碳酸酐酶IX相关标记和其用途.pdf

本发明公开的内容提供检测癌干细胞的存在的方法和它们在癌症预后，评估癌症转移的风险，鉴定或证实药物候选物，和确定治疗效力中的用途。还提供用于检测癌干细胞的存在的试剂盒以及使用CAIX抑制剂治疗癌症的方法。

1.  一种鉴定或证实推定的癌症治疗剂的方法，所述方法包括：
(a)将癌细胞暴露于推定的癌症治疗剂以获得治疗的癌细胞，
(b)测量所述治疗的细胞的至少三种标记的水平，其中至少三种标记中的每种来自不同类型的标记，所述不同类型的标记选自：
(1)癌干细胞标记，
(2)选自间充质标记和上皮标记的上皮-间充质转变(EMT)标记，
(3)干性标记，
(4)mTORC1标记，和
(5)趋化因子标记；
(c)将至少在步骤(b)中测量的标记中每个的水平与所述至少三种标记中每个的参考水平进行比较；
其中，如果在步骤(b)中测量，癌干细胞标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记和趋化因子标记水平的降低，以及如果在步骤(b)中测量，上皮标记水平的增加表明所述推定的癌症治疗剂在治疗癌症中有效。

2.  如权利要求1所述的方法，其中所述癌干细胞标记是CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA或CD133。

3.  如权利要求1或2所述的方法，其中所述间充质标记是平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Snail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2或p23。

4.  如权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述上皮标记是E-钙黏着蛋白或桥粒斑蛋白。

5.  如权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述干性标记是Notch1或Jagged1。

6.  如权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述mTORC1标记是mTOR，Raptor，4EBP1或TSC2。

7.  如权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述趋化因子标记是RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3或CXCL10。

8.  如权利要求1至7任一项所述的方法，其中测量选自癌干细胞标记，间充质标记，上皮标记，干性标记，mTORC1标记和趋化因子标记中至少5 种标记的水平。

9.  如权利要求1至8任一项所述的方法，其中步骤(a)包括测量至少三种标记的一种或更多种的表达水平。

10.  如权利要求9所述的方法，其中所述表达水平是基因转录表达的水平。

11.  如权利要求9所述的方法，其中所述表达水平是蛋白表达的水平。

12.  如权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述至少三种标记包括趋化因子标记，并且其中步骤(b)包括测量由治疗的细胞分泌的趋化因子标记的水平。

13.  如权利要求1至8任一项所述的方法，其中步骤(b)包括测量所述至少三种标记的一种或更多种的磷酸化水平。

14.  如权利要求1至13任一项所述的方法，其中所述癌细胞是人癌细胞。

15.  如权利要求1至14任一项所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞，脑癌细胞，结肠癌细胞，卵巢癌细胞，胰腺癌细胞，前列腺癌细胞，黑色素瘤细胞或多发性骨髓瘤细胞。

16.  如权利要求1至15任一项所述的方法，其中所述推定的癌症治疗剂是CAIX抑制剂。

17.  一种检测细胞群体中癌干细胞的存在的方法，包括：
(a)测量细胞群体的至少三种标记水平，其中至少三种标记中每个来自不同类型的标记，所述不同类型的标记选自：
(1)癌干细胞标记，
(2)选自间充质标记和上皮标记的上皮-间充质转变(EMT)标记，
(3)干性标记，
(4)mTORC1标记，和
(5)趋化因子标记；
(b)将步骤(a)中测量的至少三种标记中每个的水平与所述至少三种标记中每个测量的参考水平相比较；
其中，如果在步骤(a)中测量，癌干细胞标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记和趋化因子标记水平的增加，以及如果在步骤(a)中测量，上 皮标记水平的降低表明细胞群体中存在癌干细胞。

18.  如权利要求17所述的方法，其中所述癌干细胞标记是CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA或CD133。

19.  如权利要求17或18所述的方法，其中所述间充质标记是平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Snail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2或p23。

20.  如权利要求17至19任一项所述的方法，其中所述上皮标记是E-钙黏着蛋白或桥粒斑蛋白。

21.  如权利要求17至20任一项所述的方法，其中所述干性标记是Notch1或Jagged1。

22.  如权利要求17至21任一项所述的方法，其中所述mTORC1标记是mTOR，Raptor，4EBP1或TSC2。

23.  如权利要求17至22任一项所述的方法，其中所述趋化因子标记是RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3或CXCL10。

24.  如权利要求17至23任一项所述的方法，其中测量选自癌干细胞标记，间充质标记，上皮标记，干性标记，mTORC1标记和趋化因子标记中至少5种标记的水平。

25.  如权利要求17至24任一项所述的方法，其中步骤(a)包括测量所述至少三种标记中的一种或更多种的表达水平。

26.  如权利要求25所述的方法，其中所述表达水平是基因转录表达水平。

27.  如权利要求25所述的方法，其中所述表达水平是蛋白表达水平。

28.  如权利要求17至24任一项所述的方法，其中所述至少三种标记包括趋化因子标记，并且其中步骤(a)包括测量由细胞群体分泌的趋化因子标记水平。

29.  如权利要求17至24任一项所述的方法，其中步骤(a)包括测量至少三种标记中的一种或更多种的磷酸化水平。

30.  如权利要求17至29任一项所述的方法，其中所述细胞群体来自人生物样品。

31.  如权利要求17至30任一项所述的方法，其中所述癌干细胞是乳腺癌干细胞，脑癌干细胞，结肠癌干细胞，卵巢癌干细胞，胰腺癌干细胞，前 列腺癌干细胞，黑色素瘤干细胞或多发性骨髓瘤干细胞。

32.  如权利要求17至30任一项所述的方法，其中所述细胞群体来自癌症治疗后的癌症患者。

33.  一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
(a)检测根据权利要求17至32任一项所述的癌症样品中癌干细胞的存在，其中所述细胞群体来自所述癌症样品，和
(b)如果在所述癌症样品中检测到癌干细胞，向患者施用有效量的CAIX抑制剂。

34.  一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向患者施用有效量的CAIX抑制剂，其中所述患者已被诊断含有根据权利要求17至32任一项所述的癌干细胞。

35.  如权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述CAIX抑制剂是MST-104或MST-205。

36.  如权利要求33至35任一项所述的方法，进一步包括向患者施用有效量的紫杉烷。

37.  如权利要求36所述的方法，其中所述紫杉烷是紫杉醇。

38.  一种试剂盒，其包含对至少三种标记具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子，其中至少三种标记中每个来自不同类型的标记，所述不同类型标记选自：
(1)癌干细胞标记，
(2)选自间充质标记和上皮标记的上皮-间充质转变(EMT)标记，
(3)干性标记，
(4)mTORC1标记，和
(5)趋化因子标记。

39.  如权利要求38所述的试剂盒，其中所述癌干细胞标记是CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA或CD133。

40.  如权利要求38或39所述的试剂盒，其中所述间充质标记是平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Snail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2或p23。

41.  如权利要求38至40任一项所述的试剂盒，其中所述上皮标记是E-钙黏着蛋白或桥粒斑蛋白。

42.  如权利要求38至41任一项所述的试剂盒，其中所述干性标记是Notch1或Jagged1。

43.  如权利要求38至42任一项所述的试剂盒，其中所述mTORC1标记是mTOR，Raptor，4EBP1或TSC2。

44.  如权利要求38至43任一项所述的试剂盒，其中所述趋化因子标记是RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3或CXCL10。

45.  如权利要求38至44任一项所述的试剂盒，其包含对选自癌干细胞标记，间充质标记，上皮标记，干性标记，mTORC1标记和趋化因子标记中的至少5种标记具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子。

46.  如权利要求38至45任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括阵列，所述蛋白结合分子附着于该阵列。

47.  一种试剂盒，其包含对至少三种标记特异性的寡核苷酸引物或探针，其中至少三种标记中每个来自不同类型的标记，所述不同类型的标记选自：
(1)癌干细胞标记，
(2)选自间充质标记和上皮标记的上皮-间充质转变(EMT)标记，
(3)干性标记，
(4)mTORCl标记，和
(5)趋化因子标记。

48.  权利要求47的试剂盒，其中所述癌干细胞标记是CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA或CD133。

49.  权利要求47或48的试剂盒，其中所述间充质标记是平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Snail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2或p23。

50.  如权利要求47至49任一项所述的试剂盒，其中所述上皮标记是E-钙黏着蛋白或桥粒斑蛋白。

51.  如权利要求47至50任一项所述的试剂盒，其中所述干性标记是Notch1或Jagged1。

52.  如权利要求47至51任一项所述的试剂盒，其中所述mTORC1标记是mTOR，Raptor，4EBP1或TSC2。

53.  如权利要求47至52任一项所述的试剂盒，其中所述趋化因子标记 是RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3或CXCL10。

54.  如权利要求47至53任一项所述的试剂盒，其包括对选自癌干细胞标记，间充质标记，上皮标记，干性标记，mTORC1标记和趋化因子标记中的至少5种标记特异性的寡核苷酸探针或引物。

55.  如权利要求47至54任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括阵列，所述寡核苷酸探针附着于该阵列。

