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1、10申请公布号CN104136620A43申请公布日20141105CN104136620A21申请号201380008572822申请日20130206A1284/201220121210AT12450007520120207EPPCT/EP2012/06778120120912EPC12P19/02200601C12P19/36200601C12P33/00200601C12P41/00200601C13K11/0020060171申请人安尼基有限责任公司地址奥地利格拉茨72发明人奥迪文艾尔特妮可司道宁玛塔苏本德梅耶74专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所普通合伙11201代理人宋融冰。
2、54发明名称用于氧化还原辅因子的酶再生的方法57摘要公开了一种用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD/NADH和NADP/NADPH的酶再生的方法。在该方法中，由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应产物形成反应，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型获得，且另一种以其氧化型获得。所公开的方法的特征在于A在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，氧气或通式R1COCOOH的化合物被还原，且B在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通式为R2CHOHR3的化合物被氧化，化合物中的R1、R2和R3具有不同含义。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日201。
3、4080786PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0523132013020687PCT国际申请的公布数据WO2013/117584DE2013081551INTCL权利要求书5页说明书16页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书5页说明书16页附图8页10申请公布号CN104136620ACN104136620A1/5页21一种用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD/NADH和/或，特别是和，NADP/NADPH的酶再生的方法，其中，由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应产物形成反应，所述两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，且另一。
4、种以其氧化型累积，其特征在于A在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，氧气或以下通式的化合物被还原其中R1表示直链或支链C1C4烷基基团或C1C4羧基烷基基团，和B在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，C4C8环烷醇或以下通式的化合物被氧化其中R2和R3独立地选自由H、C1C6烷基、C1C6烯基、芳基、羧基或C1C4羧基烷基、特别是环烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6C12芳基，所述环烷基例如为C3C8环烷基。2根据权利要求1所述的用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD/NADH和/或，特别是和，。
5、NADP/NADPH的酶再生的方法，其中由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应产物形成反应，所述两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，且另一种以其氧化型累积，其特征在于A在被氧化的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被还原其中R1表示取代或未取代的C1C4烷基基团，和B在被还原的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被氧化其中R2和R3相互独立地选自由下列构成的组1H，2C1C6烷基，其中所述烷基为直链或支链烷基，3C1C6烯基，其中所述烯基为直链或支链烯基且任选地包括最多三个双键，4环烷基，特别是C3C8环烷基，5芳基，特别是C6C12芳基，6C1C4羧基烷基，在式I的化。
