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脱氧野尻霉素的一种纯化方法.pdf

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  • 文档编号：4385888
  • 上传时间：2018-09-26
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    • 摘要
    申请专利号：

    CN201110422786.2

    		 申请日：

    2011.12.16
    公开号：

    CN102491938A

    		 公开日：

    2012.06.13
    当前法律状态：

    授权

    		 有效性：

    有权
    法律详情：

    授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07D 211/46申请日:20111216|||文件的公告送达IPC(主分类):C07D 211/46收件人:殷红文件名称:手续合格通知书|||专利申请权的转移IPC(主分类):C07D 211/46变更事项:申请人变更前权利人:北京贯虹科技集团有限公司变更后权利人:中科医药行业生产力促进中心有限公司变更事项:地址变更前权利人:100081 北京市海淀区中关村南大街2号1号楼11层A座1201变更后权利人:100038 北京市海淀区羊坊店路18号海天大厦二期N座(北段)9层903登记生效日:20140814|||著录事项变更IPC(主分类):C07D 211/46变更事项:发明人变更前:殷红变更后:王福清 王福华 殷红|||公开
    IPC分类号：

    C07D211/46; C08B37/00

    		 主分类号：

    C07D211/46
    申请人：

    北京贯虹科技集团有限公司
    发明人：

    殷红
    地址：

    100081 北京市海淀区中关村南大街2号1号楼11层A座1201
    优先权：

    专利代理机构：

    		代理人：

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    内容摘要

    本发明涉及一种从植物内提取化合物的纯化技术，从天然产物桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素，同时精制获得桑叶多糖的方法，主要包括以下步骤：原料预处理后溶于乙醇溶液，超声波提取，提取液浓缩后过阳离子树脂，洗脱液浓缩后经有机溶剂萃取、重结晶、凝胶过滤层析后制备获得1-脱氧野尻霉素精制品，纯度不低于98.5％。本工艺操作简单，成本低，环境污染低，设备典型，材料易于获得，适合大规模生产。

