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1、10申请公布号CN104131068A43申请公布日20141105CN104131068A21申请号201310541387722申请日20131106C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12N15/1120060171申请人王文军地址421001湖南省衡阳市石鼓区船山路69号南华大学附属第一医院申请人左建宏宋西正72发明人王文军左建宏宋西正74专利代理机构衡阳市科航专利事务所43101代理人刘勋阶54发明名称一种采用巢式PCR检测脊柱结核分枝杆菌的方法及其专用引物57摘要一种采用巢式PCR检测脊柱结核分枝杆菌的方法及其专用引物，其中两对引物为以SEQIDNO1和SEQ。
2、IDNO2为上游引物，以SEQIDNO3和SEQIDNO4为下游引物；本发明还提供一种采用巢式PCR辅助检测脊柱结核分枝杆菌的引物对组来检测脊柱结核分枝杆菌的方法，其聚合酶链式反应的循环参数为95预变性10S；95变性30S；55退火,1MIN；72延伸1MIN；40CYCLES。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图1页10申请公布号CN104131068ACN104131068A1/1页21一种采用巢式PCR辅助检测脊柱结核分枝杆菌的引物对组包含由SEQIDNO1及SEQIDNO2组成的内引物对，和由SEQ。
3、IDNO3及SEQIDNO4组成的外引物对；所述引物对组的核苷酸序列分别为上游引物ATB5,GGCGGGACAACGCCAATTGCG3,上游引物BTB5,ACGACCACATCAACC3,下游引物CTB5,AGTTTGGTGTCATCAGCC3,下游引物DTB5,CGAGCTAGGCGTCGGTGACAAAG3,。2根据权利要求1所述的一种采用巢式PCR辅助检测脊柱结核分枝杆菌的引物对组，其特征在于“其采用的两队引物的含量分别为上游引物A290BPSEQIDNO1上游引物B856BPSEQIDNO2下游引物C505BPSEQIDNO3下游引物D670BPSEQIDNO4。3一种根据权利要求1。
4、所述的一种采用巢式PCR辅助检测脊柱结核分枝杆菌的引物对组来检测脊柱结核分枝杆菌的方法，其特征在于其聚合酶链式反应的循环参数为95预变性10S；95变性30S；55退火,1MIN；72延伸1MIN；40CYCLES。权利要求书CN104131068A1/6页3一种采用巢式PCR检测脊柱结核分枝杆菌的方法及其专用引物技术领域0001本发明涉及一种病原微生物的检测方法及其专用引物，具体来说就是一种采用巢式PCR检测脊柱结核分枝杆菌的方法及其专用引物。背景技术0002据世界卫生组织统计,全世界现有结核病人2000万,每年新发生约800万例,全世界平均每15秒就有一人死于结核病，每天有5000人因此丧。
5、生，仅2006年，就有200万人死于该病,约1/3人群有潜伏性结核分枝杆菌（MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS,MTB）感染。在发展中国家，由于耐药结核菌株的出现，人口剧增、移民增加、旅游业发展、酗酒与贫困、吸毒、合并获得性免疫缺陷病毒（HIV）感染、以及治疗性免疫抑制症导致的传染性结核病发病率逐年上升，从而使结核病控制趋势更加严峻。结核是成年人最主要的传染病杀手，也是HIV携带人群死亡的最主要感染原因。全球每年在结核方面的经济支出至少在120亿美元以上。0003骨关节结核是最常见的继发肺外结核，约占肺外结核发病率的10，脊柱结核俗称脊柱痨、龟背痰，在骨结核中最为常见，发病率约。