6、合物为丙酮酸盐的情况下，任选为羧基。权利要求书CN104136620A2/5页33根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中R2和R3相互独立地选自由H、C1C6烷基、C1C6烯基、芳基、羧基或C1C4羧基烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6C12芳基。4根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化反应和所述还原反应在相同的底物分子主链上发生。5根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化反应和所述还原反应按时间顺序平行地进行。6根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在将被氧化的辅因子。
7、再转化为其初始还原型的再生反应中，通过醇脱氢酶将2丙醇氧化为丙酮。7根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在将被还原的辅因予再转化为其初始氧化型的再生反应中，通过乳酸脱氢酶将丙酮酸盐还原为乳酸盐。8根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通过苹果酸脱氢酶将苹果酸盐氧化为丙酮酸盐和CO2。9根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于在相同反应批次中分别进行以下通式的化合物的至少一种氧化反应和至少一种还原反应其中R4表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，R5表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团，R6表示氢或羟基基团，。
8、R7表示氢、COR13、取代的或未取代的C1C4羧基烷基基团，其中R13为未取代或被羟基基团取代的C1C4烷基基团，所述取代的C1C4羧基烷基基团特别为被羟基基团取代的C1C4羧基烷基基团，或R6与R7一起表示氧代基团，R8表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，R9表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，R10表示氢、甲基基团或卤素，R11表示氢、甲基基团、羟基基团、氧代基团或卤素，和R12表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团，其中结构元素表示苯环或包括6个碳原子和0、1或2个CC双键的环；特别是其中反应批次中提供权利要求书CN104136620A3/5页4的用于产物的形成中涉及的还原反应的底物。
9、的浓度5重量/体积。10根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于将式VII的脱氢表雄酮DHEA转化为式VIII的睾酮11根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于使用两种立体特异性相反的羟基类固醇脱氢酶、通过氧化为式V的酮基石胆酸且随后还原为式VI的立体特异性羟基化合物3，7二羟基5胆甾烷酸熊去氧胆酸而使式IV的3，7二羟基5胆甾烷酸鹅去氧胆酸酶差向异构化特别是由此氧化反应由来自大肠杆菌的7羟基类固醇脱氢酶催化和/或还原反应由来自扭链瘤胃球菌RUMINOCOCCUSTORQUES的7羟基类固醇脱氢酶催化。权利要求书CN104136620A4/5页512根据权利要求9所述的方法。
10、，其特征在于，所述方法用于使用其中两种具有相反的立体特异性的3种立体特异性羟基类固醇脱氢酶、通过下列使式IX的3，7，12三羟基5胆甾烷酸胆甾烷酸酶差向异构化A通过氧化以获得式X的3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12氧代CDC使所述式X的3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12氧代CDC进一步反应以获得式XI的3羟基7，12二氧代5胆甾烷酸12氧代KLC且随后还原为式XII的立体异构羟基化合物3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12酮基熊去氧胆酸或B通过氧化以获得式XIII的3，12二羟基7氧代5胆甾烷酸权利要求书CN104136620A5/5页6接下来通过酶氧化以获得式XI的所述3羟基7，12二氧代5胆甾。
11、烷酸12氧代KLC，且随后通过还原以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12酮基熊去氧胆酸，或C通过氧化以获得式XIII的3，12二羟基7氧代5胆甾烷酸，接下来通过酶还原以获得式XIV的3，7，12三羟基5胆甾烷酸且随后通过氧化以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12酮基熊去氧胆酸。13根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于C5或C6糖类的异构化，特别是用于通过还原为山梨糖醇且随后氧化为果糖的葡萄糖的异构化。14根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应批次中提供的用于产物的形成中涉及的氧化。