    权利要求书

    1： 脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于 ： (1) 桑叶药材除杂， 干燥后粉碎， 过筛， 得提取用桑叶粉末 ； (2) 原料粉末在乙醇溶液内浸泡后， 超声波提取， 分离固液相后获得提取液， 提取液浓 缩并回收乙醇， 离心， 去沉淀 ； (3) 将步骤 (2) 得到的的离心浓缩液过阳离子树脂层析柱 ： 上样后用蒸馏水冲洗至流 出液无色为止， 用氨水洗脱， 收集 pH 9-12 段洗脱液， 浓缩至小体积 ； (4) 将步骤 (3) 得到的浓缩液调节 pH 值至 7.0 左右， 以氯仿萃取， 留水相 ； (5) 将步骤 (4) 的水相用正丁醇萃取， 保留正丁醇相， 浓缩后收集析出固体 ； (6) 将步骤 (5) 析出的固体用无水乙醇进行重结晶 ； (7) 将步骤 (6) 获得的晶体溶于水后， 过凝胶过滤层析柱， 流出液浓缩、 干燥获得 1- 脱 氧野尻霉素精制品， 纯度不低于 98.5％。
    2： 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (1) 所述的 桑叶干燥粉碎后过 30 ～ 50 目筛。
    3： 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (2) 所述乙 醇的浸泡浓度为 60％～ 65％， 浸泡时间为 30 ～ 40min。
    4： 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (2) 所述超 声波的提取功率为 125W， 温度 70℃， 提取次数为 2 ～ 3 次， 每次 30min。
    5： 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (3) 中所述 的阳离子树脂为 AB-8、 732H、 D152， 氨水的洗脱浓度为 0.25 ～ 0.30mol/L， 洗脱速度为 1 ～ 2mL/min。
    6： 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (4) 所述 pH 值调节液为盐酸、 醋酸， 氯仿与浓缩液的体积比为 1 ∶ 2-1 ∶ 4， 萃取次数为 2 ～ 4 次。 7. 如权利要求 1 所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (5) 所述正丁 醇与水相的体积比为 1 ∶ 2-1 ∶ 4， 萃取次数为 4 ～ 6 次。 8. 如权利要求 1 所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (6) 所述无水 乙醇重结晶的次数为 2 ～ 3 次。 9. 如权利要求 1 所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (7) 所述凝胶 过滤层析柱 Superose 4B、 Sephdex 20 等， 纯水洗脱。 10. 脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于制备获得 1- 脱氧野尻霉素的同时可制 备获得桑叶多糖 ： (1) 将权利要求 1 步骤 (2) 超声波提取后分离获得的固相加入 2-3 倍体积的蒸馏水， 搅 拌均匀后固液分离获得提取液 ； (2) 将权利要求 10 步骤 (1) 获得提取液浓缩后加入乙醇、 丙酮或异丙醇萃取， 除去脂溶 性部分， 保留水相 ； (3) 将权利要求 10 步骤 (2) 获得水相内加入乙酸乙酯或石油醚萃取， 去除叶绿色， 保留 水相 ； (4) 将权利要求 10 步骤 (3) 获得水相内加入无水乙醇， 使其终浓度达到 80％， 搅拌均 匀后 4℃下静置 48h， 抽滤， 获得沉淀物 ； (5) 将权利要求 10 步骤 (4) 获得沉淀物加水溶解后 4℃下加入三氯乙酸， 终浓度达到 2 20％， 搅拌 20min 后离心， 保留液相， 除蛋白 ； (6) 将权利要求 10 步骤 (5) 获得液相过 AB-8 大孔径吸附树脂， 蒸馏水洗脱， 洗脱液浓 缩后加活性炭脱色， 脱色液加无水乙醇终浓度达到 80％以上， 搅拌均匀后 4℃下静置 48h， 抽滤， 沉淀分别用无水乙醇、 丙酮各洗 3-5 次， 得白色沉淀 ； (7) 将权利要求 10 步骤 (6) 获得沉淀溶解透析 ( 分子量 11000 以上 )， 干燥， 获得白色 粉末， 多糖含量高于 90％。