6、为50，而45脊柱结核病人常常因为椎体逐渐破坏、塌陷，后凸畸形进行性加重，最后导致脊髓或神经根损害，严重者发生迟发性麻痹，甚至截瘫。0004因此对结核病的检测变得尤为重要，目前对脊柱结核的临床诊断主要依靠临床症状、实验室及影像学检查。影像学检查包括X片、CT和MRI等，特别是重建CT的应用，可获得椎体隐匿病变的立体印象；平片在脊柱结核的诊断是首选的，但是其敏感性不高，在许多脊柱结核患者，临床症状很明显时，X平片可无表现，而在平片中被发现时，椎体50的骨矿已丢失，MRI作为较好的诊断技术之一，但做为普查及初筛时的检查，因其价格高而不能广泛使用。许多脊柱结核的临床症状和影像学表现多在疾病的中晚期出。
7、现，有的甚至不典型，故其诊断的及时性有限。结核的实验室检查包括涂片，菌培养及免疫学检查。结核病的细菌学检查，是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，但由于MTB的生长缓慢，脊柱结核患者排菌量少,致使作为“金标准”的结核细菌学培养存在着灵敏度低，操作复杂，需时较长，影响因素多，不易标准化等缺点；另外，由于脊柱、脊髓的解剖特性，脊柱结核起病隐匿，对脊柱结核，病灶取材多为有创检查，且椎体或深部脓肿的穿刺需要一定的技术要求，从而限制了其广泛应用；免疫学中的纯化蛋白衍生物PPD试验阳性率低，特异性差。因此，一种快速、灵敏、准确的早期脊柱结核诊断方法显得十分重要的意义。0005。
8、自1985年美国PECETUS公司的KARYMULLIS建立聚合酶链反应（POLYMERASECHAINREACTION,PCR）技术以来，PCR技术因其灵敏、特异、快速,已被广泛应用于遗传诊断、基因研究及病原体的检测等各方面，极大推动了生命科学的研究进展。而PCR自1989年引入结核病的检测以来,该技术对于难以培养、生长缓慢的结核分枝杆菌的分子生物学说明书CN104131068A2/6页4研究有着独特的意义，近年来，以PCR为基础的新型基因诊断技术发展很快，目前，不少学者正在探索如将特异性强的DNA探针与敏感性高的PCR技术相结合，并已成功用于临床标本结核分枝杆菌的检测。PCR技术目前在检测。
9、肺结核患者的痰液及其外周血中结核分枝菌DNA含量方面已较成熟，在脊柱结核患者脓液中检测结核分枝杆菌DNA含量方面也有很多研究，但用巢式PCR探讨快速检测结核分枝杆菌DNA及其含量的研究及临床应用，国内外文献报道较少。发明内容0006本发明的目的是提供一种采用巢式聚合酶链式反应（简称巢式PCR）来检测结核分枝杆菌DNA的方法及其专用引物。0007其中两对引物为以SEQIDNO1和SEQIDNO2为上游引物，以SEQIDNO3和SEQIDNO4为下游引物；所述引物对组的核苷酸序列分别为上游引物ATB5,GGCGGGACAACGCCAATTGCG3,上游引物BTB5,ACGACCACATCAACC3。
10、,下游引物CTB5,AGTTTGGTGTCATCAGCC3,下游引物DTB5,CGAGCTAGGCGTCGGTGACAAAG3,。0008上述引物的含量分别为上游引物A290BPSEQIDNO1上游引物B856BPSEQIDNO2下游引物C505BPSEQIDNO3下游引物D670BPSEQIDNO4。0009本发明还提供一种采用巢式PCR辅助检测脊柱结核分枝杆菌的引物对组来检测脊柱结核分枝杆菌的方法，其聚合酶链式反应的循环参数为95预变性10S；95变性30S；55退火,1MIN；72延伸1MIN；40CYCLES。0010图一为一张结核分枝杆菌DNA的电泳图，从图中可见DNA条带清晰且均匀。
11、一致，没有拖尾现象，说明提取成功，方法及操作可行；同时两条带明暗不一，表明它们DNA含量不同，符合本实验的要求。0011采用本发明所述的采用巢式聚合酶链式反应（简称巢式PCR）来检测结核分枝杆菌DNA的引物对以及利用该引物对来检测脊柱结核分枝杆菌的方法，具有如下优点1、耗时短，相对与常规的方法需要几周的时间，本发明仅需一天，或者几个小时。00122、特异性强，由于采用的是聚合酶链式反应，其中引物的正确设计是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TAQDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被。