12、反应的底物的浓度为至少5重量/体积和更高、特别是7重量/体积和更高、特别是9重量/体积和更高。15根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述产物形成反应中整体上达到70、特别是90的转换率。权利要求书CN104136620A1/16页7用于氧化还原辅因子的酶再生的方法技术领域0001本发明涉及一种用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD/NADH和NADP/NADPH的酶再生的方法，其中，由于相同反应批次中进行的至少两种另外的酶催化氧化还原反应产物形成反应，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，另一种以其氧化型累积。背景技术0002现有技术0003酶催化氧化还原反应用于工业操作。
13、，例如，制备手性醇类、氨基酸类和羟基酸类。工业氧化还原反应中使用的大部分酶类使用诸如NADH或NADPH的辅因子。酶氧化还原反应中，由原位辅因子再生体系存储氧化还原辅因子是人们特别感兴趣的。其原因是仅使用催化量的昂贵辅因子NADP/NADPH是可能的。合适的脱氢酶类和其他酶类的可得导致各种辅因子再生体系的开发。0004至今为止描述的再生体系可归类为酶联的ENZYMELINKED、底物联的SUBSTRATELINKED、体内的活有机体内的天然辅因子再生体系、光化学的、化学的或电酶的。本处描述的方法涉及一种酶联再生体系。酶联再生体系的优点为高选择性、适用于制备各种产品和辅因子的高再利用率总转换数，。
14、TTN。0005在90年代中期，使用酶联辅因子再生体系的第一种工业方法用在吨级。在该方法中，使用来自博伊丁假丝酵母CANDIDABOIDINII的甲酸脱氢酶。现在已知的工业方法通常使用用于产物的合成的氧化还原酶和用于辅因子再生的另外的酶。0006产物和用于辅因子再生的两种酶体系的形成中涉及的两种或更多种酶氧化还原反应同时或依次的方法在一个反应批次中进行，不必从其中区分被分离的中间产物。最近这样的酶级联反应本文指一锅法反应得到特别很大关注，因为其有效减少了运行成本、运行时间和环境影响。此外，氧化还原反应的酶级联有利于通过常规化学方法难以实施的转化。0007然而，在一个一锅法反应中同时进行多个反应。
15、氧化和还原与平行的辅因子再生是具有挑战性的，因为对独立转化通常需要差异很大的反应条件。至今为止，仅进行了非常少量的使用相关联的辅因子再生体系的、包括氧化反应和还原反应的一锅法尝试。0008在文献ADVANCEDSYNTHCATAL，2008，第351卷，第9期，第13031311页中，描述了使用7羟基类固醇脱氢酶HSDH、7HSDH和12HSDH的一锅法反应的实验。在该方法中，区域选择和立体选择的氧化在胆酸的7位和12位进行，随后区域选择和立体选择的还原在7位进行。在该方法中，使用乳酸脱氢酶NAD相关的和葡萄糖脱氢酶NADP相关的作为辅因子再生体系。丙酮酸盐和葡萄糖用作辅底物。尽管这个方法开始。
16、的目的是真实的一锅法方法，最后氧化反应和还原反应独立进行。这样，氧化步骤和还原步骤的分配出现在所谓的“茶包”反应器或膜反应器中。需要该分配以避免由于NADPH葡萄糖脱氧酶的低辅因子选择性而产生副产物。然而，在一锅法反应中，葡萄糖脱氢酶NADP部分转化说明书CN104136620A2/16页8为NAD，这阻碍了氧化。在描述的方法中，仅125MM05的底物胆酸被使用，这从生态学的观点来看使该方法不受关注。0009此外，描述了使用一锅法体系通过潜手性酮作为中间产物进行仲醇的消旋体的去消旋化的尝试JAMCHEMSOC，2008，第130卷，第1396913972页。仲醇类的去消旋化通过具有不同辅因子特。
17、异性的两种醇脱氢酶S特异性的和R特异性的达到。在该体系中，NADP通过NADPH氧化酶再生过氧化氢制备且NADH通过甲酸脱氢酶再生。使用甲酸盐和氧作为辅底物。在这样的体系中，使用4种酶，不划分氧化步骤和还原步骤。该方法的缺点为使用的底物的非常低的浓度0205，这不适合用于工业目的。0010另一种一锅法体系描述在WO2009/121785A2中。在该方法中，将光活性的仲醇的异构体氧化为酮且随后还原为对应的旋光对映体，其中使用具有相反的立体选择性和不同的辅因子特异性的两种醇脱氢酶。通过所谓的“氢化物转移体系”仅使用一种另外的酶将辅因子再生。对于再生辅因子，使用各种酶类，诸如甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶。