    7： 0 左右， 以氯仿萃取， 留水相 ； (5) 将步骤 (4) 的水相用正丁醇萃取， 保留正丁醇相， 浓缩后收集析出固体 ； (6) 将步骤 (5) 析出的固体用无水乙醇进行重结晶 ； (7) 将步骤 (6) 获得的晶体溶于水后， 过凝胶过滤层析柱， 流出液浓缩、 干燥获得 1- 脱 氧野尻霉素精制品， 纯度不低于 9
    8： 5％。 2. 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (1) 所述的 桑叶干燥粉碎后过 30 ～ 50 目筛。 3. 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (2) 所述乙 醇的浸泡浓度为 60％～ 65％， 浸泡时间为 30 ～ 40min。 4. 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (2) 所述超 声波的提取功率为 125W， 温度 70℃， 提取次数为 2 ～ 3 次， 每次 30min。 5. 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (3) 中所述 的阳离子树脂为 AB-8、 732H、 D152， 氨水的洗脱浓度为 0.25 ～ 0.30mol/L， 洗脱速度为 1 ～ 2mL/min。 6. 如权利要求 1 中所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (4) 所述 pH 值调节液为盐酸、 醋酸， 氯仿与浓缩液的体积比为 1 ∶ 2-1 ∶ 4， 萃取次数为 2 ～ 4 次。 7. 如权利要求 1 所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (5) 所述正丁 醇与水相的体积比为 1 ∶ 2-1 ∶ 4， 萃取次数为 4 ～ 6 次。 8. 如权利要求 1 所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (6) 所述无水 乙醇重结晶的次数为 2 ～ 3 次。
    9： 如权利要求 1 所述的脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于， 步骤 (7) 所述凝胶 过滤层析柱 Superose 4B、 Sephdex 20 等， 纯水洗脱。
    10： 脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 其特征在于制备获得 1- 脱氧野尻霉素的同时可制 备获得桑叶多糖 ： (1) 将权利要求 1 步骤 (2) 超声波提取后分离获得的固相加入 2-3 倍体积的蒸馏水， 搅 拌均匀后固液分离获得提取液 ； (2) 将权利要求 10 步骤 (1) 获得提取液浓缩后加入乙醇、 丙酮或异丙醇萃取， 除去脂溶 性部分， 保留水相 ； (3) 将权利要求 10 步骤 (2) 获得水相内加入乙酸乙酯或石油醚萃取， 去除叶绿色， 保留 水相 ； (4) 将权利要求 10 步骤 (3) 获得水相内加入无水乙醇， 使其终浓度达到 80％， 搅拌均 匀后 4℃下静置 48h， 抽滤， 获得沉淀物 ； (5) 将权利要求 10 步骤 (4) 获得沉淀物加水溶解后 4℃下加入三氯乙酸， 终浓度达到 2 20％， 搅拌 20min 后离心， 保留液相， 除蛋白 ； (6) 将权利要求 10 步骤 (5) 获得液相过 AB-8 大孔径吸附树脂， 蒸馏水洗脱， 洗脱液浓 缩后加活性炭脱色， 脱色液加无水乙醇终浓度达到 80％以上， 搅拌均匀后 4℃下静置 48h， 抽滤， 沉淀分别用无水乙醇、 丙酮各洗 3-5 次， 得白色沉淀 ； (7) 将权利要求 10 步骤 (6) 获得沉淀溶解透析 ( 分子量 11000 以上 )， 干燥， 获得白色 粉末， 多糖含量高于 90％。

