一种酯酶及其制备方法和应用 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域， 具体地涉及一种酯酶及其制备方法和应用。背景技术 数量巨大的不可培养的微生物中蕴藏着丰富的资源优势， 宏基因组的研究为挖掘 这一资源优势提供了可靠的技术保障。 95％的海洋微生物在现有的实验条件下无法或很难 实现人工培养， 直接从环境中提取 DNA， 建立理论上可以覆盖环境中所有微生物的遗传信息 宏基因组文库。在海洋深度 100 米以上的极端环境中获得的基因片段， 将这些基因异源表 达， 有可能得到具有应用价值的新基因。 通过构建海洋底泥宏基因组文库， 保存海洋微生物 的基因多样性， 以利于不同类型新型基因的研究与开发利用。
脂肪酶和酯酶是重要的工业酶制剂品种， 可以催化解脂、 酯交换、 酯合成等反应， 广泛应用于油脂加工、 食品、 医药、 日化等工业。不同来源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化 特点和催化活力。 其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶和酯酶的规模化 生产对于酶催化合成多种化学品有重要意义。
本发明拟从海洋底泥宏基因组文库中筛选抗逆性强， 性质优良的新型酯酶和脂肪 酶基因， 为酶法催化生产化工产品提供备选资源。
发明人在前期的工作中， 成功构建了我国南海 0 ～ 100 米深底泥宏基因组文库， 该 库容 DNA 达 194MB， 经酶切、 连接和转化， 共获得 118,000 个含有外源基因片段的重组子， 其 外源片段长度在 1.0-8.0Kb 之间。建立了酯酶的筛选模型。通过功能筛选获得一个具有酯 解活性的插入片段。该片段全长 3,482bp， GenBank 注册号为 GQ168545.1。经 ORF Finder 预测， 该片段有 2 段完整的 ORF 序列。其中， 编码酯酶或脂肪酶基因的 est_p6 位于插入 片段的 2,028 ～ 3,101bp。该基因全长 1,074bp， 编码 357aa。其在 GenBank 的注册号为 ACZ16565.1。将该序列在 GenBank 中进行同源搜索， 发现与之相似性最高的蛋白是来源于 未培养的海洋细菌的脂解酶 ( 其在 GenBank 的注册号为 ADA70028.2)， 相似性为 73％。结 构预测结果显示， Est_p6 具有完整的 α/β 水解折叠保守结构域 (PRK10162)， 该结构域包 含了丝氨酸、 谷氨酸和组氨酸组成的催化三联体， 构成酯酶 / 脂肪酶的催化中心， 归属于酯 酶 / 脂肪酶超级家族 (cl12031)。综上所述， Est_p6 应为酯酶 / 脂肪酶超级家族 (cl12031) 一名新成员。
SignalP 分析， Est_p6 的 1st 到 26th 氨基酸是 N 端信号肽， 26th 和 27th 之间为切割 位点 (AVA26-Q27E)。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型酯酶。
本发明的另一目的是提供该酯酶的制备方法。
为了实现本发明的目的， 本发明提供的一种酯酶 Est_p6-， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。编码上述酯酶的基因， 优选为 est_p6-， 所述 est_p6- 基因是去掉了 N 端的前 78 个 编码信号肽的碱基的 est_p6 基因， 所述 est_p6 基因在 GenBank 中的登录号为 ACZ16565.1。
制备上述基因的载体， 优选为 pET28a-est_p6-， 该载体含有 est_p6- 基因。
上述表达载体 pET28a-est_p6-， 由下述方法构建而得 ：
(1) 以宏基因组文库中含有 est_p6 基因插入片段的质粒为模板， PCR 扩增出去掉 信号肽的酯酶基因 est_p6 ；
(2) 将步骤 (1) 的扩增产物经测序验证后， 与 pET28a 载体重组， 得到重组大肠杆菌 表达载体 pET28a-est_p6 。
步骤 (1) 中的 PCR 扩增引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No ： 2 所示。
将 est_p6 克隆到表达载体 pET28a 并转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 得到 pET28a-est_ p6 /BL21 重组表达体系。摇瓶培养并诱导表达 Est_p6 ， 经纯化后获得 Est_p6-， SDS-PAGE 表明其表观分子量为 37.5kD， 与预测值相符 ； 通过酯酶活力测定表明 Est_p6 能够特异地 打断化合物 pNP- 丁酸酯的酯键 ； 通过对 Est_p6- 的最适反应 pH 测定表明， 其最适反应 pH 值约为 pH8.60， 偏碱性 ； 通过对 Est_p6 的最适反应温度测定表明， 其最适反应温度约为 50.0℃。酶的动力学常数测定表明， Est_p6 的最适底物为 pNP- 丁酸酯， 对于酰基碳链较短 酯类的水解活力优于长链酯类。