18、、乳酸脱氢酶。该方法的缺点是使用的底物的浓度低。0011现在已知的涉及辅因子再生体系的酶一锅法方法的缺点全部为非常低的底物浓度，这对工业过程是无效率的。0012与此相反，其中使用辅因子再生体系的很多独立酶氧化还原反应已经是已知的。描述了使用微生物、细胞裂解物或独立酶类的实验，同时NADPH或NADP再生。用于独立的氧化还原反应的已知酶辅因子再生体系包括，例如用于NADH的甲酸脱氢酶甲酸盐作为辅底物、用于NADH的来自假单胞菌属PSEUDOMONASSP的醇脱氢酶2丙醇作为辅底物、用于NADH和NADPH的脱氢酶H2作为辅底物、用于NADPH的来自肠膜明串珠菌LMESENTEROIDES的葡萄糖。
19、6磷酸脱氢酶葡萄糖6磷酸盐作为辅底物、用于NADH和NADPH的葡萄糖脱氢酶葡萄糖作为辅底物、用于NADH的NADH氧化酶O2作为辅底物和用于NADH的亚磷酸脱氢酶亚磷酸盐作为辅底物。0013这样的独立的氧化还原反应的使用的例子为以适当的潜手性酮类化合物制备手性羟基化合物。在该方法中，辅因子通过另外的酶再生。这些方法的共同点是其构成了单独的还原反应且再生了NADPH参见例如EP1152054。0014已经描述了在更高底物浓度约1下进行的、使用与辅因子再生体系结合的羟基类固醇脱氢酶类的酶方法EPL731618；WO2007/118644；APPLMICROBIOLBIOTECHNOL，2011，。
20、第90卷，第127135页。在该方法中，辅因子NADPH或NADP通过不同酶类诸如，例如乳酸脱氢酶丙酮酸盐作为辅底物、来自布氏热厌氧杆菌TBROCKII的醇脱氢酶异丙醇作为辅底物、来自短乳酸杆菌LBREVIS、小型利什曼原虫LMINOR、檬酸明串珠菌LEUCONOSTOCCARNOSUM、嗜热厌氧乙醇菌TETHANOLICUS、拜氏梭菌CLOSTRIDIUMBEIJERINCKII的醇脱氢酶再生。然而，这些已知的方法仅涉及将单独的单个反应用于氧化羟基化合物或用于还原氧代化合物。0015已经描述了使用苹果酸脱氢酶苹果酸盐酶的、用于NADH的辅因子再生体系CANJCHEMENG1992，第70卷，。
21、第306312页。在该申请的公开内容中，其用于通过丙氨酸脱氢酶使丙酮酸盐还原胺化。辅因子再生过程中出现的丙酮酸盐随后用于产物形成反应。0016在WO2004/022764中，同样描述了通过苹果酸脱氢酶再生NADH。与前面描述的申说明书CN104136620A3/16页9请所公开的不同，没有另外使用苹果酸盐的氧化脱羧过程中出现的丙酮酸盐。0017已经描述了涉及辅因子再生体系将D木糖酶还原为木糖醇的例子FEBSJ，2005，第272卷，第38163827页。使用来自假单胞菌属的亚磷酸脱氢酶的NADPH相关的突变型作为辅因子再生酶。这也是用于形成产物的单个反应。0018已经描述了富手性对映异构体的有。
22、机化合物例如醇类或氨基酸类的酶制备的另外例子ORGANICLETTERS，2003，第5卷，第36493650页；US7,163,815；BIOCHEMENGJ，2008，第392卷，第319327页；EP1285962。在该体系中，使用来自短乳酸杆菌或旧金山乳酸杆菌LACTOBACILLUSSANFRANCISCENSIS的NADPH相关的氧化酶作为辅因子再生酶。这些试验同样组成了用于形成产物的单个反应。0019在WO201I/000693中，描述了17羟基类固醇脱氢酶以及能够在4雄甾烯3，17二酮的17位处进行氧化还原反应的方法。同样，这也为单独的还原反应。以上提到的独立进行的氧化反应或还。
23、原反应缺少一锅法反应的优点，诸如，例如由于节省时间和材料而节约成本以及由于酶级联反应的更好转换率。发明内容0020方法的目的和描述0021本发明的目的是提供一种用于再生氧化还原辅因子NAD/NADH和/或例如，和NADP/NADPH以由其在一个反应批次中以经济的方式进行两种或更多种酶催化氧化还原反应的方法。0022根据本发明，该目的以原来提到的方法来达到，其中提供了用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD/NADH和/或例如，和NADP/NADPH的酶再生的方法，其中，由于在相同反应批次中进行至少两种另外的酶催化氧化还原反应产物形成反应，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积且另一种以其氧化型。
24、累积，该方法的特征在于0023A在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，氧气或以下通式的化合物被还原00240025其中R1表示直链或支链C1C4烷基基团或C1C4羧基烷基基团，且0026B在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，C4C8环烷醇或以下通式的化合物被氧化00270028其中R2和R3独立地选自由H、C1C6烷基、C1C6烯基、芳基、羧基或C1C4羧基烷基、特别是环烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6C12芳基，所述环烷基例如为C3C8环烷基。说明书CN104136620A4/16页100。