    说明书


    脱氧野尻霉素的一种纯化方法

        技术领域 本发明属于生物与新医药技术领域， 涉及从植物中提取活性化合物， 即从桑叶中 提取分离高纯度的 1- 脱氧野尻霉素及高附加值副产物桑叶多糖。
         背景技术 1- 脱氧野尻霉素 (1-deoxynojirimycin， 以下简称 “1-DNJ” ) 是一种多羟基哌啶生 物碱， 因其结构类似单糖也称为亚胺基糖， 其化学名称是 3， 4， 5- 三羟基 -2- 羟甲基四氢吡 啶， 化学结构式如图 1 所示， 分子式为 C6H13NO4， 分子量为 163。1-DNJ 具有多种生物活性， 可 用于治疗糖尿病、 肥胖症、 病毒感染等疾病， 同时可抑制肿瘤， 对 α- 葡萄糖淀粉酶有抑制 作用， 并可用作载体用于高纯度麦芽糖的酶合成。
         图 1.1- 脱氧野尻霉素的化学结构式
         自然界中以桑叶中 1-DNJ 的含量最高， 1-DNJ 提取方法有稀酸浸提法、 煎煮法和醇 浸提法。国内 1-DNJ 提取纯化相关专利较少， 其中申请号为 200410048393.X 的专利提供一 种 1-DNJ 煎煮提取法， 该方法工艺简单， 收率高， 然而产品纯度不高且煎煮过程中易造成目 标产物结构的破坏， 影响产物的活性 ； 申请号为 200710067498.3 的专利提供了一种 1-DNJ 稀酸浸提提取法， 该方法操作简便， 适合工业化生产， 然终产物内 1-DNJ 的含量仅能达到 10％， 难以满足医药行业的应用标准 ； 申请号为 20110038204.0 提供了一种 1-DNJ 的醇浸 提提取法， 该方法整个工艺过程中仅使用了乙醇一种有机溶剂， 操作安全， 同时 1-DNJ 的纯 度高， 然而由于桑叶内 1-DNJ 的含量仅为 0.2％左右， 该发明未提供提取废料的利用方法， 仅制备获得 1-DNJ 一种产品难以实现产业化推广。因此， 如何在制备获得高纯度、 高收率 1-DNJ 的同时提高原料的利用率， 制备获得高附加值副产物成为推动我国 1-DNJ 行业发展 的的研究重点。
         发明内容
         本发明的目的是提供脱氧野尻霉素的一种纯化方法， 依此法可有效提高 1-DNJ 的 产率和纯度， 同时获得高附加值的桑叶多糖副产品， 提高原料的利用率， 降低生产成本。
         脱氧野尻霉素的一种纯化方法的技术方案是 ： 一种从桑叶中分离纯化高纯度1-DNJ 及制备高附加值副产物的方法， 包括以下步骤 ：
         1、 从桑叶中提取分离高纯度 1-DNJ
         (1) 原料预处理
         桑叶药材除杂， 干燥后粉碎， 过 40 目筛， 得提取用桑叶粉末。
         (2)1-DNJ 的提取
         称取定量的桑叶原料粉末在乙醇溶液内浸泡后， 125W， 70℃下超声波提取， 分离固 液相后获得 1-DNJ 的粗提液。
         (3)1-DNJ 的纯化
         1-DNJ 的粗提液用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩至小体积， 离心去除沉淀， 上清液过 阳离子树脂层析柱， 上样后用蒸馏水洗至流出液无色为止， 用氨水洗脱， 收集 pH 9-12 段洗 脱液， 浓缩至小体积。
         浓缩液用酸溶液调节 pH 值至 7.0， 加入氯仿进行萃取， 搅拌均匀后静置分层， 保留 水相 ； 水相内加入正丁醇萃取液， 搅拌均匀后静置分层， 保留正丁醇层。
         正丁醇层浓缩析出固体， 抽滤， 滤渣溶解后用无水乙醇重结晶， 最终析出物溶于蒸 馏水， 过凝胶层析柱， 蒸馏水洗脱， 收集 1- 脱氧野尻霉素洗脱液， 浓缩干燥获得 1- 脱氧野尻 霉素成品， 经检测产品纯度可达到 98.5％以上， 总提取率高于 0.10％。 2、 提取高附加值副产物桑叶多糖
         桑叶超声波破碎离心获得的固相部分溶于蒸馏水， 搅拌均匀后离心， 上清液浓缩， 后加入有机溶剂进行萃取， 去除脂溶性部分， 保留水相， 加入有机溶剂萃取， 去除叶绿素， 保 留水相 ；
         萃取获得的水相中加入 95％的乙醇， 使溶液中乙醇终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀溶于蒸馏水， 4℃下加入三氯乙酸， 使终浓度达到 20％， 搅拌 15min 后 3000r/min 离心 30min， 去沉淀， 保留液相 ；