应当理解， 本发明提供一种含有含有所述载体的宿主细胞。
更进一步， 本发明还提供了一种表达酯酶的方法， 其包括如下步骤 ：
1) 活化 ： 取宿主的单菌落于 5ml 含卡那霉素 50μg/ml 的 LB 培养基中， 于 37 ℃、 200 ～ 250rpm 培养至 OD600 ≈ 0.5 ； 2) 培养 ： 以 0.8 ～ 1.0％接种量将菌液转接到 500ml 含 kan 50μg/ml 的 LB 培养 基中， 于 37℃、 200 ～ 250rpm 培养至 OD600 ≈ 0.5 ；
3) 诱导 ： 向菌液中添加 IPTG 至终浓度为 0.5mM， 于 21℃、 200 ～ 250rpm 诱导培养 12 ～ 14 小时 ；
4) 收集细胞 ： 4 ℃、 10000g 离心 10 ～ 15 分钟收集细胞 ； 弃上清， 每 100ml 菌液 用 60ml 50mM 的 Tris-HCl 缓冲液重悬细胞， 洗涤两遍 ； 细胞重悬浮于 30 ～ 40ml 50mM 的 Tris-HCl 缓冲液中 ；
5) 获取粗酶提取液 ： 冰浴条件下， 超声波破碎细胞 ； 细胞破壁后， 以 4℃、 10000 ～ 15000g 离心 10 ～ 15 分钟， 收集上清即粗酶提取液。
本发明提供了上述酯酶在脂类降解及其他油脂类化合物的生物转化中的应用。
本发明还提供所述酯酶在催化解酯、 酯交换或酯合成中的应用。优选的反应 pH 值 为 pH8.60， 优选反应温度为 50℃。
本发明从我国海洋底泥宏基因组文库中钓出新型酯酶基因， 采用高效的表达方 法， 使其成功表达， 为酯酶家族增添了新成员。该酯酶具有优良的酶学性质， 可以应用于酶 法催化脂解、 酯化和转酯化相关的工业生产中， 将有望成为补充和取代部分化学合成产品 的新生产工艺的备选者。 该酶的生产， 将会在酶法水解制备天然香精、 废纸浆脱墨再生等工 艺中显示其重要的经济和社会价值。
附图说明图 1 显示的是 Est_p6- 蛋白纯化银染图。M 为 Marker， FT 为初始流出液， 20mM 为 20mmol/L 咪唑初始洗脱液， 50mM 为 50mmol/L 咪唑洗脱液的第 2 管， 第 10 管和第 20 管 (10 滴 / 管 )， 80mM 为 80mmol/L 咪唑洗脱液的第 1、 2、 5、 6 和 10 管， 100mM 为 100mmol/L 咪唑洗 脱液的第 1、 2 和 10 管。
图 2 显示的是 pH 对 Est_p6- 活性的影响 ；
图 3 显示的是温度对酯酶 Est_p6- 活性的影响 ；
图 4 显示的是 Est_p6- 以 pNP- 丁酸酯为底物动力学常数测定的双倒数曲线图。 具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。
若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例 1 重组大肠杆菌表达载体 pET28a-est_p6- 的构建
(1) 酯酶基因 est_p6- 序列的获得 经 SignalP 分析， Est_p6 的 1st 到 26th 氨基酸是 N 端信号肽， 为得到高表达和易纯 化的酯酶， 预扩增去除信号肽的 est_p6 基因。把 est_p6 基因 5’ 端编码信号肽的 78 个碱 基去掉， 即得到 est_p6 基因的序列。
(2) 酯酶基因 est_p6- 的扩增
根据 est_p6- 基因的序列以及大肠杆菌表达载体 pET28a 上的多克隆位点的特征， 设计合成引物 ：
FW ： 5’ -CATGCCATGGAGGAACTCCCTCCGATATT-3’
REV ： 5’ -CCCAAGCTTCTCGAGGTGCTTGTCAAAG-3’
下划线分别为 NcoI(FW) 和 HindIII(REV) 的酶切位点。以宏基因组文库中含有 est_p6 基因插入片段的质粒为模板， PCR 扩增出去掉信号肽的酯酶基因 est_p6-。
PCR 反应体系 ：
总反应体系 20μl。
PCR 反应条件 ：
95℃， 预变性 5min ； 94℃， 变性 30s， 57.8℃， 退火 30s， 72℃， 延伸 2min， 循环 30 次 ； 72℃， 再延伸 10min。
PCR 产物由上海英骏生物技术有限公司测序正确后用于构建表达载体。
(3)pET28a-est_p6-/BL21 重组表达体系的获得