25、029根据本发明提供的方法在本申请中也称为“根据本发明的方法”。0030在另一方面，本发明提供了根据本发明的用于一锅法反应中的氧化还原辅因子NAD/NADH和/或例如和NADP/NADPH的酶再生的方法，其中，由于在相同反应批次中进行至少两种另外的酶催化氧化还原反应等于产物形成反应，两种氧化还原辅因子中的一种以其还原型累积，且另一种以其氧化型累积，该方法的特征在于0031A在被氧化的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被还原00320033其中R1表示取代或未取代的C1C4烷基基团，且0034B在被还原的辅因子的再生过程中，以下通式的化合物被氧化00350036其中R2和R3相互独立地选自由下。
26、列构成的组00371H，00382C1C6烷基，其中所述烷基为直链或支链烷基，00393C1C6烯基，其中所述烯基为直链或支链烯基且任选地包括最多三个双键，00404环烷基，特别是C3C8环烷基，00415芳基，特别是C6C12芳基，00426C1C4羧基烷基，在式I的化合物为丙酮酸盐的情况下，任选地为羧基。0043在另一方面，根据本发明的方法中，R2和R3分别独立地选自由H、C1C6烷基、C1C6烯基、芳基、羧基或C1C4羧基烷基构成的组，其中所述烷基为直链或支链烷基，所述烯基为直链或支链烯基且包括一至三个双键，所述芳基特别是C6C12芳基。0044与现有技术相比，根据本发明的方法对其中化合。
27、物被酶氧化和酶还原的方法构成了很大改进，因为其能够在一个反应批次中进行需要的氧化反应和还原反应以及用于辅因子再生的相关联反应，同时，使用比根据现有技术的底物浓度明显更高的底物浓度。0045在根据本发明的方法中，使用辅因子NADH和/或NADPH。其中，NAD表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化型且NADH表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原型，而NADP表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化型且NADPH表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原型。0046不是辅因子再生的一部分且在根据本发明的方法中包括在产物的形成中的酶催化氧化还原反应，本申请中称为“氧化反应”和“还原反应”。“氧化反应”和“还原反应”以术语“产物。
28、形成反应”概括。根据本发明的方法中的产物形成反应总是包括至少一种氧化反应和至少一种还原反应。0047如果使用NAD作为氧化反应的辅因子，NADPH为用于还原反应的辅因子。如果使用NADP作为用于氧化反应的辅因子，NADH为用于还原反应的辅因子。0048在根据本发明的方法中，氧化反应和还原反应可以以按时间顺序平行或按时间顺说明书CN104136620A105/16页11序连续地、优选按时间顺序平行地在相同的反应批次中进行。0049目的是形成产物而使用的化合物在本申请中称为底物。辅因子再生过程中反应的化合物在本申请中称为辅底物。0050在根据本发明的方法中，可以使用一种底物以及多种底物。这样，还原。
29、反应和/或氧化反应可发生在相同的底物分子主链和不同的底物、优选相同的底物上。另外，在根据本发明的方法中，还原反应和/或氧化反应可发生在相同或不同的官能团上。0051根据本发明的方法适合用于多种反应，例如，用于通过氧化为对应的酮且随后还原为立体特异性相反的羟基化合物转化立体异构羟基化合物的构型。0052产物和用于辅因子再生的两种酶体系的形成中涉及的两种或更多酶氧化还原反应在一个反应批次中进行而没有分离中间产物的方法在本申请中称为“一锅法反应”。0053酸和酸的盐的陈述在本申请中包括各个没有提到的术语。同样，酸类特别是胆酸类的陈述在本申请中包括由其衍生的所有酯类。另外，部分拥有保护基的化合物包括在。
30、潜在的物质的陈述中。0054在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，氧化反应和还原反应按时间顺序平行地进行。0055在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，氧化反应和还原反应都在相同的分子主链上发生。0056在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用通过乳酸脱氢酶被还原为乳酸盐的丙酮酸盐辅底物作为式I的化合物2氧代酸，这表示，在将被还原的辅因子再转化为其初始氧化型的再生反应中，通过乳酸脱氢酶将丙酮酸盐还原为乳酸盐。0057在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用通过醇脱氢酶被氧化为丙酮的2丙醇异丙醇，IPA辅底物作为式II的化合物仲醇，这表。
31、示，在将被氧化的辅因子再转化为其初始还原型的再生反应中，通过醇脱氢酶将2丙醇氧化为丙酮。0058在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用通过NADH氧化酶被还原的氧气。0059在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用通过丁酮二酸盐脱羧的苹果酸脱氢酶苹果酸盐酶被氧化为丙酮酸盐和CO2的苹果酸盐辅底物作为仲醇，例如在将被氧化的辅因子在转化为其初始还原型的再生反应中，通过苹果酸脱氢酶将苹果酸盐氧化为丙酮酸盐和CO2。0060在该实施例中，使新生的丙酮酸盐在不用于形成产物但是构成第二辅因子再生反应的另一种氧化还原反应中反应。0061在本发明的优选实施例中，根据本发明的方。