         去蛋白溶液过大孔吸附树脂 AB-8， 洗脱液浓缩后加入活性炭脱色处理， 脱色液加 入 95％的乙醇， 终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀分别用无水乙醇及丙 酮洗涤， 后透析、 干燥， 获得桑叶多糖白色粉末， 经检测产品多糖含量高于 90％， 产品提取率 高于 20％。
         本发明的特点在于 ：
         (1) 将乙醇浸提同超声波提取技术巧妙结合完成 1-DNJ 的提取， 提取效率可达到 96％以上， 为 1-DNJ 的进一步纯化奠定了基础。
         (2) 提取过程中充分考虑 1-DNJ 的特性， 采用树脂层析、 萃取及重结晶技术相结 合， 使 1-DNJ 产品纯度达到 98.5％以上， 总提取率达到 0.10％以上， 产品质量可达到国际同 类产品水平。
         (3) 在 1-DNJ 的提取过程中有效实现了对原材料的高利用率， 在提取制备 1-DNJ 的 同时获得高附加值的桑叶多糖， 产品纯度达到 90％以上， 应用价值高， 同时注意对有机溶剂 的回收利用， 有效降低了提取成本， 同时简化了有机溶剂的回收工艺， 大大降低了能耗， 工 艺技术可达到国内领先水平。
         (4) 本发明生产工艺操作简单， 成本低， 1-DNJ 的提取率高且易分离， 同时设备典 型， 材料易于获得， 十分适合进行大规模生产。
         五、 附图说明
         附图 1 是将原料桑叶预处理后溶于乙醇溶液， 超声波提取， 浓缩， 过阳离子树脂层 析， 洗脱液浓缩后经有机溶剂萃取、 重结晶、 凝胶过滤层析后制备获得 1- 脱氧野尻霉素的 工艺流程图。 六、 具体实施方式
         下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。
         实施例一
         桑叶除杂干燥后， 粉碎过 40 目筛， 取 1kg 桑叶粉末， 加入 40L 65 ％的乙醇浸泡 30min， 后超声波提取 3 次， 每次超声波功率 125W， 温度 70℃， 时间 30min， 抽滤获得相应固相 和液相。
         (1)1- 脱氧野尻霉素的制备
         桑叶超声波破碎离心获得的液相部分用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩至小体积， 离 心去除沉淀， 上清液过装有 732H 型阳离子树脂的层析柱， 用蒸馏水洗至流出液无色为止， 用 0.25mol/L 的氨水洗脱， 洗脱速度 1 倍柱体积 /h， 洗脱速度 1-2mL/min， 收集洗脱液。
         氨水洗脱液浓缩至 1L 左右， 用 2mol/L 的盐酸调节 pH 值至 7.0， 分两次共计加入 0.5L 氯仿萃取液， 搅拌均匀后静置分层， 保留水相， 重复萃取 3 次 ； 减压浓缩至 0.6L， 分2次 加入 0.3L 的正丁醇萃取液， 搅拌均匀后静置分层， 保留正丁醇层， 重复萃取 3 次。
         正丁醇层浓缩至 100mL， 抽滤， 滤渣溶解后用无水乙醇重结晶 3 次， 最终析出物溶 于 10mL 的蒸馏水， 溶液过 Sephdex 20 凝胶层析柱， 蒸馏水洗脱， 收集 1- 脱氧野尻霉素洗脱 液， 浓缩干燥， 获得 1- 脱氧野尻霉素成品， 经检测产品纯度 98.8％， 总提取率 0.11％。
         (2) 桑叶多糖的制备
         桑叶超声波破碎离心获得的固相部分溶于 2 倍体积的蒸馏水， 搅拌均匀后离心， 上清液浓缩， 后加入 0.3L 的丙酮进行萃取， 去除脂溶性部分， 保留水相， 加入 0.3L 乙酸乙酯 萃取， 去除叶绿素， 保留水相 ；
         萃取获得的水相中加入 95％的乙醇， 使溶液中乙醇终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀溶于 0.5L 蒸馏水， 4℃下加入三氯乙酸， 使终浓度达到 20％， 搅拌 15min 后 3000r/min 离心 30min， 去沉淀， 保留液相 ；