碳酸酐酶IX相关标记和其用途
背景技术
技术领域
本发明属于癌干细胞标记和此种标记在鉴定或证实推定的癌症治疗剂，检测癌干细胞，和治疗癌症中的用途的领域。
相关技术的描述
癌干细胞(CSC)是肿瘤内的小的，明显的癌细胞亚群。CSC具有类干细胞的性质，包括自我更新和增加的克隆潜力，并偶尔分裂产生子干细胞和分化的肿瘤细胞。CSC拥有使肿瘤再生的能力，然而，大多数肿瘤细胞是分化的并且缺乏这种再生能力。
CSC被认为是造成患者旧病复发和转移的原因，因为它们在常规治疗中存活下来，介导化疗抗性和肿瘤进展。因此，仅当CSC被根除时，恶性肿瘤才能被有效“治愈”。
在多种环境，包括乳腺中，组织氧水平在调节癌干细胞中发挥关键作用。缺氧诱导缺氧-响应基因(包括碳酸酐酶IX(CAIX))的表达。该金属酶催化二氧化碳水合为碳酸氢盐和质子，因此在胞内和胞外pH调节中发挥重要作用。
CAIX在缺氧肿瘤，包括乳腺恶性肿瘤中上调，在其中，其被认为是对于远端的转移和人乳腺癌的存活欠佳的预后标记。在这些乳腺肿瘤的缺氧区域中，CAIX活性通过其肿瘤pH的调节在肿瘤细胞的存活中挥重要作用。CAIX可以通过让侵略性的肿瘤细胞在通过缺氧强加的恶劣环境中存活，促进增殖和存活细胞的侵袭增加转移潜力。
为了鉴定给定的患者或肿瘤是否将对作为治疗的CAIX抑制易感，和为了监控治疗进程，评估CAIX通路参与的肿瘤的工具对治疗肿瘤方面的医疗群体能够有巨大的价值。
简要概述
本发明公开的内容提供以下实施方案：
1.一种鉴定或证实推定的癌症治疗剂的方法，所述方法包括：
(a)将癌细胞暴露于推定的癌症治疗剂获得治疗的癌细胞，
(b)测量所述治疗的细胞的至少三种标记的水平，其中至少三种标记中的每种来自不同类型的标记，所述不同类型的标记选自：
(1)癌干细胞标记，
(2)选自间充质标记和上皮标记的上皮-间充质转变(EMT)标记，
(3)干性(stemness)标记，
(4)mTORC1标记，和
(5)趋化因子标记；
(c)将至少在步骤(b)中测量的标记中每个的水平与所述至少三种标记中每个的参考水平进行比较；
其中，如果在步骤(b)中测量，癌干细胞标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和趋化因子标记的水平的降低，以及如果在步骤(b)中测量，上皮标记水平的增加表明所述推定的癌症治疗剂在治疗癌症中有效。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述癌干细胞标记是CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA或CD133。
3.如实施方案1或2所述的方法，其中所述间充质标记是平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Snail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2或p23。
4.如实施方案1至3任一项所述的方法，其中所述上皮标记是E-钙黏着蛋白(E-Cadherin)或桥粒斑蛋白(Desmoplakin)。
5.如实施方案1至4任一项所述的方法，其中所述干性标记是Notch1或Jagged1。
6.如实施方案1至5任一项所述的方法，其中所述mTORC1标记是mTOR，Raptor，4EBP1或TSC2。
7.如实施方案1至6任一项所述的方法，其中所述趋化因子标记是RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3或CXCL10。
8.如实施方案1至7任一项所述的方法，其中测量选自癌干细胞标记，间充质标记，上皮标记，干性标记，mTORC1标记和趋化因子标记中至少5种标记的水平。
9.如实施方案1至8任一项所述的方法，其中步骤(a)包括测量至少三 种标记的一种或更多种的表达水平。
10.如实施方案9所述的方法，其中所述表达水平是基因转录表达的水平。
11.如实施方案9所述的方法，其中所述表达水平是蛋白表达的水平。
12.如实施方案1至8任一项所述的方法，其中所述至少三种标记包括趋化因子标记，并且其中步骤(b)包括测量由治疗的细胞分泌的趋化因子标记的水平。
13.如实施方案1至8任一项所述的方法，其中步骤(b)包括测量至少三种标记的一种或更多种的磷酸化水平。
14.如实施方案1至13任一项所述的方法，其中所述癌细胞是人癌细胞。
15.如实施方案1至14任一项所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞，脑癌细胞，结肠癌细胞，卵巢癌细胞，胰腺癌细胞，前列腺癌细胞，黑色素瘤细胞或多发性骨髓瘤细胞。
16.如实施方案1至15任一项所述的方法，其中所述推定的癌症治疗剂是CAIX抑制剂。
17.一种检测细胞群体中癌干细胞的存在的方法，包括：
(a)测量细胞群体的至少三种标记水平，其中至少三种标记中每个来自不同类型的标记，所述不同类型的标记选自：
(1)癌干细胞标记，
(2)选自间充质标记和上皮标记的上皮-间充质转变(EMT)标记，
(3)干性标记，
(4)mTORC1标记，和
(5)趋化因子标记；
(b)将步骤(a)中测量的至少三种标记中每个的水平与对于至少三种标记中每个测量的参考水平相比较；
其中，如果在步骤(a)中测量，癌干细胞标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和趋化因子标记水平的增加，以及如果在步骤(a)中测量，上皮标记水平的降低表明细胞群体中存在癌干细胞。
18.如实施方案17所述的方法，其中所述癌干细胞标记是CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA或CD133。
19.如实施方案17或18所述的方法，其中所述间充质标记是平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Snail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2或p23。
20.如实施方案17至19任一项所述的方法，其中所述上皮标记是E-钙黏着蛋白或桥粒斑蛋白。
21.如实施方案17至20任一项所述的方法，其中所述干性标记是Notch1或Jagged1。
22.如实施方案17至21任一项所述的方法，其中所述mTORC1标记是mTOR，Raptor，4EBP1或TSC2。
23.如实施方案17至22任一项所述的方法，其中所述趋化因子标记是RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3或CXCL10。
24.如实施方案17至23任一项所述的方法，其中测量选自癌干细胞标记，间充质标记，上皮标记，干性标记，mTORC1标记和趋化因子标记中至少5种标记的水平。
25.如实施方案17至24任一项所述的方法，其中步骤(a)包括测量至少三种标记中的一种或更多种的表达水平。
26.如实施方案25所述的方法，其中所述表达水平是基因转录表达水平。
27.如实施方案25所述的方法，其中所述表达水平是蛋白表达水平。
28.如实施方案17至24任一项所述的方法，其中所述至少三种标记包括趋化因子标记，并且其中步骤(a)包括测量由细胞群体分泌的趋化因子标记水平。
29.如实施方案17至24任一项所述的方法，其中步骤(a)包括测量至少三种标记中的一种或更多种的磷酸化水平。
30.如实施方案17至29任一项所述的方法，其中所述细胞群体来自人生物样品。
31.如实施方案17至30任一项所述的方法，其中所述癌干细胞是乳腺癌干细胞，脑癌干细胞，结肠癌干细胞，卵巢癌干细胞，胰腺癌干细胞，前列腺癌干细胞，黑色素瘤干细胞或多发性骨髓瘤干细胞。
32.如实施方案17至30任一项所述的方法，其中所述细胞群体来自癌症治疗后的癌症患者。
33.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
(a)检测根据实施方案17至32任一项所述的癌症样品中癌干细胞的存在，其中所述细胞群体来自所述癌症样品，和
(b)如果在所述癌症样品中检测到癌干细胞，向患者施用有效量的CAIX抑制剂。
34.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向患者施用有效量的CAIX抑制剂，其中所述患者已被诊断含有根据实施方案17至32任一项所述的癌干细胞。
35.如实施方案33或实施方案34所述的方法，其中所述CAIX抑制剂是MST-104或MST-205。
36.如实施方案33至35任一项所述的方法，进一步包括向患者施用有效量的紫杉烷(taxane)。
37.如实施方案36所述的方法，其中所述紫杉烷(taxane)是紫杉醇。
38.一种试剂盒，其包含对至少三种标记具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子，其中至少三种标记中每个来自不同类型的标记，所述不同类型标记选自：
(1)癌干细胞标记，
(2)选自间充质标记和上皮标记的上皮-间充质转变(EMT)标记，
(3)干性标记，
(4)mTORC1标记，和
(5)趋化因子标记。
39.如实施方案38所述的试剂盒，其中所述癌干细胞标记是CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA或CD133。
40.如实施方案38或39所述的试剂盒，其中所述间充质标记是平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Snail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2或p23。
41.如实施方案38至40任一项所述的试剂盒，其中所述上皮标记是E-钙黏着蛋白或桥粒斑蛋白。
42.如实施方案38至41任一项所述的试剂盒，其中所述干性标记是 Notch1或Jagged1。
43.如实施方案38至42任一项所述的试剂盒，其中所述mTORC1标记是mTOR，Raptor，4EBP1或TSC2。
44.如实施方案38至43任一项所述的试剂盒，其中所述趋化因子标记是RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3或CXCL10。
45.如实施方案38至44任一项所述的试剂盒，其包含对选自癌干细胞标记，间充质标记，上皮标记，干性标记，mTORC1标记，和趋化因子标记中的至少5种标记具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子。
46.如实施方案38至45任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括阵列，蛋白结合分子附着于所述阵列。
47.一种试剂盒，其包含对至少三种标记特异性的寡核苷酸引物或探针，其中至少三种标记中每个来自不同类型的标记，所述不同类型的标记选自：
(1)癌干细胞标记，
(2)选自间充质标记和上皮标记的上皮-间充质转变(EMT)标记，
(3)干性标记，
(4)mTORC1标记，和
(5)趋化因子标记。
48.实施方案47的试剂盒，其中所述癌干细胞标记是CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA或CD133。
49.实施方案47或48的试剂盒，其中所述间充质标记是平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Snail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2或p23。
50.如实施方案47至49任一项所述的试剂盒，其中所述上皮标记是E-钙黏着蛋白或桥粒斑蛋白。
51.如实施方案47至50任一项所述的试剂盒，其中所述干性标记是Notch1或Jagged1。
52.如实施方案47至51任一项所述的试剂盒，其中所述mTORC1标记是mTOR，Raptor，4EBP1或TSC2。
53.如实施方案47至52任一项所述的试剂盒，其中所述趋化因子标记是RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3或CXCL10。
54.如实施方案47至53任一项所述的试剂盒，包括对选自癌干细胞标记，间充质标记，上皮标记，干性标记，mTORC1标记，和趋化因子标记中的至少5种标记特异性的寡核苷酸探针或引物。
55.如实施方案47至54任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括阵列，所述寡核苷酸探针附着于该阵列。
在以下描述中，在本文提供的任何范围包括在所述范围中的所有值。还应该注意，术语“或”通常以包括“和/或”(即，意为备选方案的一个，两个都，或其任何组合)的其意义使用，除非内容明确另有指示。术语“约”当指数量或数量范围时，意为指在实验的变化性内(或统计学实验误差内)的近似值的数量或数量范围，并且因此数量或数量范围可以在陈述的数量或数量范围的1％和15％之间变化。另外，如在本说明书和所附的实施方案中使用的，单数形式“一个(a)，”“一个(an)，”和“那个(the)”包括复数对象，除非内容明确另有指示。