用 NcoI 和 HindIII 对合成的 est_p6- 基因和 pET28a(Novagen) 载体分别进行双 酶切， 然后用 DNA 连接酶将上述片段连接， 最后将连接产物转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 在 LB( 含 kan 50μg/ml) 平板上培养， 初步筛选阳性克隆， 经酶切验证后得到 pET28a-est_ p6 /BL21 重组表达体系。
实施例 2、 Est_p6- 蛋白的诱导表达及纯化 ；
本例采用 Ni-agarose 亲和层析纯化 (pET 表达系统 ) 目的蛋白， 具体步骤如下 ：
1) 诱导培养
将表达菌株接种到装有 5ml LB( 含 kan 50μg/ml) 的试管中， 37℃、 转速 250rpm、 培养过夜活化。以 0.4％接种量转接 5ml LB( 含 kan 50μg/ml) 的液体培养基再次活化， 37℃， 10h。 以 0.8％接种量转接 100ml 含 50μg/ml kan 的 LB 液体培养基， 37℃摇床 200rpm 培养 2 ～ 3h 至 OD600 ≈ 0.5， 加入 50μl 1mol/L 的 IPTG( 终浓度 0.5mmol/L)， 于 21℃摇床 200rpm 培养 14h 至 OD600 ≈ 7.0， 即可收集细胞。
2)Est_p6 蛋白粗提液的制备
经诱导培养的培养物 10000g、 4 ℃、 离心 10min 收集细胞， 除尽上清， 每 100ml 菌 液用 60ml 50mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液 (pH ＝ 7.5) 洗涤两次。最后用 6ml 50mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液 (pH ＝ 7.5) 重悬细胞， 于冰浴中用超声波破碎细胞 (240 伏特， 3 秒超声波 破壁， 7 秒间歇， 60 个循环 ) 后， 离心 (15000g、 4℃、 10 分钟 )， 取上清。
3)Est_p6 蛋白纯化
基于 pET28a(+) 质粒中有编码 His-Tag 标签蛋白的序列， 所以本专利选择使用 Ni-NTA Agarose(QIAGEN) 亲和层系纯化蛋白， 纯化 Est_p6 蛋白的步骤如下 ：
1) 清洗 ： 吸取 1ml Ni-NTAAgarose(QIAGEN) 于 SPE 筛板 10ml 层析柱 ( 康为世纪 ) 中， 先用 50ml 去离子水清洗， 再用 100ml 含 0.3mol/L NaCl 的 10mmol/L 咪唑 (pH ＝ 8.0) 清洗 ( 下文中不同浓度的咪唑缓冲液均含有 0.3mol/L 的 NaCl， pH ＝ 8.0) ；
2) 结合 ： 用 2ml 10mmol/L 的咪唑缓冲液转移清洗好的 Ni-NTAAgarose 至 5ml 菌 保管中， 加入 Est_p6- 蛋白粗提液约 3ml， 于 4℃冰箱内在混合器上结合 1.5h ；
3) 结合了蛋白的 Ni-NTAAgarose 转移至层析住中， 让 Ni-NTAAgarose 沉降至筛板 上；
4) 平衡 ： 100ml 浓度为 10mmol/L 的咪唑缓冲液平衡层析柱， 接 5ml 初始流出液 ；
5) 洗脱 ： 50ml 浓度为 20mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 2 管和最后流出 液 1 管 ( 收集洗脱液均为 10 滴洗脱液 / 管 ) ；
20ml 浓度为 50mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 10 管 ；
10ml 浓度为 80mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 10 管 ；
10ml 浓度为 100mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 10 管 ；
10ml 浓度为 250mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 10 管 ；
6) 清洗 ： 先用 250ml 0.5mol/L 的 NaOH 清洗层析住， 再用去离子水清洗以除去 NaOH ；
7) 保存 ： 用 9ml 30％乙醇保存 Ni-NTAAgarose 层析住于 4℃冰箱中。
将收集的洗脱液 SDS-PAGE 电泳， 结果分别用考马斯亮蓝染色和银染检测蛋白纯度。之后将达到电泳纯的蛋白收集起来， 过夜透析去除咪唑与 NaCl。
实施例 3 酯酶酶活测定
酯酶可以特异地打断化合物 pNP- 脂肪酸酯的酯键， 释放出相同物质的量的脂肪 酸和 pNP， 而 pNP 在碱性环境下 405nm 处有特殊的吸收峰， 通过测定一定时间内产物 pNP 的 生成量来计算脂肪酶 / 酯酶的活力。
反应体系为 ：