12、扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的IS6110，其特异性程度就更高。00133、灵敏度高；本发明的的灵敏度可达3个RFU空斑形成单位）。附图说明0014图1为结核分枝杆菌DNA电泳图；说明书CN104131068A3/6页5图2为25例脊柱结核患者围的外周血标本中的MTBDNA扩增产物检测值图。具体实施方式0015本发明的目的是采用巢式聚合酶链式反应（简称巢式PCR）来检测结核分枝杆菌DNA。其中结核杆菌的插入序列IS6110采用巢式PCR试剂盒，其采用的两对引物为以SEQIDNO1和SEQIDNO2为内引物，以SEQIDNO3和SEQIDNO4为外引物。00。
13、16扩增体系采用100L扩增体系，包括引物TB294和TB294各025L，TB505和TB670各15L；DNTP2L；5BUFFER20L；POLYMERASE1L；TEMPLATE1L；去离子水补齐到100L。0017采用的试剂1结核分枝杆菌DNA提取试剂盒。00182结核分支杆菌核酸扩增PCR试剂盒。00193结核分枝杆菌DNA引物序列上游引物ATB5,GGCGGGACAACGCCAATTGCG3,290BP上游引物BTB5,ACGACCACATCAACC3,856BP下游引物CTB5,AGTTTGGTGTCATCAGCC3,505BP下游引物DTB5,CGAGCTAGGCGTCGGT。
14、GACAAAG3,670BP4琼脂糖电泳试剂1琼脂糖（AGAROSE）2溴化乙啶（EB）3TRIS4二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA）5DNAMARKER上海生工生物工程有限公司5其他由南华大学附一医院临床医学研究所杨慧龄博士根据其一种可消除非特异性条带的PCR方法发明专利（中国专利证书号ZL2004100450315）免费提供引物硫化修饰和高效保真酶。0020具体方法与步骤一常用试剂配制105MOL/LEDTAPH801861GEDTA加入去离子水90ML,剧烈搅拌，用NAOH约9G调节PH值至80，去离子水定容至100ML,高压灭菌备用。002125TRIS硼酸（TBE）缓冲液54GTRIS。
15、,275G硼酸，加入05MOL/LEDTA2ML，去离子水定容至100ML,使用时稀释10倍。0022二标本处理枸橼酸钠抗凝，20保存三检测质控设置1每次检测均设置MARK带以标示产物的大小，根据人标准结核分枝杆菌特异引物大小判定结果为阴性或阳性。00232设定阴性及阳性对照组。0024四具体操作严格按试剂盒说明及无菌操作要求操作。00251标本的DNA提取1结核分枝杆菌DNA提取样本的收集、储存和准备静脉抽血；枸橼酸钠抗凝，20说明书CN104131068A4/6页6保存备检；12000RPM离心15MIN，弃去上清；2加入600LTBPBUFFER洗2遍，12000RPM离心5MIN,弃去。
16、上清；3加入500LTBMBUFFER，3LPROTEINASEK，55水浴152H；4将上清液移至EZ10C0LUM中，加入260L无水乙醇，12000RPM离心3MIN,弃去COLLECTIONTUBE中液体；5加入500LWASHSOLUTION洗2遍，12000RPM离心1MIN，弃去COLLECTIONTUBE中液体（为尽可能去除WASHSOLUTION，可空柱后离心1MIN）；6将EZ10C0LUM放入另一干净的15ML离心管内，净化工作台通风15MIN（去除残留乙醇对DNA提取的影响）；7EZ10C0LUM内加入45LELUTIONBUFFER，室温放置5MIN，12000RPM。