附图简述
图1显示常氧或缺氧下以肿瘤球(tumorspheres，TS)培养的4T1-shNS和4T1-shCAIX细胞系中CAIX水平的蛋白质印迹的再现。肌动蛋白表达水平显示为上样对照。
图2显示在Mammocult^TM培养基中培养7天后典型的4T1-shNS，或4T1-shCAIX TSs的相差显微图像(phase contrast micrograph images)。比例尺＝100μm。
图3显示在不同条件下起始TS形成所需的细胞数量。将4T1shNS和shCAIX以二倍稀释接种并在TS-形成条件下在常氧或缺氧情况下培养。显示三个独立实验的平均值±SEM。使用T-检验验证统计学显著性，*P＜0.03，**P＜0.006。
图4显示显示％CD44+CD24-/低的细胞±SEM的变化的代表性FACS曲线。在常氧或缺氧条件下培养shNS和shCAIX4T1细胞为TSs，解聚并且通过FACS分析评估CD44+CD24-/低的群体。
图5显示说明来自3个独立实验％CD44+CD24-/低的细胞±SEM的平均改变的FACS数据的图示。使用T-检验验证统计学显著性，*P＜0.004，**P＜0.025。
图6是起始TS生长所需细胞的数量的图表。将亲代4T1以双倍稀释接种并在常氧或缺氧条件下，在加入200μM CAI17或载体的TS-形成条件下培养。显示三个独立实验的平均值±SEM。使用T-检验验证统计学显著性，*P＜0.001，**P＜0.0060。
图7是TS形成部分的图解描述。将在缺氧条件下培养为TSs的4T1shNS和shCAIX进行FACS。将源自两种细胞系的CD44+CD24-/低或CD44-CD24+对照细胞在缺氧条件下以双倍稀释在TS-形成条件下接种并记录形成所需的细胞数量(参见补充的作为原始数据的表1)。从4个独立实验使用平均TS形成部分(±SEM)计算TS形成部分。
图8显示在常氧或缺氧条件下以肿瘤球在持续旋转下培养，冷冻，并切片的亲代4T1的免疫染色图像。免疫染色用于评估癌干细胞标记CD133和CAIX的表达。比例尺＝50μm。
图9-12显示免疫染色的亲代4T1细胞(在常氧或缺氧条件下培养为TSs，解聚，对CD44，CD24染色并通过FACS收集)。酌情在常氧或缺氧条件下在玻璃盖玻片上培养CD44+CD24-/低或CD44+CD24+细胞，随后固定并对CAIX(图9)；E-钙黏着蛋白(图10)；间充质标记(例如平滑肌肌动蛋白)(图11)；和EMT调节剂Snail(图12)免疫染色。
图13-15显示在常氧或缺氧条件下以肿瘤球在持续旋转下培养，冷冻，并切片的亲代4T1的免疫染色图像。免疫染色用于评估上皮标记E-钙黏着蛋白和CAIX(图13)；间充质标记平滑肌肌动蛋白和CAIX(图14)；和EMT调节剂Snail和CAIX(图15)的表达。比例尺＝50μm。
图16-18显示免疫染色的4T1shNS和shCAIX细胞(在缺氧条件下培养为TSs，解聚，对CD44，CD24染色并通过FACS收集)。收集能存活的CD44+CD24-/低或CD44+CD24+细胞并在缺氧条件下在玻璃盖玻片上培养3天，固定并通过免疫染色评估E-钙黏着蛋白(图16)；平滑肌肌动蛋白(图17)；和Snail(图18)的表达。
图19是显示对于不同EMT标记的mRNA水平的系列图。将4T1shNS和shCAIX细胞在缺氧条件下培养为TSs，解聚，对CD44，CD24细胞染色并通过FACS收集。收集能存活的CD44+CD24-/低或CD44+CD24+细胞并在缺氧条件下在玻璃盖玻片上培养3天，裂解，提取RNA并且通 过QPCR评估不同EMT标记的相对mRNA水平。给出三个独立实验的平均值和SEM的倍数改变。
图20是在常氧条件下培养为TSs，解聚，对CD44，CD24染色并通过FACS收集的亲代4T1细胞的图像。收集能存活的CD44+CD24-/低或CD44-CD24+细胞并在有和没有50μM MST-104的情况下，在缺氧条件下在玻璃盖玻片上培养5天，固定并通过免疫染色评估E-钙黏着蛋白的表达。
图21是体内肿瘤生长的图示。将MDA-MB-231LM2-4luc+同位移植于NOD/SCID小鼠。当肿瘤达到200mm²的平均值时，动物接受载体，38mg/kg MST-104或30mg/kg MST-205之一。监控随后的肿瘤生长。n＝8/组。*P＜0.02，**P＜0.01。
图22A和22B是显示来自3只小鼠的EpCAM+细胞±SEM的平均改变的代表性的FACS曲线(图22A)和线条图(图22B)。将MDA-MB-231LM2-4luc+同位移植入NOD/SCID小鼠。当肿瘤达到200mm²的平均值，动物接受载体或38mg/kg MST-104之一。27天后，将原发性肿瘤取出，分离并通过FACS分析评估EpCAM+细胞群。使用T-检验验证统计学显著性。***P＜0.0331，**P＜0.0224.
图23A和23B是显示同位移植入NOD/SCID小鼠的MDA-MB-231LM2-4luc+细胞的代表性的FACS曲线(图23A)和线条图(图23B)。当肿瘤达到200mm²的平均值时，动物接受载体或30mg/kg MST-205之一。27天后，将原发性肿瘤取出，分离并通过FACS分析评估EpCAM+细胞群。显示代表性的FACS曲线。线条图显示来自3只小鼠的EpCAM+细胞±SEM的平均改变。使用T-检验验证统计学显著性。***P＜0.0331，**P＜0.0224。
图24显示IHC-标记的肿瘤的图像。将MDA-MB-231LM2-4luc+细胞同位移植入NOD/SCID小鼠。当肿瘤达到200mm²的平均值时，动物接受载体，38mg/kg MST-104之一。27天后，将原发性肿瘤固定，切片并进行IHC以评估阳性癌干细胞标记ALDH1A3的表达。
图25显示IHC标记的肿瘤的图像。将MDA-MB-231LM2-4luc+细胞同位移植入NOD/SCID小鼠。当肿瘤达到200mm²的平均值时，动物接受 载体或38mg/kg MST-104之一。27天后，将原发性肿瘤固定，切片并进行IHC以评估CAIX的表达。
图26显示体内肿瘤生长的图示。将MDA-MB-231LM2-4Luc+细胞移植入NOD/SCID小鼠，建立肿瘤10天并随后起始治疗。根据图中概述的给药时间表(箭头)通过静脉注射施用紫杉醇并通过腹腔注射提供MST-104。n＝7-8/组。*P＜0.02，**P＜0.002。
图27显示从带有人乳腺肿瘤的小鼠切除并通过IVIS离体(ex vivo)进行肺转移分析的肺的图像。指示转移的热量图覆盖在肺的灰度图上。
图28显示定量从带有人同位乳腺肿瘤并用与常规化疗剂(紫杉醇)联合的MST-104治疗的小鼠自发肺转移的图示。显示对于各组的平均总光子通量±SEM。
图29A-29E显示代表性的FACS数据。将NOD-SCID小鼠乳腺脂肪垫用MDA-MB-231LM2-4乳腺癌细胞接种。以紫杉醇，或MST-104，或两种药物组合，或载体对小鼠IV给药。在人道的终点，切除肿瘤并且通过FACS评估能存活的EpCAM阳性群体。
图30显示以紫杉醇，或MST-104，或两种药物组合，或载体静脉内给药的，用MDA-MB-231LM2-4乳腺癌细胞接种的NOD-SCID小鼠乳腺脂肪垫的FACS分析的图示。在人道的终点，切除肿瘤并且通过FACS评估能存活的EpCAM阳性群体。线条图显示来自每组的三个肿瘤的平均值±SEM。
图31显示在常氧(N)或缺氧(H)条件下培养为TSs的4T1-shNS和4T1-shCAIX细胞表达的mTOR通路的一些组分的蛋白水平的蛋白质印迹。显示在Raptor免疫印迹下的Raptor/肌动蛋白密度测定值。肌动蛋白的表达水平显示为上样对照。
图32显示证明通过在缺氧条件下培养为TSs并用CAIX抑制剂治疗7天的亲代4T1细胞表达的mTOR和Raptor的蛋白水平的蛋白质印迹。微管蛋白的表达显示为上样对照。
图33显示证明通过分离自用载体或MST-104治疗的携带肿瘤小鼠的MDA-MB-231LM2-4Luc+人乳腺癌细胞表达的一些mTOR通路组分的蛋白水平的蛋白质印迹。肌动蛋白和GAPDH的表达水平显示为上样对照。
图34显示通过定量实时PCR证明CAIX消耗对一些趋化因子基因的mRNA水平的影响的图表。将4T1-shNS，4T1-shCAIX(A)和4T1-shCAIX(B)细胞在常氧和缺氧条件下培养24h。收获细胞，提取mRNA，并制备cDNA和通过qPCR分析。显示三个独立实验的平均值倍数变化±SEM。通过T-检验验证统计学显著性，*P＜0.05。
图35显示定量存在于从在无血清生长培养基中在缺氧条件下孵育24h的4T1-shNS和4T1-shCAIX细胞回收的条件培养基中的小鼠CXCL10的量的ELISA数据的图示。显示三个独立实验的平均值倍数变化±SEM。通过T-检验验证统计学显著性，P＝0.003。
图36显示定量存在于从在无血清生长培养基中在缺氧条件下孵育24h的4T1-shNS和4T1-shCAIX细胞回收的条件培养基中的小鼠G-CSF的水平的ELISA数据的图示。显示三个独立实验的平均浓度±SEM。通过T-检验验证统计学显著性，P＝0.008。
详细描述
本发明公开的内容提供检测癌干细胞的存在的方法和其在癌症预后，评估癌症转移风险，鉴定或证实药物候选物，和确定治疗效力的用途。其还提供用于检测癌干细胞的存在的试剂盒以及使用CAIX抑制剂治疗癌症的方法。
本发明公开的内容部分基于本发明人的以下发现：(1)某些上皮-间充质转变(EMT)标记和调节剂的表达，干性标记的表达，和癌干细胞在缺氧条件下扩张需要CAIX，(2)mTORC1信号转导通路在调节癌干细胞功能方面是CAIX的关键的通路下游，和(3)是在缺氧条件下由癌干细胞分泌趋化因子需要CAIX。因此，本发明人发现一些不同类型的标记，其水平受CAIX影响。在本文此种标记共同被称为“CAIX相关生物标记”或“CAIX相关标记。”
生物标记
如本文使用的“生物标记(Biomarker)”或“标记(marker)”，指其存在，缺失，或量是特定细胞类型或细胞过程的特征或是特定细胞类型或细胞过程所需的分子(例如，基因，mRNAs，或蛋白)。如本文使用的“生物标记，”还可以指具有类似功能的特定信号通路或蛋白的组和编码所述蛋白 的组的基因或mRNA的组分。
如本文使用的基因或蛋白名称和符号，意在包括相关基因，mRNA，cDNA，蛋白，或其片段，除非另有说明。
“癌干细胞”(CSC)是在肿瘤或血液肿瘤中发现的，能够产生在特定癌症样品中发现的所有细胞类型的癌细胞。CSC因此是致瘤的(肿瘤-形成)并且可以通过自我更新和分化为多种细胞类型的干细胞过程产生肿瘤。
“癌干细胞标记”或“癌干细胞生物标记”指与其它癌细胞相比区别存在于癌干细胞中的分子(例如，基因，mRNAs，或蛋白)。如果癌干细胞中标记的水平统计学上不同于(例如，少于或多于)其它细胞中(例如，非致瘤癌细胞或不是癌细胞的细胞)的水平，则分子区别存在于癌干细胞中。对于统计学显著性的普通检测包括T-检验，ANOVA，Kruska-Wallis，和Wilcoxon。
不同类型的癌症可以具有不同的癌干细胞标记。例如，膀胱癌干细胞标记包括CD44和CD47。乳腺癌干细胞标记包括醛脱氢酶I-A1(ALDH1A1)，ALDH1A3，BMI-1，CAIX，CD24，CD44，CD133，CXCR4，DLL4，EpCAM，ErbB2，ESA，GLI-1，GLI-2，IL-1α，IL-6Rα，CXCR1，整联蛋白α6，和PTEN。结肠癌干细胞标记包括ALDH1A1，CD44，CD166，DPPIV/CD26，EpCAM，GLI-1，和Musashi-1。胃癌干细胞标记包括CD44和DLL4。胶质瘤癌干细胞标记包括A20，ABCG2，CX3CL1，CX3CR1，CXCR4，HIF-2α，整联蛋白α6，L1CAM，Musashi-1，c-Myc，巢蛋白(Nestin)，Podoplanin，和IL6Rα。头和颈癌干细胞标记包括ABCG2，ALDH1A1，BMI-1和CD44。白血病癌干细胞标记包括BMI-1，CD34，CD38，CD44，CD47，CD96，GLI-1，GLI-2，IL-3Rα，MICL，Musashi-2，SCFR，和TIM-3。肝癌干细胞标记包括α-甲胎蛋白，氨基肽酶N，CD90，和NF2。肺癌干细胞标记包括ABCG2，ALDH1A1，CD90，EpCAM，和SCF R。黑色素瘤癌干细胞标记包括ABCB5，ABCG2，ALCAM，MS4A1，巢蛋白，和NGF R。骨髓瘤癌干细胞标记包括CD19，CD27，CD38，MS4A1，和黏结蛋白聚糖(Syndecan)。骨肉瘤癌干细胞标记包括ABCG2，巢蛋白，和STRO-1。卵巢癌干细胞标记包括α-甲酰基-CoA消旋酶，CD44，和SCFR。胰腺癌干细胞标记包括BMI-1CD24，CD44，CXCR4，和EpCAM。前列 腺癌干细胞标记包括ABCG2，α-甲酰基-CoA消旋酶，BMI-1，CD44和c-Myc。在某些优选的实施方案中，癌干细胞标记包括CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA和CD133。