将缓冲液、 底物溶液 (pNP- 丁酸酯， 4-Nitrophenyl butyrate， Sigma 公司 ) 和无水 乙醇在 50℃水浴中保温 10min， 加入适当稀释的酶液 (0.0499mg/ml)， 反应 3min， 测定 405nm 的吸光值， 对照标准曲线计算酶活。酶活单位 (unit) 定义为， 在上述反应条件下， 每分钟释 放出 1μmol pNP 的酶量为一个酶活单位。
酶活力 (μmol/min·ml) ＝ (7.954÷3÷16.731)×100 ＝ 15.847
比酶活 (μmol/min·mg) ＝ 15.847÷0.0499 ＝ 317.575
实施例 4 酶学性质分析
1)SDS-PAGE 方法测定分子量
SDS-PAGE 方法测定酶的亚基分子量， 根据已知分子量的标准蛋白在 SDS-PAGE 中 的相对迁移率 Rf 作图， 得其分子量。结果如图 2 所示， Est_p6- 的 SDS-PAGE 表观分子量约 为 37.5kDa。并且 SDS-PAGE 电泳表明， 经过 Ni-agarose 亲和层析纯化后的 Est_p1- 可达到 电泳纯。
2) 酶的最适反应 pH 值
配制不同 pH(50mmol/L) 的缓冲液， pH 分别为 2.55、 3.71、 4.68、 5.24、 5.57、 6.16 的 柠檬酸缓冲液， pH 分别为 5.69、 6.11、 6.58、 6.83、 7.05、 7.36、 7.57、 7.82、 8.10 的 MOPS 缓冲 液， pH 分别为 7.12、 7.40、 7.60、 7.83、 8.01、 8.60、 9.10 的 Tri-HCl 缓冲液， pH 分别为 9.11、 9.61、 10.09 的 CHES 缓冲液， 以及 pH 分别为 9.78、 10.09、 11.06 的 CAPS 缓冲液。将酶液分 别加入到上述 pH 的缓冲液中， 按标准方法测定酶活力， 以酶活最高者定位 100％， 以相对活 力和对应的 pH 值作图。结果表明 ( 图 3)， Est_p6 的最适 pH 值约为 pH8.60， 偏碱性。
3) 酶的最适反应温度
将底物溶液和 pH8.60、 50mmol/L 的 Tri-HCl 缓冲液分别在 0℃、 10℃、 20℃、 30℃、 35℃、 40℃、 45℃、 47.5℃、 50℃、 52.5℃、 55℃、 60℃的不同温度的水浴中保温 10min， 然后加 入酶液按照标准方法测定酶活力， 得到酶液在不同反应温度下具有的酶活力， 以酶活最高 者定为 100％， 以相对活力对温度作图。结果表明 ( 图 4)， 酶的最适反应温度约为 50℃。
4) 酶的动力学常数测定
采用的底物为 pNP- 丁酸酯， 配制一系列不同浓度的底物， 使反应体系中底物的浓 度分别为 0.1mM、 0.05mM、 0.025mM、 0.0125mM、 0.00625mM、 0.00313mM。 将配好的底物、 无水乙 醇和 pH8.60 的 Tri-HCl 缓冲液在 50℃下预热 10min， 分别加入 10μl 适当稀释的酶液 ( 稀 释后 0.0499mg/ml)， 根据底物浓度和测得的反应初速度 v( 计算公式同酶活力测定 )， 以 1/ [S] 对 1/v 作 Lineweaver-Burk 双倒数图， 求得 Km， Kcat， Kcat/Km。结果表明 ( 见图 5 及表 1、 表 2)， Est_p6 的最适底物是 pNP- 丁酸酯， 对于酰基碳链较长酯类的水解活力不如短链酯 类， 因此， Est_p6 是一个酯酶。
计算公式 ：
V ＝ Vmax[S]/(Km+[S]) 1/V ＝ (Km/Vmax)·(1/[S])+1/Vmax
Kcat ＝ Vmax/[E] [E] 为酶蛋白浓度
表 1 不同底物的 Est_p6- 的酶活
本发明涉及生物技术领域， 具体地涉及一种酯酶及其制备方法和应用。背景技术 数量巨大的不可培养的微生物中蕴藏着丰富的资源优势， 宏基因组的研究为挖掘 这一资源优势提供了可靠的技术保障。 95％的海洋微生物在现有的实验条件下无法或很难 实现人工培养， 直接从环境中提取 DNA， 建立理论上可以覆盖环境中所有微生物的遗传信息 宏基因组文库。在海洋深度 100 米以上的极端环境中获得的基因片段， 将这些基因异源表 达， 有可能得到具有应用价值的新基因。 通过构建海洋底泥宏基因组文库， 保存海洋微生物 的基因多样性， 以利于不同类型新型基因的研究与开发利用。
脂肪酶和酯酶是重要的工业酶制剂品种， 可以催化解脂、 酯交换、 酯合成等反应， 广泛应用于油脂加工、 食品、 医药、 日化等工业。不同来源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化 特点和催化活力。 其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶和酯酶的规模化 生产对于酶催化合成多种化学品有重要意义。