32、法的特征在于，该方法用于在相同反应批次中分别进行以下通式的化合物的至少一种氧化反应和至少一种还原反应0062说明书CN104136620A116/16页120063其中0064R4表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，0065R5表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团，0066R6表示氢或羟基基团，0067R7表示氢、COR13、取代的或未取代的C1C4羧基烷基基团，其中R13为未取代或被羟基基团取代的C1C4烷基基团，所述取代的C1C4羧基烷基基团特别为被羟基基团取代的C1C4羧基烷基基团，0068或R6与R7一起表示氧代基团，0069R8表示氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，0070R9表示。
33、氢、甲基基团、羟基基团或氧代基团，0071R10表示氢、甲基基团或卤素，0072R11表示氢、甲基基团、羟基基团、氧代基团或卤素，和0073R12表示氢、羟基基团、氧代基团或甲基基团，0074其中结构元素00750076表示苯环或包括6个碳原子和0、1或2个CC双键的环；其中反应批次中提供的用于产物的形成中涉及的还原反应的底物的浓度5重量/体积。0077在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，发生了式VII的脱氢表雄酮DHEA至式VIII的睾酮的酶转化0078说明书CN104136620A127/16页130079在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，发生了例如使用两。
34、种立体特异性相反的羟基类固醇脱氢，通过酶氧化为式V的酮基石胆酸KLC和还原为式VI的3，7二羟基5胆甾烷酸熊去氧胆酸，UDC的式IV的羟基类固醇化合物3，7二羟基5胆甾烷酸鹅去氧胆酸，CDC的酶差向异构化00800081在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，该方法用于例如，使用3种立体特异性羟基类固醇脱氢酶所述3种立体特异性羟基类固醇脱氢酶中的两种具有相反的立体特异性通过下列步骤的式IX的3，7，12三羟基5胆甾烷酸胆甾烷酸的酶差向异构化00820083A通过氧化以获得式X的3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12氧代CDC0084说明书CN104136620A138/16页14008。
35、5所述式X的3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12氧代CDC进一步反应以获得式XI的3羟基7，12二氧代5胆甾烷酸12氧代KLC00860087且随后还原为式XII的立体异构羟基化合物3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12酮基熊去氧胆酸00880089或0090B通过氧化以获得式XIII的3，12二羟基7氧代5胆甾烷酸00910092接下来通过酶氧化以获得式XI的所述3羟基7，12二氧代5胆甾烷酸12氧代KLC，且随后通过还原以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12酮基熊去氧胆酸，0093或说明书CN104136620A149/16页150094C通过氧化以获得式XII。
36、I的3，12二羟基7氧代5胆甾烷酸，接下来通过酶还原以获得式XIV的3，7，12三羟基5胆甾烷酸00950096且随后通过氧化以获得式XII的所述立体异构羟基化合物3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸12酮基熊去氧胆酸；0097或0098A、B和/或C的任意组合。0099在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，使用C5糖类或C6糖类作为底物，例如，该方法用于C5糖类或C6糖类的异构化。0100在本发明的优选实施例中，根据本发明的方法的特征在于，葡萄糖的异构化通过还原为山梨糖醇和氧化为果糖来发生，例如，该方法用于通过还原为山梨糖醇且随后氧化为果糖使葡萄糖异构化。0101根据本发明的方法优选。
37、在含水体系中进行，其中可能的是用于氧化和还原反应的底物部分地以形式为悬浮液和/或作为第二液相的未溶解的状态提供。0102在特定实施例中，根据本发明的方法的特征在于，反应批次中提供的用于产物的形成中涉及的氧化反应的底物的浓度为至少5重量/体积或更高、优选7重量/体积或更高、特别优选9重量/体积或更高，例如在5重量/体积至20重量/体积范围内、诸如在5重量/体积至15重量/体积范围内、例如在5重量/体积至12重量/体积范围内、诸如在5重量/体积至10重量/体积范围内。0103在特定实施例中，根据本发明的方法的特征在于，产物形成反应中整体上达到70、特别是90的转换率。0104在根据本发明的方法中，。