“上皮-间充质转变”(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是特征在于丧失细胞粘着，抑制E-钙黏着蛋白表达，和增加的细胞运动性的过程。EMT促进CSC迁移和侵袭，使CSC能够扩散和转移。
“上皮-间充质转变生物标记”(EMT生物标记)或“EMT标记”指其水平在上皮-间充质转变过程中变化的分子(例如，基因，mRNA，或蛋白)。EMT标记可以是间充质标记或上皮标记。
“间充质生物标记”或“间充质标记”指与其它类型的细胞(例如，上皮细胞)相比区别存在于间充质细胞中的，并且其水平在EMT过程中增加的分子(例如，基因，mRNA，或蛋白)。优选的间充质标记包括平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Snail-2(slug)，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2，和p23。另外的间充质标记包括，twist，TGF-β1，骨桥蛋白(osteopontin)，I型胶原，基质金属蛋白酶(MMP)2，MMP-3，MMP-9和Sox10。“上皮生物标记”或“上皮标记”指与其它类型的细胞(例如，间充质细胞)相比区别存在于上皮细胞中，并且其水平在EMT过程中减少的分子(例如，基因，mRNA，或蛋白)。优选的上皮标记包括E-钙黏着蛋白和桥粒斑蛋白。另外的上皮标记包括β-联蛋白，细胞角蛋白，桥粒糖蛋白，桥粒核心糖蛋白，密蛋白和闭合蛋白。
“干性(Stemness)”是未特化的细胞自我更新为未特化的细胞但仍然保留特化能力的能力。
“干性生物标记”或“干性标记”指对于维持未特化细胞的干性所需的分子(例如，基因，mRNA，和蛋白)。
优选的干性标记包括Notch1和Jagged1。另外的干性标记包括Oct4，Sox2和Nanog。“mTOR复合物1”(mTORC1)是构成雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)两种明确的复合物中的一个。mTORC1由mTOR，Raptor，GβL(mLST8)，PRAS40和Deptor构成，并且由雷帕霉素部分抑制。mTORC1整合反映生长因子，营养物，或能量的有效性的多个信号以促进条件有利时的细胞生长或在应激过程中或条件不利时的分解代谢过程。生长因子和激素(例如，胰岛素)通过Akt对mTORC1传递信号，其使TSC2失活以阻止 mTORC1的抑制。备选地，低ATP水平导致TSC2的AMPK-依赖的激活以减少mTORC1信号转导。氨基酸有效性通过包括Rag蛋白的通路被信号传递到mTORC1。活化的mTORC1具有很多下游生物效应，包括通过磷酸化下游靶(4EBP1和p70S6激酶)的mRNA的翻译，抑制自吞噬，核糖体生物发生，和激活转录导致线粒体代谢或脂肪生成。
“mTORC1生物标记”或“mTORC1标记”是mTORC1信号转导通路的组分或编码所述组分的基因或mRNA。优选的mTORC1标记包括mTOR，Raptor，4EBP1，和TSC2。另外的mTORC1标记包括PRAS40，ATG13，和p70S6激酶(p70S6K)。“趋化因子”指能够在邻近的响应细胞中诱导定向趋化作用的小的细胞因子家族(由细胞分泌的和在细胞间通讯中使用的小的信号转导蛋白)。它们尺寸小(约8-10KD)并在对于形成其3维形状关键的保守位置具有2-6个半胱氨酸残基。
“趋化因子生物标记”或“趋化因子标记”指趋化因子或编码趋化因子基因或mRNA。优选的趋化因子标记包括RANTES(CCL5)，PIGF，G-CSF，CXCR3和CXCL10。另外的趋化因子标记包括CCR1，CCR2，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，CCR10，CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL6，CCL7，CCL8，CCL9(与CCL10相同)，CCL11，CCL12，CCL13，CCL14，CCL15，CCL16，CCL17，CCL18，CCL19，CCL20，CCL21，CCL22，CCL23，CCL24，CCL25，CCL26，CCL27，CCL28，CXCR1，CXCR2，CXCR4，CXCR5，CXCR6，CXCR7，CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL4，CXCL5，CXCL6，CXCL7，CXCL8，CXCL9，CXCL11，CXCL12，CXCL13，CXCL14，CXCL15，CXCL16，CXCL17，XCR1，XCL1，XCL2，CX3CR1和CX3CL1。
检测CSC的方法
在一个方面，本发明公开的内容提供使用不同类型标记的组合检测细胞群体中癌干细胞的存在的方法。所述方法包括(a)测量不同类型标记的水平，和(b)将此种水平与参考水平比较，从而确定细胞群体中癌干细胞的存在或缺失。如果与那些标记的对应的参考水平相比，癌干细胞标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和/或趋化因子标记的水平统计学上存在显著增加，和/或上皮标记水平统计学上存在显著减少，则检测出癌干细胞。
本文公开的可以用于所述方法的不同类型标记包括：(1)癌干细胞标记，(2)EMT标记，包括间充质标记和上皮标记，(3)干性标记，(4)mTORC1标记，和(5)趋化因子标记。
本发明公开的方法可以使用来自两种或更多种不同类型的标记的标记。优选地，所述方法使用来自三，四或五种本文提供的不同类型的标记的标记。
用于本发明公开的方法的标记的总数量可以是至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25种。
在某些实施方案中，用于本发明公开的方法的标记可以是至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25种选自由以下各项组成的组的标记：(1)癌干细胞标记：CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA，和CD133；(2)间充质标记：平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Smail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2，和p23；和上皮标记：E-钙黏着蛋白和桥粒斑蛋白；(3)干性标记：Notch1和Jagged1；(4)mTORC1标记：mTOR，Raptor，4EBP1，和TSC2；和(5)趋化因子标记：RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3，和CXCL10。
例如，所述方法可以使用至少3种不同标记，所述3种不同标记中每个是与另外2种标记类型不同的类型。所述方法可以使用至少4种不同标记，所述4种不同标记中每个是与另外3种标记类型不同的类型。所述方法可以使用至少5种不同标记，所述5种不同标记中每个是与另外4种标记类型不同的类型。优选地，所述标记选自由以下各项组成的组：(1)癌干细胞标记：CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA，和CD133；(2)间充质标记：平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Smail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2，和p23；和上皮标记：E-钙黏着蛋白和桥粒斑蛋白；(3)干性标记：Notch1和Jagged1；(4)mTORC1标记：mTOR，Raptor，4EBP1，和TSC2；和(5)趋化因子标记：RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3，和CXCL10。
根据本文公开的方法测量的标记水平可以是标记的表达水平或标记的修饰水平。所述表达水平可以是标记的基因转录表达水平或标记的蛋白表达水平。标记(蛋白)的修饰水平可以以标记(蛋白)的磷酸化，糖基化，亚硝基化，瓜氨酸化，或蛋白水解加工水平。
标记的基因转录表达水平是研究的细胞中编码标记(蛋白)的mRNA量。可以通过本领域已知的不同技术测量此种量，所述技术包括反转录PCR(RT-PCR)或实时RT-PCR，基于cDNA的阵列，寡核苷酸阵列，或RNA印迹杂交。在本发明公开实施例中也提供用于测量基因转录表达水平的示例性的技术。
标记的蛋白表达水平是研究的细胞中或由研究的细胞分泌的标记(蛋白)的量。可以通过测量受试者(研究的细胞获自所述受试者)血清中标记(蛋白)的量确定由研究的细胞分泌的标记(蛋白)的量。可以通过本领域已知的不同技术测量蛋白表达水平，所述技术包括蛋白质印迹分析，ELISA，免疫组织化学分析，和质谱分析。本发明公开的实施例中也提供用于测量蛋白表达水平的示例性技术。
标记的磷酸化水平是研究的细胞中标记(蛋白)被磷酸化的量，比率，或程度。可以通过本领域已知的不同技术测量此种水平，所述技术包括蛋白质印迹分析和电泳和P³²标记的蛋白的放射显影。本发明公开的实施例中也提供用于测量蛋白磷酸化水平的示例性技术。
本文公开的方法可以用于在怀疑含有癌细胞的任何细胞群体中检测CSC。此种细胞群可以是体外培养的细胞或可以来自从动物(例如，非人哺乳动物和人)取出或收集的生物样品，包括组织活检，穿刺活检，血液，淋巴，骨髓，等。在某些实施方案中，不同于癌症组织活检的样品(例如，血液或血清)可以获得自患有或怀疑患有癌症的受试者以确定一种或更多种分泌的趋化因子标记的水平。在某些优选的实施方案中，研究的细胞群体来自缺氧的肿瘤或恶性肿瘤，其一个或更多个部分在氧浓度比健康组织显著更低(例如，90-95％更低)的区域中。本文公开的方法可以用于检测不同类型的CSC，包括乳腺，膀胱，脑，结肠，胃部，肝，头和颈，肺，卵巢，骨肉瘤，胰腺，前列腺，肾，黑色素瘤和多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤CSC。因为不同类型的CSC可以具有不同CSC标记，选择合适的CSC标 记用于检测特定类型的CSC在普通技术内。上文提供了用于不同类型癌症的示例性的CSC标记。
测量研究的细胞的标记水平后，将这些水平与测量的每种标记的参考水平相比较。标记的参考水平可以是参考细胞中标记的水平，所述参考细胞比如正常细胞或致瘤癌细胞，优选来自相同的组织来源。正常细胞或非致瘤癌细胞可以来自相同的研究的细胞群体获自的受试者。备选地，这些细胞可以来自另一个受试者或受试者组。所述另一个受试者或受试者组优选与测试受试者共享一种或更多种癌症-相关的特征(例如，相同类型或亚型的癌症，相同或相似的肿瘤分级)。
细胞群体中CSC的存在可以通过确定各个测量的标记水平和各个标记的参考水平之间的差异检测。如果与相应的那些标记的参考水平比较，存在癌干细胞标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和/或趋化因子标记水平统计学上的显著增加，和/或统计学上的上皮标记水平显著减少，则在细胞群体中检测出癌干细胞。例如，在某些实施方案中，选自以下不同类型标记中的3种的3种标记用于检测CSC：(1)CSC标记，(2)间充质标记，(3)干性标记，(4)mTORC1标记，和(5)趋化因子标记。在此种实施方案中，全部3种测量的标记的水平如果存在统计学上的显著增加，则检测出CSC。在某些其它实施方案中，上皮标记和选自其它五种不同类型标记的2种的2种标记用于检测CSC。在此种实施方案中，如果存在上皮标记水平统计学上显著减少和另2种标记水平统计学上显著增加，则检测出CSC。
如果至少60％，70％，80％，或90％的测量的标记满足以下描述：(1)与其参考水平相比，CSC标记水平统计学上显著增加，(2)与其参考水平相比，间充质标记水平统计学上显著增加，(3)与其参考水平相比，干性标记水平统计学上显著增加，(4)与其参考水平相比，mTORC1标记水平统计学上显著增加，(5)与其参考水平相比，趋化因子标记水平统计学上显著增加，和(6)与其参考水平相比，上皮标记水平统计学上显著减少，则可以检测出CSC。例如，在某些实施方案中，5种测量的标记中的3或4种标记满足以上描述。
CSC的CSC标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和/或趋化 因子标记水平可以是参考细胞的那些标记水平的至少2X，至少3X，至少4X，或至少5X。CSC的上皮标记水平可以是参考细胞的该标记水平的至多50％，至多40％，至多30％，至多20％，至多10％，至多5％，或至多1％。
本文公开的方法还可以用于基于与其相应参考水平相比，CSC标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和/或趋化因子标记水平增加的量，和/或上皮标记水平减少的量，定量细胞群体中CSC量。
