小时后断头取前脑，称重，置甲酰胺溶液中，在45℃下温育60小时后用分光光度计在632nm处测吸收度，根据标准曲线计算出脑内伊文思兰的含量(ug/g湿脑重)。
(3)脑缺血后脑组织形态学的检查：取大鼠20只(259±19g，雌雄各半)，随机分为5组，实验前6小时口服灌胃受试药物，实验时再灌胃给药一次，按上法制备缺血模型，在恢复血液灌注后再十二指肠给药一次，3小时后断头取前脑，福尔马林固定，冠状切片，HE染色，光境检查。
2、小鼠常压下耐缺氧实验：取小鼠56只(23.8±1.8g，雌雄各半)，随机分为4组，于实验前6小时及30min分别灌胃给药两次，将小鼠置装有钠石灰的玻璃干燥器内(联接一调压瓶使压力与外界相等)，密闭并计时，记录小鼠缺氧死亡时间。
3、小鼠断头后张口实验：取雄性小鼠64只(24.2±1.7g)，随机分为4组，于实验前6小时及30min时分别灌胃给药两次，实验时将小鼠鼠头剪下，立即记录张口喘气时间。
(二)抗凝血实验
1、凝血时间影响实验：：取小鼠60只(23.8±1.7g，雌雄各半)，随机分为5组，于实验前6小时及30min分别灌胃给药两次，实验时摘眼球取血用毛细管法测定凝血时间。
2、血小板聚集功能影响实验：按Bron氏比浊法进行体外实验，采兔血制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)调节PRP中血小板数至5×108cell/L，分别取药液与FRP混合，温育20min，分别加入诱导剂血小板活化因子(PAF)(终浓度为7.2hmol/L)，花生四烯酸(从)(终浓度为0.35mmol/L)，二磷酸腺苷(ADP)(终浓度为3umol/L)诱导血小板聚集，用血小板聚集仪测定血小板最大聚集百分率，并计算药物的血小板聚集抑制率。
上述实验数据用X±SD表示，全部实验结果均用方差分析法进行统计分析。
结果：
1、血塞通胶丸对脑缺血后脑含水量的影响
脑缺血模型组脑含水量与假手术组比较有显著性差异，脑含水量明显升高，血塞通胶丸(200、100mg/kg,po)与血塞通注射液(60kg；iv)均能使脑缺血后脑含水量明显下降，减轻脑水肿。同时，血塞通胶丸还显示出明显的量效关系。
2、血塞通胶丸对脑缺血后脑血管通透性的影响
脑缺血模型组脑组织中伊文思兰含量与假手术组比较明显升高，此结果说明脑缺血可使脑血管通透性升高，血塞通胶丸(100、200mg/kg,po)与血塞通注射液(60mg/kg；iv)均能使脑缺血后脑中伊文思兰含量明显下降，说明此二药可抑制脑缺血后脑血管通透性的升高。
3、血塞通胶丸对脑缺血后脑组织形态学的影响
境下可见假手术对照组大鼠脑神经细胞及神经胶质细胞形态正常，核膜清楚，核仁明显，胞浆透亮或淡染，胞膜清楚，脑缺血模型组大鼠脑组织出现明显病理改变，在额头、顶叶、颞叶皮层及海马等处可见神经细胞核固缩(缩小呈三角形，深染，核仁消失)、核溶解(核结构淡染、消失、核轮廓不清)，这些部位的神经细胞半数以上出现缺血性坏死及神经细胞脱失等改变，另见神经胶质细胞明显肿胀，间质血管扩张充血，间质疏松水肿明显。血塞通胶丸(100、200mg/kg,po)组及血塞通注射液(60mg/kg；iv)组脑组织神经细胞核固缩、核溶解等缺血变化与脑缺血模型组相比明显降低，只有极少数神经细胞出现死亡，神经胶质细胞肿胀及间质疏松亦明显减轻，呈现出明显的缺血保护作用。
4、血塞通胶丸对小鼠常压耐缺氧能力的影响
给血塞通胶丸(200mg/kg,po)与血塞通注射液(120mg/kg；iv)有明显延长小鼠存活时间的作用。
5、血塞通胶丸对小鼠断头后张口呼吸时间的影响
给血塞通胶丸(200mg/kg,po)与血塞通注射液(60mg/kg；iv)均有延长小鼠张口呼吸时间的作用。
6、血塞通胶丸对小鼠凝血时间的影响
给血塞通胶丸(200mg/kg,po)与血塞通注射液(120mg/kg；iv)均有延长凝血时间的作用。
7、血塞通胶丸对血小板聚集功能的影响
血塞通胶丸在0.625-2.5mg/ml的浓度范围内能显著抑制PAF诱导的血小板聚集，抑制率达15.4-88.5％，在2.5mg/ml的浓度时能显著抑制ADP诱导的血小板聚集，抑制率达39.5％,血塞通注射液在0.625-2.5mg/ml范围内对PAF及ADP诱导的血小板聚集亦有显著抑制作用，抑制率达8.0-75.1％及20.9-33.9％。