38、可将缓冲液加入含水体系。合适的缓冲液为，例如PH在5至10范围内、优选在6至9范围内的磷酸钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐TRISHCL和甘氨酸。另外或可选地，可将用于稳定酶类的离子诸如MG2或其他添加剂诸如甘油加入体系。在根据本发明的方法中，加入的辅因子NADP和NADPH的浓度通常在0001MM与10MM之间、优选在001MM与1MM之间。0105取决于使用的酶类，根据本发明的方法可在10至70范围内、优选在20至45范围内的温度下进行。0106羟基类固醇脱氢酶类HSDH应当理解为催化了类固醇骨架上羟基基团至对应酮基基团的氧化或相反地酮基基团至对应羟基基团的还原的酶类。0107可用于羟基类固醇类。
39、的氧化还原反应的适当羟基类固醇脱氢酶类为，例如3HSDH、3HSDH、7HSDH、7HSDH或17HSDH。说明书CN104136620A1510/16页160108可从，例如梭状芽胞杆菌不同梭菌CLOSTRIDIUMABSONUM、索氏梭菌CLOSTRIDIUMSORDELII、大肠杆菌ECOLI或脆弱拟杆菌BACTEROIDESFRAGILIS获得具有7HSDH活性的适当的酶类。0109可从，例如瘤胃球菌RUMINOCOCCUSSP或不同梭菌，获得具有7HSDH活性的适当的酶类。0110可从，例如穴兔ORYCTOLAGUSCUNICULUS，获得适当的乳酸脱氢酶类。0111可从，例如高加索。
40、酸奶乳杆菌LACTOBACILLUSKER，获得适当的醇脱氢酶类。0112可从，例如热带念珠菌CANDIDATROPICALIS，获得适当的木糖还原酶。0113可从，例如绵羊肝、枯草杆菌BACILLUSSUBTILIS或苹果MALUSDOMESTICA，获得适当的山梨糖醇脱氢酶类。0114可从，例如肠膜明串珠菌LEUCONOSTOCMESENTEROIDES、变异链球菌STREPTOCOCCUSMUTANS、氨基戊酸梭菌CLOSTRIDIUMAMINOVALERICUM，获得适当的NADH氧化酶。0115在根据本发明的方法中，酶类优选地用作大肠杆菌中重组地过度表达的蛋白质类，其中优选继续使用对。
41、应的细胞裂解物而不进行任何另外的纯化。由此，酶的单位1U对应于每MIN反应1MOL的底物需要的酶的量。附图说明0116图1示出了通过中间产物3羟基7氧代5胆甾烷酸将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸的反应方案，其中使用2丙醇和丙酮酸盐进行辅因子再生。0117图2示出了通过中间产物3羟基7氧代5胆甾烷酸将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸的反应方案，其中使用苹果酸盐和丙酮酸盐进行辅因子再生。0118图3示出了通过中间产物3羟基7氧代5胆甾烷酸将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸的反应方案，其中使用2丙醇和氧气进行辅因子再生。0119图4示出了将葡萄糖异构化为果糖的反应方案，其中使用2丙醇和丙酮酸盐进行。
42、辅因子再生。0120图5示出了将葡萄糖异构化为果糖的反应方案，其中使用2丙醇和氧气进行辅因子再生。0121图6示出了通过中间产物3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸和3羟基7，12二氧代5胆甾烷酸将胆甾烷酸差向异构化为3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸的反应方案，其中使用2丙醇和丙酮酸盐进行辅因子再生。0122图7示出了通过中间产物3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸和3羟基7，12二氧代5胆甾烷酸将胆甾烷酸差向异构化为3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸的反应方案，其中使用2丙醇和氧气进行辅因子再生。0123图8和图9示出了通过中间产物3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸和3羟基7，12二氧代5胆甾烷酸将胆甾烷酸差向异。
43、构化为3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸的反应方案，其中使用2丙醇、丙酮酸盐和氧气进行辅因子再生。0124图10示出了通过不同中间产物和辅因子再生体系将胆甾烷酸差向异构化为3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸的反应方案。为了再生NAD，可选地使用乳酸脱氢说明书CN104136620A1611/16页17酶丙酮酸盐作为底物和NADH氧化酶氧作为底物。对于NADPH的再生，使用醇脱氢酶异丙醇作为底物。0125图11示出了通过中间产物3羟基7氧代5胆甾烷酸7酮基石胆酸7KLCAKLC将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸的反应方案，其中使用2丙醇和2戊醇每种情况下醇脱氢酶以及丙酮酸盐乳酸脱氢酶和氧NADH氧化酶进。