检测CSC的方法可以用于评估肿瘤转移的风险。例如，可以将测试细胞群体的CSC标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和/或趋化因子标记水平增加的量，和/或上皮标记水平减少的量与已知具有高，中或低转移潜力的细胞群体的那些相比较。备选地，可以将测试细胞群体的CSC标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，趋化因子标记，和/或上皮标记的水平直接与已知具有高，中或低转移潜力的细胞群体的那些相比较。此种比较有助于确定测试细胞群体获自的癌症的转移风险。例如，如果与已知具有中或低转移潜力的细胞群体相比，测试群体的标记水平更接近于已知具有高转移潜力的细胞群体，则所述测试群体可能是高度转移的。
“高转移潜力”指形成远端转移或转移到多个位点或器官的倾向。示例性的具有高转移潜力的细胞系是4T1细胞系。
“中转移潜力”指形成局部的、组织特异的或器官特异的转移的倾向。示例性的具有中转移潜力的细胞系是66c14细胞系。
“低转移潜力”指低转移倾向或无转移倾向。示例性的具有低转移潜力的细胞系是NR67细胞系。
检测CSC的存在的方法还可以用于癌症诊断或预后。例如，此种方法可以用于确定肿瘤分级或肿瘤亚型或预测肿瘤复发的可能性。此外，通过使用本文公开的方法在不同时间点检测和/或定量获自受试者的生物样品中的CSC，可以监控或预测受试者中癌症的疾病进程。
鉴定或证实药物候选物的方法
在另一个方面，本发明公开的内容提供鉴定或证实推定的癌症治疗剂的方法。所述方法包括(a)将癌细胞暴露于推定的癌症治疗剂以获得治疗的癌细胞，(b)测量不同类型标记的水平，和(c)将此种水平与参考水平相 比，从而鉴定或证实所述推定的癌症治疗剂。如果在将癌细胞暴露于所述推定的癌症治疗剂之后，当与那些标记的相应参考水平比较时，存在癌干细胞标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和/或趋化因子标记水平统计学上的显著减少，和/或上皮标记水平统计学上的显著增加，则鉴定或证实了推定的癌症治疗剂。
暴露于推定的癌症治疗剂的癌细胞可以是体外培养的癌细胞，比如源自癌细胞的细胞系的那些。优选的体外培养的癌细胞是能够形成肿瘤球的那些，比如鼠乳腺癌细胞系4T1的细胞。用于鉴定或证实癌症药物候选物的另外的癌症细胞系将包括小鼠乳腺癌细胞系66c14，和人细胞系MDA-MB-231，MDA-231LM2-4MDA-MB-468，HT29，HeLa，和A549。还可以使用过量表达CAIX的小鼠乳腺癌细胞(包括67NR/hCAIX细胞)。
可以通过任何用于将癌细胞与推定的癌症治疗剂接触的方法(包括在存在推定的癌症治疗剂的情况下培养或孵育细胞)进行将体外培养癌细胞暴露于推定的癌症治疗剂。在某些优选的实施方案中，在缺氧条件下培养细胞。如在本文使用的“缺氧，”指具有减少的氧含量(即，2％或更少的氧，比如1％的氧)的空气。
暴露于推定的癌症治疗剂的癌细胞可以是患有癌症的受试者(包括非人哺乳动物和人)的癌细胞。可以通过向癌细胞局部施用推定的治疗剂或向受试者全身施用推定的治疗剂进行将癌细胞暴露于推定的癌症治疗剂。
不同类型的标记，各个类型的示例性标记，标记的不同组合，测量上文描述的标记的不同水平的技术连同检测CSC存在的方法也可应用于鉴定或证实推定的癌症治疗剂的方法。
测量用推定的癌症治疗剂治疗的细胞的标记水平之后，将这些水平与测量的各个标记的参考水平相比较。对于体外培养的癌细胞，标记的参考水平可以是与治疗的癌细胞相同细胞系的未治疗的培养的癌细胞的标记水平。例如，未用推定的癌症治疗剂治疗的培养的4T1细胞的特定标记(例如，EpCAM)的水平可以用作参考水平以与用推定的癌症治疗剂治疗后的培养的4T1细胞的该特定标记的水平相比较。
对于来自患有癌症的受试者的癌细胞，标记的参考水平可以是来自与治疗的癌细胞相同的但在用推定的癌症治疗剂治疗受试者之前获得的癌 症组织的癌细胞的标记水平。例如，来自用推定的癌症治疗剂治疗之前的患者的乳腺癌细胞的特定标记(例如，EpCAM)的水平可以用作参考水平以与来自在患者已经用推定的癌症治疗剂治疗之后的相同患者的乳腺癌细胞的该特定标记的水平相比较。
备选地，标记的参考水平可以是来自与治疗的癌细胞相同的组织类型，但获自未用推定的癌症治疗剂治疗的另一个受试者或受试者组的癌细胞的标记水平。优选地，所述另一受试者或受试者组共享如用推定的癌症治疗剂治疗的受试者的一种或更多种常见的癌症相关特征(例如，相同类型或亚型的癌症，相同或相似的肿瘤分级)。
可以通过确定测量的各个标记的水平和各个标记的参考水平之间的差异鉴定或证实推定的癌症治疗剂。当与那些标记的相应参考水平(例如，未用推定的癌症治疗剂治疗或用推定的癌症治疗剂治疗前的癌细胞的水平)比较时，如果存在用推定的癌症治疗剂治疗的细胞的癌干细胞标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和/或趋化因子标记水平统计学上的显著减少，和/或上皮标记水平统计学上的显著增加，可以鉴定或证实推定的癌症治疗剂。例如，在某些实施方案中，选自以下不同类型标记中的3种的3种标记：(1)CSC标记，(2)间充质标记，(3)干性标记，(4)mTORC1标记，和(5)趋化因子标记用于检测CSC。在此种实施方案中，用推定的癌症治疗剂治疗的癌细胞中/的测量的全部3种标记的水平如果存在统计学上的显著增加，可以鉴定或证实推定的癌症治疗剂。在某些其它实施方案中，上皮标记和选自其它五种不同类型的标记中的2种的2种标记用于鉴定或证实推定的癌症治疗剂。在此种实施方案中，如果存在用推定的癌症治疗剂治疗的癌细胞中/的上皮标记水平统计学上的显著增加和其它2种标记水平统计学上的显著减少，则鉴定或证实了推定的癌症治疗剂。
如果测量的标记中至少60％，70％，80％，或90％满足一下描述：(1)与其参考水平相比，CSC标记的水平统计学上显著减少，(2)与其参考水平相比，间充质标记水平统计学上显著减少，(3)与其参考水平相比，干性标记水平统计学上显著减少，(4)与其参考水平相比，mTORC1标记水平统计学上显著减少，(5)与其参考水平相比，趋化因子标记水平统计学上显著减少，和(6)与其参考水平相比，上皮标记水平统计学上显著增加，可以鉴 定或证实推定的癌症治疗剂。例如，在某些实施方案中，5种测量的标记中的3或4种标记满足以上描述。
用鉴定或证实的癌症治疗剂治疗的癌细胞的CSC标记，间充质标记，干性标记，mTORC1标记，和/或趋化因子标记的水平可以是相同组织来源的未用癌症治疗剂治疗的癌细胞的水平的至多50％，至多40％，至多30％，至多20％，至多10％，至多5％，或至多1％。用鉴定或证实的癌症治疗剂治疗的癌细胞的上皮标记水平可以是相同组织来源的未用癌症治疗剂治疗的癌细胞的水平的至少2X，至少3X，至少4X，或至少5X。
本文公开的方法可以用于鉴定或证实任何推定的癌症治疗剂。示例性的推定的癌症治疗剂包括小分子，抗体，其抗原-结合片段，多肽，肽，激素，和核酸(例如，反义多核苷酸和短干扰RNAs包括siRNA，miRNA，和shRNA)。可以从化合物，组合物，或分子文库或集合中鉴定可能的治疗剂。
如本文公开的，本发明公开的内容部分基于本发明人的以下发现：CAIX是表达上皮-间充质转变(EMT)标记和调节剂，表达干性标记，和在缺氧条件下癌干细胞扩张(expand)所需的，是mTORC1信号转导通路的上游，并且也是在缺氧条件下由癌干细胞分泌趋化因子必需的。因此，本文公开的标记尤其用于鉴定或证实CAIX抑制剂为癌症治疗剂。
可以被鉴定为癌症治疗剂的CAIX抑制剂包括干扰，降低或消除CAIX基因表达的CAIX-特异抗体，CAIX-特异抗体的抗原-结合片段，包括CAIX-特异抗体的抗原-结合片段的融合蛋白，小分子CAIX抑制剂，反义多核苷酸和短干扰RNAs(例如，siRNA，miRNA，和shRNA)。示例性的小分子CAIX抑制剂包括在WO 2012/021963和PCT申请PCT/IB2011/055312中公开的那些。
在一个相关的方面，鉴定或证实本文公开的推定的癌症治疗剂的方法还可以用于评价癌症治疗方案的效力。通过在治疗方案过程中或治疗后监控来自如本文公开的患者的癌细胞的生物标记水平的改变，人们可以确定所述癌症治疗方案在特定患者中是否有效。此种确定可以随后指导对是否继续所述治疗方案或重复所述治疗方案的决定。
治疗癌症的方法
在另一个方面，本发明公开的内容提供治疗癌症的方法，所述方法包 括(a)使用本文公开的生物标记和方法检测来自患者的癌症样品中CSC的存在，和(b)如果在所述癌症样品中检测出CSC，向患者施用有效量的CAIX抑制剂。
在一个相关的方面，本发明公开的内容提供治疗癌症的方法，所述方法包括向癌症患者施用有效量的CAIX抑制剂，所述癌症患者使用本文公开的生物标记和方法诊断被诊断为含有CSC。
如医学领域熟练技术人员理解的，术语，“治疗(treat)”和“治疗(treatment)，”指受试者(即，患者)的疾病，病症，或病状的医学处理(参见，例如，Stedman’s Medical Dictionary).“治疗癌症”指降低癌症症状的数量，减少一种或更多种症状的严重度，或延迟癌症进程。
可以使用本文公开的方法治疗的癌症患者可以是经历了除使用CAIX抑制剂的治疗外的癌症治疗，但癌症治疗尚未消除患者中所有癌干细胞的患者。用特异定向到CSC的CAIX抑制剂治疗此种患者，将更有效并阻止或减少癌症复发或转移的风险。
可以使用CAIX抑制剂治疗的可使用本文公开的生物标记和方法检测其CSC的任何类型的癌症，包括，乳腺癌，膀胱癌，脑癌，结肠癌，胃癌，肝癌，头和颈癌症，肺癌，卵巢癌症，骨肉瘤，胰腺癌，前列腺癌，肾癌，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，白血病，和淋巴瘤。
可以被鉴定为癌症治疗剂的CAIX抑制剂包括CAIX-特异抗体，CAIX-特异抗体的抗原-结合片段，包括干扰，降低或消除CAIX基因表达的CAIX-特异抗体的抗原-结合片段的融合蛋白，小分子CAIX抑制剂，反义多核苷酸和短干扰RNAs(例如，siRNA，miRNA，和shRNA)。示例性的小分子CAIX抑制剂包括在WO 2012/021963和PCT申请PCT/IB2011/055312中公开的那些。美国专利7,378,091中公开了靶向CAIX的示例性的单克隆和多克隆抗体。另外的示例性CAIX抑制剂包括美国专利申请2004/0146955和2008/0095707中公开的那些。在本发明公开实施例中也公开了某些示例性的CAIX抑制剂。
可以口服，局部，经皮，肠胃外，通过吸入喷雾，阴道，直肠，或通过颅内注射，或其任何组合施用CAIX抑制剂或包含CAIX抑制剂药物组合物。在一些实施方案中，包含CAIX抑制剂的CAIX抑制剂或药物组合 物肠胃外施用，比如通过皮下，静脉内，肌肉内，或脑池内注射，或通过融合技术。
将CAIX抑制剂或包含CAIX抑制剂的药物组合物以治疗有效剂量施用于根据本文公开的方法被诊断为含有CSC的患者。特定治疗剂的“治疗有效剂量”指所述药剂足以以统计学上显著的方式导致降低癌症的一种或更多种症状，消除或延迟癌症的一种或更多种症状的开始或复发的那个量。可以根据包括特定治疗剂或药物组合物，给药途径，受试者的状况(即，疾病的阶段，由所述疾病引起的症状的严重度，一般健康状况以及年龄，性别，重量)的不同因素和其它对于医学领域熟练技术人员显而易见的因素确定和调整此种剂量。相似地，可以根据医学领域熟练技术人员知晓的参数确定用于治疗疾病或病症的治疗剂的剂量。通常可以使用实验模型和/或临床试验确定最优的剂量。CAIX抑制剂的最优剂量可以依赖于受试者的体重，重量或血液量。例如，可以施用0.01mg/kg和1000mg/kg之间的量(例如，约0.1至1mg/kg，约1至10mg/kg，约10至50mg/kg，约50至100mg/kg，约100至500mg/kg，或约500至1000mg/kg)体重(可以以单个剂量每日，每周，每月或以任何合适的间隔施用)的CAIX抑制剂。
还考虑的是与用于治疗癌症的第二药剂联合施用CAIX抑制剂或包含CAIX抑制剂药物组合物。示例性的第二药剂包括生物剂(例如，抗-EGFR抗体)，化疗剂(例如，紫杉烷(taxane)，铂类药物，氟嘧啶，环磷酰胺，烷化剂，有丝分裂抑制剂，抗生素，抗代谢物，和抗血管生成剂)，和放疗剂。在一个优选的实施方案中，所述第二癌症治疗剂是紫杉醇。
在某些实施方案中，可以在相同的制剂中同时施用CAIX抑制剂和第二癌症治疗剂。备选地，可以以分开的制剂但同时施用第二癌症治疗剂(即，彼此间少于一小时内给药)。
在某些实施方案中，可以在施用CAIX抑制剂之前施用第二癌症治疗剂(即，用CAIX抑制剂治疗前至少一小时)。还考虑的是可以在施用CAIX抑制剂之后施用第二癌症治疗剂(即，施用CAIX抑制剂后至少一小时)。
试剂盒
在一个方面，本发明公开的内容提供试剂盒，所述试剂盒包含对本文公开的生物标记具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含对于以下不同类型标记中的2，3，4，或5种具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子：(1)癌干细胞标记，(2)EMT标记，包括间充质标记和上皮标记，(3)干性标记，(4)mTORC1标记，和(5)趋化因子标记。优选地，所述试剂盒包含对本文提供的标记中的3，4，或5种不同类型具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子。