本发明拟从海洋底泥宏基因组文库中筛选抗逆性强， 性质优良的新型酯酶和脂肪 酶基因， 为酶法催化生产化工产品提供备选资源。
发明人在前期的工作中， 成功构建了我国南海 0 ～ 100 米深底泥宏基因组文库， 该 库容 DNA 达 194MB， 经酶切、 连接和转化， 共获得 118,000 个含有外源基因片段的重组子， 其 外源片段长度在 1.0-8.0Kb 之间。建立了酯酶的筛选模型。通过功能筛选获得一个具有酯 解活性的插入片段。该片段全长 3,482bp， GenBank 注册号为 GQ168545.1。经 ORF Finder 预测， 该片段有 2 段完整的 ORF 序列。其中， 编码酯酶或脂肪酶基因的 est_p6 位于插入 片段的 2,028 ～ 3,101bp。该基因全长 1,074bp， 编码 357aa。其在 GenBank 的注册号为 ACZ16565.1。将该序列在 GenBank 中进行同源搜索， 发现与之相似性最高的蛋白是来源于 未培养的海洋细菌的脂解酶 ( 其在 GenBank 的注册号为 ADA70028.2)， 相似性为 73％。结 构预测结果显示， Est_p6 具有完整的 α/β 水解折叠保守结构域 (PRK10162)， 该结构域包 含了丝氨酸、 谷氨酸和组氨酸组成的催化三联体， 构成酯酶 / 脂肪酶的催化中心， 归属于酯 酶 / 脂肪酶超级家族 (cl12031)。综上所述， Est_p6 应为酯酶 / 脂肪酶超级家族 (cl12031) 一名新成员。
SignalP 分析， Est_p6 的 1st 到 26th 氨基酸是 N 端信号肽， 26th 和 27th 之间为切割 位点 (AVA26-Q27E)。
脂肪酶和酯酶是重要的工业酶制剂品种， 可以催化解脂、 酯交换、 酯合成等反应， 广泛应用于油脂加工、 食品、 医药、 日化等工业。不同来源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化 特点和催化活力。 其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶和酯酶的规模化 生产对于酶催化合成多种化学品有重要意义。
本发明拟从海洋底泥宏基因组文库中筛选抗逆性强， 性质优良的新型酯酶和脂肪 酶基因， 为酶法催化生产化工产品提供备选资源。
发明人在前期的工作中， 成功构建了我国南海 0 ～ 100 米深底泥宏基因组文库， 该 库容 DNA 达 194MB， 经酶切、 连接和转化， 共获得 118,000 个含有外源基因片段的重组子， 其 外源片段长度在 1.0-8.0Kb 之间。建立了酯酶的筛选模型。通过功能筛选获得一个具有酯 解活性的插入片段。该片段全长 3,482bp， GenBank 注册号为 GQ168545.1。经 ORF Finder 预测， 该片段有 2 段完整的 ORF 序列。其中， 编码酯酶或脂肪酶基因的 est_p6 位于插入 片段的 2,028 ～ 3,101bp。该基因全长 1,074bp， 编码 357aa。其在 GenBank 的注册号为 ACZ16565.1。将该序列在 GenBank 中进行同源搜索， 发现与之相似性最高的蛋白是来源于 未培养的海洋细菌的脂解酶 ( 其在 GenBank 的注册号为 ADA70028.2)， 相似性为 73％。结 构预测结果显示， Est_p6 具有完整的 α/β 水解折叠保守结构域 (PRK10162)， 该结构域包 含了丝氨酸、 谷氨酸和组氨酸组成的催化三联体， 构成酯酶 / 脂肪酶的催化中心， 归属于酯 酶 / 脂肪酶超级家族 (cl12031)。综上所述， Est_p6 应为酯酶 / 脂肪酶超级家族 (cl12031) 一名新成员。
SignalP 分析， Est_p6 的 1st 到 26th 氨基酸是 N 端信号肽， 26th 和 27th 之间为切割 位点 (AVA26-Q27E)。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型酯酶。
本发明的另一目的是提供该酯酶的制备方法。
为了实现本发明的目的， 本发明提供的一种酯酶 Est_p6-， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。编码上述酯酶的基因， 优选为 est_p6-， 所述 est_p6- 基因是去掉了 N 端的前 78 个 编码信号肽的碱基的 est_p6 基因， 所述 est_p6 基因在 GenBank 中的登录号为 ACZ16565.1。
制备上述基因的载体， 优选为 pET28a-est_p6-， 该载体含有 est_p6- 基因。
上述表达载体 pET28a-est_p6-， 由下述方法构建而得 ：
(1) 以宏基因组文库中含有 est_p6 基因插入片段的质粒为模板， PCR 扩增出去掉 信号肽的酯酶基因 est_p6 ；