44、行辅因子再生。0126图中使用了以下缩写0127BSSDH来自枯草杆菌的山梨糖醇脱氢酶0128CA3，7，12三羟基5胆甾烷酸01297CA3，7，12，三羟基5胆甾烷酸0130CAOXO氨基戊酸梭菌NADH氧化酶0131CDC，CDCA3，7二羟基5胆甾烷酸0132CTXR热带念珠菌木糖还原酶01337HSDH7羟基类固醇脱氢酶01347HSDH7羟基类固醇脱氢酶013512HSDH12羟基类固醇脱氢酶0136KLC3羟基7氧代5胆甾烷酸01377KLCA3羟基7氧代5胆甾烷酸0138LACDHNADH相关的乳酸脱氢酶0139LKADHNADPH相关的高加索酸奶乳杆菌醇脱氢酶0140LMOX。
45、ID肠膜明串珠菌NADH氧化酶0141MALDHNADPH相关的大肠杆菌苹果酸脱氢酶01427OXOCA3，12二羟基7氧代5胆甾烷酸014312OXOCDC3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸014412OXOKLC3羟基7，12二氧代5胆甾烷酸014512OXOUDC3，7二羟基12氧代5胆甾烷酸0146SISDH羊肝山梨糖醇脱氢酶0147SMOXO变异链球菌NADH氧化酶0148UDCUDCA3，7二羟基5胆甾烷酸具体实施方式0149在以下示例中，所有温度数据以摄氏度给出。使用以下缩写0150ETOAC乙酸乙酯0151H小时0152IPA异丙基醇2丙醇0153MEOH甲醇0154RT室温015。
46、5示例10156使用乳酸脱氢酶和醇脱氢酶相关的辅因子再生体系、通过7羟基类固醇脱氢说明书CN104136620A1712/16页18酶和7羟基类固醇脱氢酶将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸015705ML原料CHARGE含有50MG鹅去氧胆酸、12U来自大肠杆菌的重组7羟基类固醇脱氢酶、6U来自扭链瘤胃球菌的重组7羟基类固醇脱氢酶以及05MMNAD和03MMNADPH。为了再生NAD，使用6U重组乳酸脱氢酶和350MM丙酮酸钠。为了再生NADPH，使用6U来自高加索酸奶乳杆菌的重组醇脱氢酶和初始的24IPA重量/体积。使反应在连续摇动850RPM下在25的含水磷酸钾缓冲液100MM，PH78中。
47、进行。继续使用敞开的体系以促进丙酮的蒸发和反应向熊去氧胆酸的移动。6H之后将16重量/体积IPA、16H之后将24重量/体积IPA另外配入，24H之后将39重量/体积IPA另外配入，且40H之后将08重量/体积IPA另外配入。此外，24H之后将20L的4甲基2戊醇加入。46H之后将200L的2戊醇以及16重量/体积IPA加入。48H之后，反应混合物中所有胆酸中熊去氧胆酸的比例97。0158示例20159使用乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶相关的辅因子再生体系、通过7羟基类固醇脱氢酶和7羟基类固醇脱氢酶将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸016005ML原料含有50MG鹅去氧胆酸、20U来自大肠杆菌的重组。
48、7羟基类固醇脱氢酶、20U来自扭链瘤胃球菌的重组7羟基类固醇脱氢酶以及1MMNAD和1MMNADPH。为了再生NAD，使用10U乳酸脱氢酶SIGMAALDRICH，且为了开始反应，使用165MM丙酮酸钠。为了再生NADPH，使用20U来自大肠杆菌的重组苹果酸脱氢酶和320MM苹果酸钠。使反应在连续摇动850RPM下在25的含水磷酸钾缓冲液100MM，PH78中进行。继续使用敞开的体系以允许产生的CO2逸出。16H之后和40H之后另外配入20U的7HSDH以及10U的乳酸脱氢酶。20H、24H、44H和48H之后另外配入10U的7HSDH。另外，40H之后另外配入10U苹果酸脱氢酶。72H之后，。
49、反应混合物中所有胆酸中的熊去氧胆酸的比例为约90。0161示例30162使用NADH氧化酶和醇脱氢酶相关的辅因子再生体系，通过7羟基类固醇脱氢酶和7羟基类固醇脱氢酶将鹅去氧胆酸差向异构化为熊去氧胆酸016305ML原料含有50MG鹅去氧胆酸、12U来自大肠杆菌的重组7羟基类固醇脱氢酶、75U来自扭链瘤胃球菌的重组7羟基类固醇脱氢酶以及1MMNAD和1MMNADPH。为了再生NAD，使用20U来自氨基戊酸梭菌的重组NADH氧化酶。为了再生NADPH，使用5U来自高加索酸奶乳杆菌的重组醇脱氢酶和初始的2IPA重量/体积。使反应在连续摇动850RPM下在25的含水磷酸钾缓冲液100MM，PH6中进行。继续使用敞开的体系以促进丙酮的挥发和反应向熊去氧胆酸的移动。18H、22H、26H和41H之后将2IP。