         去蛋白溶液过大孔吸附树脂 AB-8， 蒸馏水洗脱， 洗脱液浓缩至 1L， 加入 10g 活性炭 脱色处理， 脱色液加入 95％的乙醇， 终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀 分别用无水乙醇及丙酮各洗涤 4 次， 透析、 干燥， 获得桑叶多糖白色粉末， 经检测产品多糖 含量为 90.2％， 产品提取率 20.5％。
         实施例二
         桑叶除杂干燥后， 粉碎过 40 目筛， 取 1kg 桑叶粉末， 加入 40L 60 ％的乙醇浸泡 40min， 超声波提取 3 次， 每次超声波功率 125W， 温度 70℃， 时间 30min， 抽滤获得相应固相和 液相。
         (1)1- 脱氧野尻霉素的制备
         桑叶超声波破碎离心获得的液相部分用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩至小体积， 离心去除沉淀， 上清液过装有 AB-8 型阳离子树脂的层析柱， 用蒸馏水洗至流出液无色为止， 用 0.25mol/L 的氨水洗脱， 洗脱速度 1 倍柱体积 /h， 洗脱速度 1-2mL/min， 收集洗脱液。
         氨水洗脱液浓缩至 1L 左右， 用 2mol/L 的醋酸调节 pH 值至 7.0， 分两次共计加入 0.25L 氯仿萃取液， 搅拌均匀后静置分层， 保留水相， 重复萃取 4 次 ； 减压浓缩至 0.6L， 分2 次加入 0.3L 的正丁醇萃取液， 搅拌均匀后静置分层， 保留正丁醇层， 重复萃取 3 次。
         正丁醇层浓缩至 100mL， 抽滤， 滤渣溶解后用无水乙醇重结晶， 2 次， 最终析出物溶 于 10mL 的蒸馏水， 溶液过 Sephdex 20 凝胶层析柱， 蒸馏水洗脱， 收集 1- 脱氧野尻霉素洗脱 液， 浓缩干燥， 获得 1- 脱氧野尻霉素成品， 经检测产品纯度 98.6％， 总提取率 0.11％。
         (2) 桑叶多糖的制备
         桑叶超声波破碎离心获得的固相部分溶于 3 倍体积的蒸馏水， 搅拌均匀后离心， 上清液浓缩， 后加入 0.3L 的乙醇进行萃取， 去除脂溶性部分， 保留水相， 加入 0.3L 石油醚萃 取， 去除叶绿素， 保留水相 ；
         萃取获得的水相中加入 95％的乙醇， 使溶液中乙醇终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀溶于 0.5L 蒸馏水， 4℃下加入三氯乙酸， 使终浓度达到 20％， 搅拌 15min 后 3000r/min 离心 30min， 去沉淀， 保留液相 ； 去蛋白溶液过大孔吸附树脂 AB-8， 蒸馏水洗脱， 洗脱液浓缩至 1L， 加入 10g 活性炭 脱色处理， 脱色液加入 95％的乙醇， 终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀 分别用无水乙醇及丙酮各洗涤 3 次， 透析、 干燥， 获得桑叶多糖白色粉末， 经检测产品多糖 含量为 90.3％， 产品提取率 20.2％。
         实施例三
         桑叶除杂干燥后， 粉碎过 40 目筛， 取 1kg 桑叶粉末， 加入 40L 65 ％的乙醇浸泡 30min， 超声波提取 3 次， 每次超声波功率 125W， 温度 70℃， 时间 30min， 抽滤获得相应固相和 液相。
         (1)1- 脱氧野尻霉素的制备
         桑叶超声波破碎离心获得的液相部分用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩至小体积， 离 心去除沉淀， 上清液过装有 732H 型阳离子树脂的层析柱， 用蒸馏水洗至流出液无色为止， 用 0.25mol/L 的氨水洗脱， 洗脱速度 1 倍柱体积 /h， 洗脱速度 1-2mL/min， 收集洗脱液。
         氨水洗脱液浓缩至 1L 左右， 用 2mol/L 的盐酸调节 pH 值至 7.0， 分两次共计加入 0.5L 氯仿萃取液， 搅拌均匀后静置分层， 保留水相， 重复萃取 3 次 ； 减压浓缩至 0.6L， 分2次 加入 0.15L 的正丁醇萃取液， 搅拌均匀后静置分层， 保留正丁醇层， 重复萃取 3 次。