(2) 将步骤 (1) 的扩增产物经测序验证后， 与 pET28a 载体重组， 得到重组大肠杆菌 表达载体 pET28a-est_p6 。
步骤 (1) 中的 PCR 扩增引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No ： 2 所示。
将 est_p6 克隆到表达载体 pET28a 并转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 得到 pET28a-est_ p6 /BL21 重组表达体系。摇瓶培养并诱导表达 Est_p6 ， 经纯化后获得 Est_p6-， SDS-PAGE 表明其表观分子量为 37.5kD， 与预测值相符 ； 通过酯酶活力测定表明 Est_p6 能够特异地 打断化合物 pNP- 丁酸酯的酯键 ； 通过对 Est_p6- 的最适反应 pH 测定表明， 其最适反应 pH 值约为 pH8.60， 偏碱性 ； 通过对 Est_p6 的最适反应温度测定表明， 其最适反应温度约为 50.0℃。酶的动力学常数测定表明， Est_p6 的最适底物为 pNP- 丁酸酯， 对于酰基碳链较短 酯类的水解活力优于长链酯类。
应当理解， 本发明提供一种含有含有所述载体的宿主细胞。
更进一步， 本发明还提供了一种表达酯酶的方法， 其包括如下步骤 ：
1) 活化 ： 取宿主的单菌落于 5ml 含卡那霉素 50μg/ml 的 LB 培养基中， 于 37 ℃、 200 ～ 250rpm 培养至 OD600 ≈ 0.5 ； 2) 培养 ： 以 0.8 ～ 1.0％接种量将菌液转接到 500ml 含 kan 50μg/ml 的 LB 培养 基中， 于 37℃、 200 ～ 250rpm 培养至 OD600 ≈ 0.5 ；
3) 诱导 ： 向菌液中添加 IPTG 至终浓度为 0.5mM， 于 21℃、 200 ～ 250rpm 诱导培养 12 ～ 14 小时 ；
4) 收集细胞 ： 4 ℃、 10000g 离心 10 ～ 15 分钟收集细胞 ； 弃上清， 每 100ml 菌液 用 60ml 50mM 的 Tris-HCl 缓冲液重悬细胞， 洗涤两遍 ； 细胞重悬浮于 30 ～ 40ml 50mM 的 Tris-HCl 缓冲液中 ；
5) 获取粗酶提取液 ： 冰浴条件下， 超声波破碎细胞 ； 细胞破壁后， 以 4℃、 10000 ～ 15000g 离心 10 ～ 15 分钟， 收集上清即粗酶提取液。
本发明提供了上述酯酶在脂类降解及其他油脂类化合物的生物转化中的应用。
本发明还提供所述酯酶在催化解酯、 酯交换或酯合成中的应用。优选的反应 pH 值 为 pH8.60， 优选反应温度为 50℃。
本发明从我国海洋底泥宏基因组文库中钓出新型酯酶基因， 采用高效的表达方 法， 使其成功表达， 为酯酶家族增添了新成员。该酯酶具有优良的酶学性质， 可以应用于酶 法催化脂解、 酯化和转酯化相关的工业生产中， 将有望成为补充和取代部分化学合成产品 的新生产工艺的备选者。 该酶的生产， 将会在酶法水解制备天然香精、 废纸浆脱墨再生等工 艺中显示其重要的经济和社会价值。
附图说明图 1 显示的是 Est_p6- 蛋白纯化银染图。M 为 Marker， FT 为初始流出液， 20mM 为 20mmol/L 咪唑初始洗脱液， 50mM 为 50mmol/L 咪唑洗脱液的第 2 管， 第 10 管和第 20 管 (10 滴 / 管 )， 80mM 为 80mmol/L 咪唑洗脱液的第 1、 2、 5、 6 和 10 管， 100mM 为 100mmol/L 咪唑洗 脱液的第 1、 2 和 10 管。
图 2 显示的是 pH 对 Est_p6- 活性的影响 ；
图 3 显示的是温度对酯酶 Est_p6- 活性的影响 ；
图 4 显示的是 Est_p6- 以 pNP- 丁酸酯为底物动力学常数测定的双倒数曲线图。 具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。
若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例 1 重组大肠杆菌表达载体 pET28a-est_p6- 的构建
(1) 酯酶基因 est_p6- 序列的获得 经 SignalP 分析， Est_p6 的 1st 到 26th 氨基酸是 N 端信号肽， 为得到高表达和易纯 化的酯酶， 预扩增去除信号肽的 est_p6 基因。把 est_p6 基因 5’ 端编码信号肽的 78 个碱 基去掉， 即得到 est_p6 基因的序列。
(2) 酯酶基因 est_p6- 的扩增
根据 est_p6- 基因的序列以及大肠杆菌表达载体 pET28a 上的多克隆位点的特征， 设计合成引物 ：