17、离心1MIN，弃去EZ10C0LUM。00262PCR扩增体系SENSEPRIMERTB294025LREVERSEPRIMERTB850025LTB50515LTB67015LDNTP2L5BUFFER20LPOLYMERASE1LTEMPLATE1LWATER3LTOTALVOLUME100UL3PCR循环参数95预变性10S95变性30S55退火1MIN40CYCLES72延伸1MIN。00274琼脂糖电泳1琼脂糖凝胶配制PCR扩增产物片段较小，选用15琼脂糖凝胶，称取225G琼脂糖，加入150ML05TBE缓冲液，微波加热至琼脂糖粉末完全溶解，加入10MLEB，混匀2琼脂糖电泳琼脂糖凝。
18、胶微波加热至完全溶解，灌注入预先准备好的洁净不渗漏的凝胶玻板。待凝胶灌至近顶端时，立即插入合适的“梳子”，室温聚合30MIN,聚合完成后，拔出“梳子”，将凝胶玻板置于电泳槽中，加样孔位于阴极端，向电泳槽内倾入05TBE，冲洗加样孔和凝胶底部以除去气泡，“梳孔”内加DNAMARKER和样本PCR产物，150V95MA电泳30MIN，从电泳槽内取出玻板并小心撬开，置于ALPHALMAGERTM3400电泳成像仪，观察电泳结果。00283每个患者手术前后不同时间段扩增产物浓度含量的测定采用紫外分光说明书CN104131068A5/6页7光度法，用紫外分光光度计测定260NM和280NM两个波长处的光。
19、吸收，然后按IA260相当于50L/ML双链DNA，计算样品含量。00295PCR扩增结果判断1DNA提取质量判定把提取的DNA进行电泳，如果条带清晰且均匀一致，没有拖尾现象，说明提取成功。00302PCR产物根据4条IS6110引物大小及相互之间的关系扩增的MTBDNA产物均应在165BP、345BP、476BP、556BP大小处出现的IS6110基因表达条带为阳性。0031五、DNA提取质量将脊柱结核患者外周血提取的结核分枝杆菌DNA进行电泳（见图1），可见DNA条带清晰且均匀一致，没有拖尾现象，说明提取成功，方法及操作可行；同时两条带明暗不一，表明它们DNA含量不同，符合本实验的要求。0。
20、032六、本发明的特异性试验采用本发明方法检测对照组25例非结核仅椎间盘退变患者25份术后外周血及25份术中髓核共50份标本的MTBDNA，仅有1例术后外周血标本于165BP处出现弱阳性，与已知对照组为非结核患者不符，为假阳性结果，假阳性率为2（1/50）。0033七、脊柱结核患者围手术期外周血扩增产物MTBDNA含量比较将巢式PCR所测得的外周血实验组中25例脊柱结核患者围手术期术前1天、术后1天、术后7天及术后2周的外周血标本中的MTBDNA扩增产物检测值进行数据转换后，用均数标准差XS表示，结果见表1、图2。从图中可见，采用本发明能准确检测出脊柱结核患者的结核分枝杆菌。0034表125例。
21、脊柱结核患者围手术期外周血扩增产物MTBDNA含量比较注与术前1天比较，P王文军左建宏宋西正姚女兆林海英41DNA脊柱结核分枝杆菌SPINALMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISSMTBPRIMER1GGCGGGACAACGCCAATTGCG2DNA说明书CN104131068A6/6页8脊柱结核分枝杆菌SPINALMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISSMTBPRIMER2ACGACCACATCAACC3DNA脊柱结核分枝杆菌SPINALMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISSMTBPRIMER3AGTTTGGTGTCATCAGCC4DNA脊柱结核分枝杆菌SPINALMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISSMTBPRIMER4CGAGCTAGGCGTCGGTGACAAAG。说明书CN104131068A1/1页9图1图2说明书附图CN104131068A。