         正丁醇层浓缩至 100mL， 抽滤， 滤渣溶解后用无水乙醇重结晶 2 次， 最终析出物溶 于 10mL 的蒸馏水， 溶液过 Sephdex 20 凝胶层析柱， 蒸馏水洗脱， 收集 1- 脱氧野尻霉素洗脱 液， 浓缩干燥， 获得 1- 脱氧野尻霉素成品， 经检测产品纯度 98.9％， 总提取率 0.12％。
         (2) 桑叶多糖的制备
         桑叶超声波破碎离心获得的固相部分溶于 3 倍体积的蒸馏水， 搅拌均匀后离心， 上清液浓缩， 后加入 0.3L 的丙酮进行萃取， 去除脂溶性部分， 保留水相， 加入 0.3L 乙酸乙酯 萃取， 去除叶绿素， 保留水相 ；
         萃取获得的水相中加入 95％的乙醇， 使溶液中乙醇终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀溶于 0.5L 蒸馏水， 4℃下加入三氯乙酸， 使终浓度达到 20％， 搅拌
         15min 后 3000r/min 离心 30min， 去沉淀， 保留液相 ；
         去蛋白溶液过大孔吸附树脂 AB-8， 蒸馏水洗脱， 洗脱液浓缩至 1L， 加入 10g 活性炭 脱色处理， 脱色液加入 95％的乙醇， 终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀 分别用无水乙醇及丙酮各洗涤 5 次， 透析、 干燥， 获得桑叶多糖白色粉末， 经检测产品多糖 含量为 90.3％， 产品提取率 20.3％。
         实施例四
         桑叶除杂干燥后， 粉碎过 40 目筛， 取 1kg 桑叶粉末， 加入 40L 60 ％的乙醇浸泡 30min， 超声波提取 3 次， 每次超声波功率 125W， 温度 70℃， 时间 30min， 抽滤获得相应固相和 液相。
         (1)1- 脱氧野尻霉素的制备
         桑叶超声波破碎离心获得的液相部分用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩至小体积， 离 心去除沉淀， 上清液过装有 D152 型阳离子树脂的层析柱， 用蒸馏水洗至流出液无色为止， 用 0.30mol/L 的氨水洗脱， 洗脱速度 1 倍柱体积 /h， 洗脱速度 1-2mL/min， 收集洗脱液。
         氨水洗脱液浓缩至 1L 左右， 用 2mol/L 的醋酸调节 pH 值至 7.0， 分两次共计加入 0.5L 氯仿萃取液， 搅拌均匀后静置分层， 保留水相， 萃取 3 次 ； 减压浓缩至 0.6L， 分 2 次加入 0.3L 的正丁醇萃取液， 搅拌均匀后静置分层， 保留正丁醇层， 萃取 4 次。 正丁醇层浓缩至 100mL， 抽滤， 滤渣溶解后用无水乙醇重结晶 3 次， 最终析出物溶 于 10mL 的蒸馏水， 溶液过 Sephdex 20 凝胶层析柱， 蒸馏水洗脱， 收集 1- 脱氧野尻霉素洗脱 液， 浓缩干燥， 获得 1- 脱氧野尻霉素成品， 经检测产品纯度 98.6％， 总提取率 0.12％。
         (2) 桑叶多糖的制备
         桑叶超声波破碎离心获得的固相部分溶于 3 倍体积的蒸馏水， 搅拌均匀后离心， 上清液浓缩， 后加入 0.3L 的丙酮进行萃取， 去除脂溶性部分， 保留水相， 加入 0.3L 乙酸乙酯 萃取， 去除叶绿素， 保留水相 ；
         萃取获得的水相中加入 95％的乙醇， 使溶液中乙醇终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀溶于 0.5L 蒸馏水， 4℃下加入三氯乙酸， 使终浓度达到 20％， 搅拌 15min 后 3000r/min 离心 30min， 去沉淀， 保留液相 ；
         去蛋白溶液过大孔吸附树脂 AB-8， 蒸馏水洗脱， 洗脱液浓缩至 1L， 加入 10g 活性炭 脱色处理， 脱色液加入 95％的乙醇， 终浓度达到 80％， 搅拌均匀后 4℃静置 48h， 抽滤， 沉淀 分别用无水乙醇及丙酮各洗涤 3 次， 透析、 干燥， 获得桑叶多糖白色粉末， 经检测产品多糖 含量为 90.6％， 产品提取率 20.7％。
        

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