FW ： 5’ -CATGCCATGGAGGAACTCCCTCCGATATT-3’
REV ： 5’ -CCCAAGCTTCTCGAGGTGCTTGTCAAAG-3’
下划线分别为 NcoI(FW) 和 HindIII(REV) 的酶切位点。以宏基因组文库中含有 est_p6 基因插入片段的质粒为模板， PCR 扩增出去掉信号肽的酯酶基因 est_p6-。
PCR 反应体系 ：
总反应体系 20μl。
PCR 反应条件 ：
95℃， 预变性 5min ； 94℃， 变性 30s， 57.8℃， 退火 30s， 72℃， 延伸 2min， 循环 30 次 ； 72℃， 再延伸 10min。
PCR 产物由上海英骏生物技术有限公司测序正确后用于构建表达载体。
(3)pET28a-est_p6-/BL21 重组表达体系的获得
用 NcoI 和 HindIII 对合成的 est_p6- 基因和 pET28a(Novagen) 载体分别进行双 酶切， 然后用 DNA 连接酶将上述片段连接， 最后将连接产物转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 在 LB( 含 kan 50μg/ml) 平板上培养， 初步筛选阳性克隆， 经酶切验证后得到 pET28a-est_ p6 /BL21 重组表达体系。
实施例 2、 Est_p6- 蛋白的诱导表达及纯化 ；
本例采用 Ni-agarose 亲和层析纯化 (pET 表达系统 ) 目的蛋白， 具体步骤如下 ：
1) 诱导培养
将表达菌株接种到装有 5ml LB( 含 kan 50μg/ml) 的试管中， 37℃、 转速 250rpm、 培养过夜活化。以 0.4％接种量转接 5ml LB( 含 kan 50μg/ml) 的液体培养基再次活化， 37℃， 10h。 以 0.8％接种量转接 100ml 含 50μg/ml kan 的 LB 液体培养基， 37℃摇床 200rpm 培养 2 ～ 3h 至 OD600 ≈ 0.5， 加入 50μl 1mol/L 的 IPTG( 终浓度 0.5mmol/L)， 于 21℃摇床 200rpm 培养 14h 至 OD600 ≈ 7.0， 即可收集细胞。
2)Est_p6 蛋白粗提液的制备
经诱导培养的培养物 10000g、 4 ℃、 离心 10min 收集细胞， 除尽上清， 每 100ml 菌 液用 60ml 50mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液 (pH ＝ 7.5) 洗涤两次。最后用 6ml 50mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液 (pH ＝ 7.5) 重悬细胞， 于冰浴中用超声波破碎细胞 (240 伏特， 3 秒超声波 破壁， 7 秒间歇， 60 个循环 ) 后， 离心 (15000g、 4℃、 10 分钟 )， 取上清。
3)Est_p6 蛋白纯化
基于 pET28a(+) 质粒中有编码 His-Tag 标签蛋白的序列， 所以本专利选择使用 Ni-NTA Agarose(QIAGEN) 亲和层系纯化蛋白， 纯化 Est_p6 蛋白的步骤如下 ：
1) 清洗 ： 吸取 1ml Ni-NTAAgarose(QIAGEN) 于 SPE 筛板 10ml 层析柱 ( 康为世纪 ) 中， 先用 50ml 去离子水清洗， 再用 100ml 含 0.3mol/L NaCl 的 10mmol/L 咪唑 (pH ＝ 8.0) 清洗 ( 下文中不同浓度的咪唑缓冲液均含有 0.3mol/L 的 NaCl， pH ＝ 8.0) ；
2) 结合 ： 用 2ml 10mmol/L 的咪唑缓冲液转移清洗好的 Ni-NTAAgarose 至 5ml 菌 保管中， 加入 Est_p6- 蛋白粗提液约 3ml， 于 4℃冰箱内在混合器上结合 1.5h ；
3) 结合了蛋白的 Ni-NTAAgarose 转移至层析住中， 让 Ni-NTAAgarose 沉降至筛板 上；
4) 平衡 ： 100ml 浓度为 10mmol/L 的咪唑缓冲液平衡层析柱， 接 5ml 初始流出液 ；
5) 洗脱 ： 50ml 浓度为 20mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 2 管和最后流出 液 1 管 ( 收集洗脱液均为 10 滴洗脱液 / 管 ) ；
20ml 浓度为 50mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 10 管 ；
10ml 浓度为 80mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 10 管 ；
10ml 浓度为 100mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 10 管 ；