具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子针对的，在本发明公开的试剂盒中包括的标记的总数量可以是至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25种。
在某些实施方案中，具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子针对的，本发明公开的试剂盒中包括的标记可以是选自由以下各项组成的组的至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25种标记：(1)癌干细胞标记：CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA，和CD133；(2)间充质标记：平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Smail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2，和p23；和上皮标记：E-钙黏着蛋白和桥粒斑蛋白；(3)干性标记：Notch1和Jagged1；(4)mTORC1标记：mTOR，Raptor，4EBP1，和TSC2；和(5)趋化因子标记：RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3，和CXCL10。
例如，所述试剂盒可以包含对至少3种不同标记(其中每种是与另外2种标记类型不同的类型)具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子。所述试剂盒可以包含对至少4种不同标记(其中每种是与另外3种标记类型不同的类型)具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子。所述试剂盒可以包含对至少5种不同标记(其中每种是与另外4种标记类型不同的类型)具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子。优选地，所述标记是选自由以下各项组成的组：(1)癌干细胞标记：CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA，和CD133；(2)间充质标记：平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Smail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2，和p23；和上皮标记：E-钙黏着蛋白和桥粒斑蛋白；(3)干性 标记：Notch1和Jagged1；(4)mTORC1标记：mTOR，Raptor，4EBP1，和TSC2；和(5)趋化因子标记：RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3，和CXCL10。
“特异性结合”或“特异结合”指识别和结合研究的生物标记蛋白但基本上不结合和识别含有研究的生物标记蛋白的样品中的其它分子的化合物，抗体，或抗体的抗原-结合片段。
在某些实施方案中，所述试剂盒包括阵列或微阵列，所述蛋白结合分子附着于所述阵列或微阵列。
“阵列”指试剂(例如，蛋白，抗体，核酸，或寡核苷酸)以位置上清楚的定位在基底上的排列。在一些情况下，将阵列上的试剂在空间上编码，从而从其在阵列上的定位可以确定试剂的特性。“微阵列”通常指其中检测需要使用显微检测以检测在基底上以试剂形成的复合物的阵列。在阵列上的“定位”指包含试剂的阵列表面的局部区域，每个被限定从而能够将其与邻近的定位相区分。典型地，各个定位包括单个类型的试剂，但这不是必需的。
在一个相关的方面，本发明公开的内容提供试剂盒，所述试剂盒包含对本文公开的生物标记特异的寡核苷酸引物和/或探针。
如果其特异杂交于生物标记核酸或其互补序列，而基本上不杂交含有生物标记核酸的样品中的其它核酸，则寡核苷酸引物或探针对生物标记核酸特异。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含以下不同类型标记中的2，3，4，或5种的寡核苷酸引物或探针：(1)癌干细胞标记，(2)EMT标记，包括间充质标记和上皮标记，(3)干性标记，(4)mTORC1标记，和(5)趋化因子标记。优选地，所述试剂盒包含对本文提供的标记中的3，4，或5种不同类型具有特异性结合亲和力的蛋白结合分子。
寡核苷酸引物和/或探针针对的，在本发明公开的试剂盒中包含的标记的总数量可以是至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25种。
在某些实施方案中，寡核苷酸引物和/或探针针对的，在本发明公开的 试剂盒中包含的标记可以是选自由以下各项组成的组的至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25种标记：(1)癌干细胞标记：CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA，和CD133；(2)间充质标记：平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Smail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2，和p23；和上皮标记：E-钙黏着蛋白和桥粒斑蛋白；(3)干性标记：Notch1和Jagged1；(4)mTORC1标记：mTOR，Raptor，4EBP1，和TSC2；和(5)趋化因子标记：RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3，和CXCL10。
例如，所述试剂盒可以包含针对至少3种不同标记(其中每种是与另外2种标记类型不同的类型)的寡核苷酸引物和/或探针。所述试剂盒可以包含针对至少4种不同标记(其中每种是与另外3种标记类型不同的类型)的寡核苷酸引物和/或探针。所述试剂盒可以包含针对至少5种不同标记(其中每种是与另外4种标记类型不同的类型)的寡核苷酸引物和/或探针。优选地，所述标记选自由以下各项组成的组：(1)癌干细胞标记：CAIX，EpCAM，ALDH1A3，CD44，ESA，和CD133；(2)间充质标记；平滑肌肌动蛋白，Snail-1，Smail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，FoxC2，和p23；和上皮标记：E-钙黏着蛋白和桥粒斑蛋白；(3)干性标记：Notch1和Jagged1；(4)mTORC1标记：mTOR，Raptor，4EBP1，和TSC2；和(5)趋化因子标记：RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3，和CXCL10。
在某些实施方案中，所述试剂盒包括阵列或微阵列，寡核苷酸探针附着于该阵列或微阵列。
本文提供的试剂盒可以用于检测或定量生物样品中生物标记的水平。例如，包含蛋白结合分子的试剂盒可以用于测量生物标记的蛋白表达水平。包含生物标记-特异的引物或探针的试剂盒可以用于测量生物标记的基因转录表达水平。
以下实施例用于说明并不限制。
实施例
缩写：
CA(碳酸酐酶)；TS(肿瘤球)；NS(非沉默)；EMT(上皮到间充质转变)； FACS(荧光激活细胞淘选)；EpCAM(上皮细胞粘附分子)；RNAi(RNA干扰)；shRNA(小发夹RNA)；shNS(小发夹非沉默序列)；shCAIX(小发夹CAIX特异序列)；IF(免疫荧光)
材料和方法
1.细胞培养
已经描述了表达荧光素酶的小鼠乳腺癌细胞系4T1的获得，产生和培养(Lou，Preobrazhenska等人2008)。MDA-MB-231LM2-4Luc+细胞系由Robert Kerbel博士(多伦多大学，加拿大)慷慨提供并且如之前描述的培养细胞(Ebos，Lee等人2009)。将所有细胞在37℃以5％CO₂在潮湿的温箱中孵育(“常氧”)。
对于在缺氧条件下的培养，在密封的厌氧工作站中，将细胞在潮湿的温箱中维持在用N2平衡的1％O₂和5％CO₂，37℃。如之前描述的(Lou，McDonald等人2011)进行4T1细胞中鼠CAIX的稳定消耗。
2.肿瘤球培养
将培养的4T1细胞在含有5％胎牛血清(FBS)(Sigma)DMEM(Gibco)中以每周两次传代培养为单层。随后，将亲代，shNS和shCAIX4T1在Mammocult^TM培养基(StemCell Technologies，Vancouver，B.C.，Canada)中按照制造商的使用说明(Lock，McDonald等人2012)培养为肿瘤球(TSs)。备选地，为了旋转培养TS生长，如之前描述的，将单层细胞用胰蛋白酶消化并且将单细胞悬液以2X10⁵至4X10⁵细胞/ml在密封的玻璃旋转(spinner)培养瓶(Bellco，Vineland，NJ)中在150RPM持续旋转条件下，在预平衡于5％CO₂的DMEM(5％FBS)中37℃孵育(Oloumi，MacPhail等人2000)。培养物生长达3周。每3天补充培养基。对于缺氧条件，将旋转瓶用以N2平衡的5％O₂和5％CO₂持续通气3天。
3.抗体
FACS抗体：人EpCAM(CD326)-AlexaFluor647^TM(Biolegend，SanDiego，CA)；小鼠-CD24-APC(Biolegend)；小鼠/人-CD44-PeCy7(eBioscience，San Diego，CA)。
IHC抗体：人CAIX(R&D systems AF2188)；ALDH1A3(#LS-C97464，Lifespan Biosciences).
IF抗体：CD133-FITC(eBioscience，San Diego，CA)；E-钙黏着蛋白(BD Transduction labs#610181)，小鼠CAIX(R&D systems AF2344)；平滑肌肌动蛋白(Sigma)；Snail(AbCam#ab17732)；
4.流式细胞术分析和分离
将4T1TSs与胰蛋白酶孵育，在HF缓冲液(含有2％胎牛血清的HBSS)中洗涤一次，随后以抗-CD24-APC和抗-CD44-PECy7使用每100ul HF中的106细胞0.3μl抗体染色，并在冰上孵育10分钟。孵育之后，用HF缓冲液洗涤细胞并重悬于含有4′，6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI；终浓度，1μg/ml)的300ul HF缓冲液中。在Aria^TM细胞分选仪(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)上分离细胞。根据向前和侧面的散布给活细胞设门(gate)，并且根据向前的散布和脉冲宽度给单个细胞设门。通过分析未染色的细胞，同型特异对照，和单染确定门。由于获得细胞的低数量，未评估CD44+CD24-/低或CD44+CD24+细胞的纯度。使用流式细胞术的细胞计数器确定细胞数量。将细胞收集在DMEM培养及或HF缓冲液中。
对于体内小鼠肿瘤分析，用刀片精细地切碎切除的肿瘤，含有10％胶原酶/透明质酸酶混合物的DMEM中在37℃消化1.5h，接着继续用胰蛋白酶-EDTA，分散酶和氯化铵处理(来自Stem Cell Technologies的试剂，根据制造商的使用说明)。在标准组织培养盘上，在DMEM+10％FBS中过夜培养细胞。对于FACS分析，将铺好细胞的孔与胰蛋白酶孵育并重悬于HBSS+2％FBS中。将细胞用小鼠Fc block(#553142，BD Pharmingen)封闭。如上文进行抗体染色和细胞淘选。
5.免疫荧光
如之前描述的，固定，透化和免疫染色培养在玻璃盖玻片上的4T1细胞(Turner，Broad等人2006)。收集亲代4T1旋转培养物TSs，和并悬于干冰上的OCT冷冻培养基。一旦冷冻，使用Cryostar^TM HM560恒冷器(Microm International，GmbH，Walldorf，Germany)制备5至7μm切片。将冷冻切片空气干燥30秒并转移至4％多聚甲醛固定20分钟，在PBS中洗涤三次(5分钟)并在0.2％triton-X-100中透化(10分钟)。随后的免疫染色步骤在之前描述(Lock和Hotchin2009)。
6.RNA提取和定量PCR
将FACS淘选的细胞培养72小时并在缺氧条件下裂解。使用QIAGEN RNAeasy^TM微量试剂盒(Toronto，Ontario，Canada)根据制造商的使用说明进行mRNA提取。使用PreAMP RT²小鼠上皮到间充质转变(EMT)PCR阵列(PAMM-090，Qiagen)，以5至10ng RNA起始物质，在Applied Biosystems(Foster City，CA，USA)7900HT分析仪上进行定量PCR。使用标准2-ΔΔct方法计算基因表达的相对倍数变化(Livak和Schmittgen2001)。
7.药理学抑制剂
对于体内研究，将CAIX特异的抑制剂CAI017(Supuran2008)，