10ml 浓度为 250mmol/L 的咪唑缓冲液洗脱， 接初始流出液 10 管 ；
6) 清洗 ： 先用 250ml 0.5mol/L 的 NaOH 清洗层析住， 再用去离子水清洗以除去 NaOH ；
7) 保存 ： 用 9ml 30％乙醇保存 Ni-NTAAgarose 层析住于 4℃冰箱中。
将收集的洗脱液 SDS-PAGE 电泳， 结果分别用考马斯亮蓝染色和银染检测蛋白纯度。之后将达到电泳纯的蛋白收集起来， 过夜透析去除咪唑与 NaCl。
实施例 3 酯酶酶活测定
酯酶可以特异地打断化合物 pNP- 脂肪酸酯的酯键， 释放出相同物质的量的脂肪 酸和 pNP， 而 pNP 在碱性环境下 405nm 处有特殊的吸收峰， 通过测定一定时间内产物 pNP 的 生成量来计算脂肪酶 / 酯酶的活力。
反应体系为 ：
将缓冲液、 底物溶液 (pNP- 丁酸酯， 4-Nitrophenyl butyrate， Sigma 公司 ) 和无水 乙醇在 50℃水浴中保温 10min， 加入适当稀释的酶液 (0.0499mg/ml)， 反应 3min， 测定 405nm 的吸光值， 对照标准曲线计算酶活。酶活单位 (unit) 定义为， 在上述反应条件下， 每分钟释 放出 1μmol pNP 的酶量为一个酶活单位。
酶活力 (μmol/min·ml) ＝ (7.954÷3÷16.731)×100 ＝ 15.847
比酶活 (μmol/min·mg) ＝ 15.847÷0.0499 ＝ 317.575
实施例 4 酶学性质分析
1)SDS-PAGE 方法测定分子量
SDS-PAGE 方法测定酶的亚基分子量， 根据已知分子量的标准蛋白在 SDS-PAGE 中 的相对迁移率 Rf 作图， 得其分子量。结果如图 2 所示， Est_p6- 的 SDS-PAGE 表观分子量约 为 37.5kDa。并且 SDS-PAGE 电泳表明， 经过 Ni-agarose 亲和层析纯化后的 Est_p1- 可达到 电泳纯。
2) 酶的最适反应 pH 值
配制不同 pH(50mmol/L) 的缓冲液， pH 分别为 2.55、 3.71、 4.68、 5.24、 5.57、 6.16 的 柠檬酸缓冲液， pH 分别为 5.69、 6.11、 6.58、 6.83、 7.05、 7.36、 7.57、 7.82、 8.10 的 MOPS 缓冲 液， pH 分别为 7.12、 7.40、 7.60、 7.83、 8.01、 8.60、 9.10 的 Tri-HCl 缓冲液， pH 分别为 9.11、 9.61、 10.09 的 CHES 缓冲液， 以及 pH 分别为 9.78、 10.09、 11.06 的 CAPS 缓冲液。将酶液分 别加入到上述 pH 的缓冲液中， 按标准方法测定酶活力， 以酶活最高者定位 100％， 以相对活 力和对应的 pH 值作图。结果表明 ( 图 3)， Est_p6 的最适 pH 值约为 pH8.60， 偏碱性。
3) 酶的最适反应温度
将底物溶液和 pH8.60、 50mmol/L 的 Tri-HCl 缓冲液分别在 0℃、 10℃、 20℃、 30℃、 35℃、 40℃、 45℃、 47.5℃、 50℃、 52.5℃、 55℃、 60℃的不同温度的水浴中保温 10min， 然后加 入酶液按照标准方法测定酶活力， 得到酶液在不同反应温度下具有的酶活力， 以酶活最高 者定为 100％， 以相对活力对温度作图。结果表明 ( 图 4)， 酶的最适反应温度约为 50℃。
4) 酶的动力学常数测定
采用的底物为 pNP- 丁酸酯， 配制一系列不同浓度的底物， 使反应体系中底物的浓 度分别为 0.1mM、 0.05mM、 0.025mM、 0.0125mM、 0.00625mM、 0.00313mM。 将配好的底物、 无水乙 醇和 pH8.60 的 Tri-HCl 缓冲液在 50℃下预热 10min， 分别加入 10μl 适当稀释的酶液 ( 稀 释后 0.0499mg/ml)， 根据底物浓度和测得的反应初速度 v( 计算公式同酶活力测定 )， 以 1/ [S] 对 1/v 作 Lineweaver-Burk 双倒数图， 求得 Km， Kcat， Kcat/Km。结果表明 ( 见图 5 及表 1、 表 2)， Est_p6 的最适底物是 pNP- 丁酸酯， 对于酰基碳链较长酯类的水解活力不如短链酯 类， 因此， Est_p6 是一个酯酶。
计算公式 ：
V ＝ Vmax[S]/(Km+[S]) 1/V ＝ (Km/Vmax)·(1/[S])+1/Vmax
Kcat ＝ Vmax/[E] [E] 为酶蛋白浓度
表 1 不同底物的 Est_p6- 的酶活
表 2 最适底物的 Est_p6- 的酶动力学参数8CN 102517265 A
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