MST-104，专利的脲基磺胺，具有以下结构：

和MST-205，专利的糖基化的香豆素4-甲基伞形-7-基-β-L-鼠李吡喃糖苷，具有以下结构：

溶解并如之前描述的施用(Lou，McDonald等人2011，Supuran2008)。对于体外研究，将CAI017以200mM无载体直接加入TS培养基。将MST-104溶解于DMSO中并以50μM以加入载体对照的相同量的DMSO加入培养基。
8.小鼠肿瘤模型
依照由在BC癌症研究中心(BC Cancer Research Centre)的机构动物 护理委员会(Institution Animal Care Committee)和不列颠哥伦比亚大学(University of British Columbia)(Vancouver，BC，Canada)认可的方案进行所有动物程序和研究。对于原发性乳腺肿瘤异种移植物，如之前描述的，将2x10⁶MDA-MB-231LM2-4Luc+变体细胞悬于50％Matrigel^TM/PBS溶液并同位移植于6-8周-大的雌性NOD.CB17-prkdcscid/J小鼠(Lou，McDonald等人2011)。当肿瘤达到200mm³时起始治疗。使用修饰的椭球公式(LxW2)/2从卡尺测量值计算原发性肿瘤生长率。如之前描述的，使用生物发光成像监控和定量肿瘤形成和转移进展(Lou，McDonald等人2011)。
9.免疫组织化学
收获肿瘤，石蜡包埋并对CAIX染色肿瘤切片(Santa CruzBiotechnology)，如之前描述的(Lou，McDonald等人2011)。
10.统计
使用GraphPad^TM软件进行双尾T-检验和描述统计。除非另有陈述，误差线表示最少三次独立实验的SEM。
11.用于分析趋化因子mRNA水平的RNA提取
接种4T1-shNS和4T1-shCAIX细胞以在次日达到80％汇合。将细胞用PBS洗涤两次，然后向细胞加入无血清培养基。将细胞在21％或1％O₂中孵育24h，之后移除培养基并在其各自的O₂压力中裂解细胞。使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN，Toronto，Ontario，Canada)根据制造商的使用说明从溶胞产物中提取mRNA。通过Nanodrop确定RNA量并且通过在2％琼脂糖凝胶上的电泳确定完整性。
12.用于趋化因子mRNA分析的cDNA制备和定量实时PCR
使用Superscript III第一链合成试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，California，USA)将来自各个样品的500ng总RNA用于制备cDNA。使用在Applied Biosystems7900HT(Foster City，California，USA)上的FASTSYBR Green Master混合物实时qPCR进行DNA扩增。使用公式q＝E^-C_T进行个别基因水平的定量，其中E表示引物效率并且C_T阈值循环(Rebollo，Miceli-Royer等人2012)。
13.条件培养基回收
如上文描述的培养4T1-shNS和4T1-shCAIX细胞。在其各自的O₂压力中24h后，收集培养基并通过在4℃1500rpm离心5分钟澄清。通过0.2μm注射器式滤器过滤培养基并储存在-80℃。
14.ELISA
使用小鼠特异的CXCL10和G-CSFELISA试剂盒(Rand D Systems，Minneapolis，Minnesota，USA)根据制造商的使用说明评估来自条件培养基的分泌的趋化因子水平。基于总蛋白水平标准化条件培养基。
实施例1
对于乳腺癌干细胞的特性，需要CAIX表达
已经证明以非粘着肿瘤球在无血清条件下在悬液中的体外增殖是乳腺癌干细胞的特性(Ponti，Costa等人2005)。
RNAi非沉默对照(4T1-shNS)相比，使用RNA干扰(RNAi)稳定敲减(knock down)4T1小鼠乳腺癌细胞系(4T1-shCAIX)中的CAIX表达(参见图1)。将4T1细胞接种为单个细胞并在限定的无血清培养基中使用超低粘性平板培养为非粘着肿瘤球(TS)(图2)。已显示这些TS-形成条件促进癌干细胞生长(Yip，Fombon等人2011，Stingl，Eaves等人2001，Dontu，Abdallah等人2003)。以双倍稀释接种4T1-shNS和4T1-shCAIX细胞的单细胞悬液并在TS-形成条件下在常氧条件下(20％氧)或缺氧(1％氧)培养7天。
评估TS-形成能力为对于阳性TS生长所需细胞的最小数量。在常氧条件下观察到shNS-4T1和shCAIX-4T1之间形成TSs所需细胞的数量无显著差异)。在缺氧条件下，形成TSs所需4T1-shNS细胞的数量显著降低(图3)。然而，RNAi-介导的CAIX表达的敲减显著增加在缺氧条件下形成TS所需的接种细胞数量，提示对于在对照细胞中观察到的CSC在缺氧条件下的扩张，需要CAIX表达(Lock，McDonald等人2012)。
CD44+CD24-/低细胞的识别标志先前被描述为乳腺癌干细胞群体(Ponti，Costa等人2005，Al-Hajj，Wicha等人2003)并与人患者中的高风险肿瘤特征和骨髓转移相关(Reuben，Lee等人2011)。
为了进一步评估CAIX在维持缺氧的乳腺癌干细胞体外微环境中的作 用，在常氧或缺氧条件下将shNS-4T1和shCAIX-4T1在TS形成条件下培养，并使用FACS定量标记为CD44+CD24-/低的CSC群体(图4和5)。在shNS对照中，与常氧对照相比，CD44+CD24-/低群体在缺氧培养条件下增加。然而，RNAi-介导的CAIX敲减在缺氧条件下显著减少该群体(图5)。这些数据这些细胞中在TS-形成能力方面注意到的差异相关(图3)。
实施例2
CAIX抑制剂能够减少癌细胞中干细胞行为
为了验证这些数据，良好表征的CAIX小分子抑制剂，CAI017，用于抑制亲代4T1细胞系中的CAIX活性(Lou，McDonald等人2011，Supuran2008)。使用实施例1中描述的相同的实验方法，将亲代4T1的单细胞悬液以双倍稀释接种于限定的无血清培养基，并加入CAI17或载体，并且在常氧或缺氧条件下培养为非粘着TSs达7天。再次，与常氧对照相比，形成TSs所需亲代4T1细胞的数量在缺氧条件下显著降低，并且抑制CAIX活性显著增加在缺氧条件下形成TS所需的接种细胞的数量，提示单独的CAIX活性可以调节该细胞系中类癌干细胞群体(图6)。
为了通过FACS定量的CD44+CD24-/低CSC群体证实“干性”性质，将TS培养的4T1shNS和shCAIX细胞进行FACS并收集CD44+CD24-/低和对照CD44-CD24+群体并且在缺氧条件下在TS培养条件以双倍稀释接种。7天后，记录形成TS所需细胞的数量，并将TSs在缺氧条件下系列传代。将TS形成部分计算为(1÷形成TS所需细胞的数量)。当未观察到TS形成时，这给出0值。如在(图7)中显示的，在每个实验中，能存活的shNS CD44+CD24-细胞从相对低的细胞数量形成TSs，并强劲生长。能存活的shCAIX CD44+CD24-细胞常未能形成TSs。当观察到TS形成时的情况下，这需要比shNS CD44+CD24-/低的群体显著更高数量的细胞(图7)。能存活的对照非CSC群体，shNS CD44-CD24+和shCAIXCD44-CD24+，显示相似地欠佳的TS形成部分。当使TS经历系列传代和随后的缺氧TS培养条件时，shNS CD44+CD24-TS在传代中良好存活，高达第7代(当培养结束时)，指示该群体中的干性。在shCAIXCD44+CD24-/低的群体中观察到TS生长时的情况下，该特性未挺过第1代。来自两种细胞系之一的对照CD44-CD24+群体相似地不能传代超过1 代。这些数据提示CAIX消除的CD44+CD24-低的细胞尽管表达CD44+CD24-/低的识别标志，但不显示与体外干性相关特性(Lock，McDonald等人2012)。
表1 对于在缺氧条件下4T1CD44+CD24-/低的肿瘤球-形成能力，需要CAIX表达

对于表1数据，将4T1shNS和shCAIX细胞在缺氧条件下培养为TSs，解聚，对CD44和CD24染色，并通过FACS收集。收集CD44+CD24-/低或CD44-CD24+对照细胞并在缺氧条件下在肿瘤球-形成条件下以双倍稀释接种并且记录肿瘤球形成效率。
实施例3
在常氧和缺氧条件下观察亲代4T1CD44+CD24-/低CSC的间充质表型
在常氧和缺氧条件下，将亲代4T1细胞在肿瘤球(TS)形成条件下培养。7天后，将TSs收集，分离，并对CD44和CD24细胞染色。在常氧或缺氧条件下将CD44+CD24-/低的细胞或对照CD44+CD24+群体在玻璃盖玻片上培养3天，随后固定并对CAIX(图9)或EMT标记(图8，9和10)免疫染色(Lock，McDonald等人2012)。在CD44+CD24-/低和CD44+CD24+对照两个群体中CAIX的表达在缺氧培养物中上调。在常氧培养物中未观察到显著CAIX染色(图9)。然而，在常氧和缺氧条件下，在CD44+CD24+ 对照群体中的细胞边界观察到显著的E-钙黏着蛋白表达，在常氧和缺氧条件下，在CD44+CD24-/低的细胞中显著观察到上皮标记E-钙黏着蛋白表达的丧失(图10)。通过观察到的，与CD44-CD24+对照群体中可忽略的染色相比，CD44+CD24-/低的4T1细胞中间充质标记平滑肌肌动蛋白的上调验证CD44+CD24-/低的间充质表型的进一步证据(图11)。对Snail的免疫荧光染色也证明与对照CD44+CD24+群体中较少的染色相比，常氧和缺氧的CD44+CD24-/低的群体中该EMT调节剂的上调(图12)。
体外验证了这些数据。将亲代4T1鼠乳腺癌细胞在持续旋转下培养3周为TSs。当TSs达到约150μm宽时，将培养物分散并进一步在常氧或缺氧下培养3天。冷冻TSs，切片并进行免疫染色以评估CAIX和癌干细胞标记CD133的表达。结果显示，与常氧对照相比，在缺氧条件的TSs中CDl33表达上调。这些细胞中CAIX表达也上调。
为了评估在缺氧条件下为TSs的4T1培养物的上皮表型，对切片的上皮标记E-钙黏着蛋白和CAIX共染色(图13)。在常氧条件的肿瘤球(这些细胞中几乎没有CAIX表达)中观察细胞边界的E-钙黏着蛋白表达。在缺氧条件下培养的肿瘤球中E-钙黏着蛋白表达下调，伴随有增加的CAIX表达。还评估了这些肿瘤球中间充质标记平滑肌肌动蛋白和EMT调节剂Snail的表达。与常氧对照相比，在缺氧条件下，平滑肌肌动蛋白表达以及CAIX表达上调(图14)。与常氧对照相比，在缺氧条件下，Snail和CAIX表达增加(图15)。总之，这些数据支持，在亲代4T1小鼠乳腺癌细胞中，缺氧肿瘤球培养引起CAIX表达，其与癌干细胞标记表达和EMT表型相关。这些数据证实在该细胞系中缺氧诱导EMT和维持干细胞表型。
实施例4
对于在缺氧条件下4T1CD44+CD24-/低的细胞的间充质和“干性”表型，需要CAIX。
通过评估EMT表型进一步分析在维持癌细胞的CSC“干性”方面对CAIX表达的需要。将shNS和shCAIX4T1细胞在缺氧条件下培养7天，分离，并通过FACS收集CD44+CD24-/低的和对照群体。在缺氧条件下，将细胞在玻璃盖玻片下培养3天，固定，并通过IF评估(Lock，McDonald等人2012)。与对照相比，shNS CD44+CD24-/低的细胞中上皮标记E-钙 黏着蛋白的表达显著减少(图16)，提示shNS CD44+CD24-/低的细胞经历EMT，类似于4T1亲代CD44+CD24-/低的群体。相比之下，与shCAIXCD44+CD24+对照细胞相比，shCAIX CD44+CD24-/低的细胞继续表达E-钙黏着蛋白(图16)。
还评估间充质标记平滑肌肌动蛋白的表达。与在shNS CD44+CD24+对照细胞中几乎观察不到染色相比，shNS CD44+CD24-/低的细胞显示对平滑肌肌动蛋白强烈的染色。相比之下，在CAIX消耗之后，shCAIXCD44+CD24-/低的细胞显示非常低水平的平滑肌肌动蛋白表达，类似于shCAIX CD44+CD24+对照(图17)。为了证实这些数据，还通过IF评估EMT调节剂Snail的表达。与shCAIX CD44+CD24-/低的细胞和对照相比，在shNS CD44+CD24-/低的细胞中Snail表达上调(图18)。
将能存活的，FACS淘选的细胞在缺氧条件下培养3天。提取RNA，并使用定量PCR评估靶基因的相对基因转录水平(Lock，McDonald等人2012)。与在shCAIX CD44+CD24-/低的细胞中未观察到显著减少的对照相比，在shNS CD44+CD24-/低的细胞中观察到上皮标记桥粒斑蛋白的转录平均减少3.5倍(图19)。在E-钙黏着蛋白转录中也观察到相似的模式(数据未显示)。与在shCAIX CD44+CD24-/低的细胞中无差异的对照相比，在shNS CD44+CD24-/低的细胞中观察到增加的间充质标记波形蛋白(Vimentin)的转录(数据未显示)。这些在EMT-靶基因转录中的差异证明，在缺氧条件下在表达CAIX的shNS CD44+CD24-/低的细胞中观察到的验证的EMT表型相比，CAIX消耗维持CD44+CD24-/低的群体的上皮表型。
与对照相比，在shNS CD44+CD24-/低的细胞中观察到EMT调节剂Snaill(Snail)(45.8倍)(Cano，Perez-Moreno等人2000)和Wnt5b(11.57倍)(Yook，Li等人2005，Malizia，Lacey等人2009)的转录的显著平均倍数增加。在shNS CD44+CD24-/低的细胞中，Goosecoid(Gsc)(已知的EMT调节剂，其在大多数人乳腺肿瘤中过表达并促进转移(Hartwell，Muir等人2006))也以5.23倍上调(Hartwell，Muir等人2006)。引人注意的是，在shCAIX CD44+CD24-/低的细胞中未观察到这三种EMT调节剂的转录的显著增加(图19)。与shCAIX CD44+CD24-/低的细胞和对照细胞相比，在shNS CD44+CD24-/低的细胞中，EMT调节剂Zeb2(Vandewalle，Van Roy 等人2009)的转录也上调(数据未显示)。FOXC2(EMT促进剂，其在侵略性的人乳腺癌中上调(Mani，Yang等人2007))的转录，也显示相似的模式(数据未显示)。这些结果证明，对于在缺氧条件下间充质表型和维持乳腺癌干细胞，需要CAIX。
还评估了Notch信号转导通路调节剂的成员，Notch1和其配体Jagged1的转录(Lock，McDonald等人2012)。与对照相比，在shNSCD44+CD24-/低细胞中，Notch1和其下游效应物Jagged1二者的转录分别显示平均6.09和3.12倍的增加。相比之下，在CALX-消除的shCAIXCD44+CD24-/低的细胞群中未观察到这些干性调节剂之一的转录的显著上调(图19)。
通过定量PCR评估一些基因，其未显示分析的细胞群之间的任何显著差异，显示于表2中。
表2
不反应的生物标记

在缺氧条件下将4T1shNS和shCAIX细胞培养为TSs，解聚，对CD44， CD24细胞染色并通过FACS收集。收集能存活的CD44+CD24-/低的或CD44+CD24+细胞并在缺氧条件下在玻璃盖玻片上培养3天，裂解，提取RNA并通过QPCR评估不同EMT标记的相对mRNA水平。表2显示在所有细胞群之间未显示显著改变的基因靶点的选择。给出三个独立实验的平均值和SEM倍数改变。
为了证实这些数据，通过FACS分析亲代4T1TSs，在缺氧条件下将CD44+CD24-/低和对照CD44-CD24+细胞群在存在或缺失CAIX抑制剂MST-104的情况下在玻璃盖玻片上培养。将细胞固定并对上皮标记E-钙黏着蛋白染色。如预期的，用CD44-CD24+细胞处理的载体在细胞-细胞边界显示强的E-钙黏着蛋白染色。相比之下，用CD44+CD24-/低的细胞处理的载体具有非常低的E-钙黏着蛋白表达或没有E-钙黏着蛋白表达。重要地，用CAIX抑制剂MST-104处理的CD44+CD24-/低的细胞显示强的E-钙黏着蛋白染色，非常类似于用MST-104或载体处理的CD44-CD24+细胞，证实这些细胞的上皮表型(图20)。
实施例5
CAIX-特异的抑制剂延迟肿瘤生长和体内癌干细胞群体。
为了评估CAIX抑制对肿瘤生长和体内癌干细胞扩张的效果，使用MDA-MB-231细胞系的变体，MDA-MB-231LM2-4Luc+建立原发性乳腺肿瘤异种移植物。将这些细胞高度体内转移并在缺氧条件下强烈诱导CAIX表达。同位移植细胞并且当证实肿瘤形成时，将小鼠用两种之前描述的CAIX-特异抑制剂(糖基化香豆素MST-205和脲基磺胺MST-104处理(Lou，McDonald等人2011，Lock，McDonald等人2012，Pacchiano，Carta等人2011)。通过卡尺测量和IVIS成像评估肿瘤生长。肿瘤体积测量值显示与载体对照相比，显著抑制两种抑制剂之一处理的小鼠中原发性肿瘤生长，类似于之前的报道(图21)(Lou，McDonald等人2011)。
定量CAIX抑制对原发性肿瘤癌干细胞群体的体内效果。接种后二十七天，取出原发性肿瘤，分离，标记细胞的癌干细胞标记EpCAM(以前称为ESA)并通过FACS评估。载体处理的LM2-4Luc+肿瘤含有平均10％EpCAM+群体。相比之下，MST-104处理的肿瘤显示统计学上显著的减少的EpCAM+群体(图22A和22B)。与载体处理的对照肿瘤相比，另一种 类型的CAIX抑制剂，MST-205，也显示显著减少的群体(图23A和23B)。
为了证实在CAIX抑制后推定的癌干细胞群体中观察到的差异，还通过免疫组织化学(IHC)评估了肿瘤的ALDH1A3表达(图24)。在载体处理的肿瘤中在周围坏死区域观察到ALDH1A3阳性细胞的小群体。相继的组织切片染色也证实这些区域中CAIX表达(图25)。在CAIX-抑制剂处理的肿瘤中，在周围坏死区域大量缺少ALDH1A3染色，同时仍然观察到CAIX表达。
实施例6
EpCAM+MDA-MB-231LM2-4亚群在体内高度致瘤。
为了测试从肿瘤选择的EpCAM+MDA-MB-231LM2-4细胞，我们分别将50,500和5000个EpCAM+或EpCAM-MDA-MB-231LM2-4细胞(还注射50,000个EpCAM-ve细胞)注射入NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫。EpCAM+细胞是高度致瘤的，因为在几天内可以从非常少的EpCAM+细胞起始群体观察到肿瘤形成。尽管当注射更多细胞时EpCAM-细胞也能够形成肿瘤，源自EpCAM-的肿瘤体积总是比源自EpCAM+的肿瘤的体积小得多(Lock，McDonald等人2012)。源自EpCAM-的肿瘤中肿瘤进展速率也比源自EpCAM+的肿瘤更慢，说明EpCAM+细胞形成更侵略性的肿瘤。
这些结果提示通过EpCAM+选择富集MDA-MB-231LM2-4的癌干细胞。这些数据类似于在异种移植EpCAM+/PROCR+或EpCAM-/PROCR-MDA-MD-231乳腺癌干细胞之后观察到的肿瘤生长的差异(Hwang-Verslues，Kuo等人2009)。
实施例7
CAIX抑制营救紫杉醇-驱动的体内CSC扩张.
紫杉醇是有效的有丝分裂抑制剂，其快速靶向分裂中的肿瘤细胞并且是对标准乳腺癌治疗目前选择的化疗剂药物。研究了与和不与紫杉醇治疗联合的CAIX-特异抑制剂治疗对带有肿瘤的小鼠的效力(Lock，McDonald等人2012)。样品结果描述：将NOD-SCID小鼠乳腺脂肪垫用LM24乳腺癌细胞接种。10天后，将小鼠用紫杉醇，或MST-104，或两种药物的组合，或载体剂量给药。通过卡尺测量评估肿瘤体积(图26)并且肺转移的IVIS 成像显示于图27。与紫杉醇联合的CAIX抑制剂治疗抑制NOD-SCID小鼠中LM2-4肿瘤生长和转移(图26-28)。在人道的终点，切除肿瘤并通过FACS评估能存活的EpCAM阳性群体(图29A-29E)。如在图30中显示的，与载体对照相比，单独紫杉醇治疗导致EpCAM+CSC的平均百分数的增加。单独MST-104治疗导致EpCAM+群体的显著减少。重要的是，与紫杉醇联合的MST-104治疗将EpCAM+群体营救回如用载体治疗的小鼠看到的相似的水平(图30)。这些数据证明CALX-特异抑制在调节肿瘤大小和CSC群体方面的临床潜力。
实施例8
CAIX表达的消耗或抑制CAIX活性抑制mTOR通路
在常氧和缺氧条件下培养的4T1TS溶胞产物中评估mTORC1信号转导(Lock，McDonald等人2012)(图31)。在缺氧条件下CAIX的消耗降低mTORC1组分mTOR和Raptor的表达并抑制对翻译调节剂4EBP1的下游信号转导(图31)，导致减少的4EBP1磷酸化和增加的移动性(箭头指出)(图31)。这些数据证明mTOR和其下游效应物依赖于在缺氧条件下的CAIX表达。在缺氧条件下与CAIX抑制剂培养的亲代4T1TSs中的CAIX抑制后观察到相似的结果(图32)，证明mTOR通路的组分可以用作响应通过癌细胞的CAIX功能的抑制的生物标记。
为了评估CAIX活性通过乳腺癌细胞对mTOR通路的体内抑制的效果，在NOD/SCID小鼠中建立使用MDA-MB-231LM2-4Luc+细胞的同位人原发性乳腺肿瘤并用载体或CAIX-特异抑制剂MST-104处理带有肿瘤的动物。在实验终点，取出，分离原发性肿瘤并且将能存活的肿瘤细胞裂解并进行蛋白质印迹(Lock，McDonald等人2012)。CAIX体内活性的减少导致抑制mTORC1信号转导通路(图33)，类似于CAIX消耗和体外抑制(图31和32)。CAIX抑制减少^Ser939TSC2的磷酸化，抑制mTORC1信号转导(Fig33)。在CAIX体内抑制后，未调节Raptor表达(Raptor/肌动蛋白密度测定：载体0.64平均值±0.05SEM；U-104平均值0.69±0.14SEM)。然而，消除了mTORC1组分mTOR的表达，导致下游翻译调节剂4EBP1的磷酸化和表达减少(图33)。这些结果表明，对于体内肿瘤细胞中mTOR信号转导，需要CAIX活性并证明mTOR通路的组分是响应体 内CAIX-靶向的治疗的生物标记。
实施例9
对于在缺氧条件下通过癌细胞的一些趋化因子的分泌，需要CAIX
使用良好建立的4T1乳腺癌模型，显示CAIX的消耗阻断转移并最终导致肿瘤体积的衰退(Lou，McDonald等人2011)。分析来自在常氧和缺氧条件下生长的4T1shNS和shCAIX细胞的mRNA水平，揭示靶向CAIX的shRNA序列在降低CAIX信息方面非常有效(图34)，其证实之前蛋白水平的分析(Lou，McDonald等人2011)。CAIX的消耗导致由肿瘤细胞产生的和参与转移的一些趋化因子的mRNA水平显著降低(Yu，Kortylewski等人2007)，所述趋化因子包括调节的和正常T细胞表达和分泌的(RANTES)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，CXC趋化因子受体3(CXCR3)，和CXCL10(图34)。CAIX的沉默还导致胎盘生长因子(P1GF)的mRNA水平的降低。此外，CAIX水平的减少不导致IL-1α信息的降低，证明对以上趋化因子的效果是特异的。通过ELISA在蛋白水平进一步确认G-CSF和CXCL10mRNA水平的降低(图35和36)。分离自在缺氧条件下生长的4T1shCAIX细胞的条件培养基中CXCL10(图35)和G-CSF(图36)二者的蛋白水平显著低于在相同条件中培养的不沉默对照细胞。这些数据提示，在缺氧条件下通过癌细胞的CAIX表达影响可用于肿瘤微环境的分泌的因子的池(pool)，并且这些因子是响应于通过癌细胞的CAIX表达和/或活性的抑制的生物标记。
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