方法.pdf

一种制备包括干微生物的组合物的方法，其包括：培养一种或多种微生物；将培养的微生物与一种或多种载体混合；用脉冲电磁场处理微生物；培育培养物：载体混合物至少约6小时；和干燥微生物以便将水分水平降低到约1wt％至约6wt％。将培养的微生物与一种或多种载体混合与处理组合物中的微生物的组合显著提高了初始存活率和/或保存期限。

1.  一种制备包括干微生物的组合物的方法，其包括：培养一种或多种微生物；将培养的微生物与一种或多种载体混合；用脉冲电磁场处理微生物；培育培养物∶载体混合物至少约6小时；和干燥微生物以便将水分水平降低到约1wt％至约6wt％。

2.  根据权利要求1的方法，其中微生物为真菌、酵母、细菌、藻类或原生动物中的一种或多种。

3.  根据权利要求2的方法，其中酵母来自以下属中的一种或多种：假丝酵母属、隐球酵母属、Cystofilobasidium、汉森酵母属、克鲁维氏酵母属、白冬孢酵母属、梅奇酵母属、毕赤酵母属、红冬孢酵母属、Rodotorula、糖酵母属、掷孢酵母属、Richosporon。

4.  根据权利要求2的方法，其中真菌来自以下属中的一种或多种：Acrophialospora、Ampelomyces、短梗霉属、双极菌属、毛壳属、Cladorrhinum、Clonostachys、盾壳霉属、附球菌属、粘帚霉属、Glomus、镰孢属、Laetisaria、小球壳孢属、Mycothecium、Muscador、Mycoleptodiscus、新赤壳属、拟青霉属、青霉属、隔孢伏革菌属、Phlebiopsis、瓶霉属、腐霉属、丝核菌属、根霉属、喙孢属、葚孢属、Stephanonectria、篮状菌属、Tilletiopsis、木霉属、单隔孢属、轮枝孢属、被毛孢属、漆斑菌属、Nematophthora、指隔孢属、枝顶孢霉属、链枝菌属、柱孢属、指隔孢属、单顶孢属、Pochonia。

5.  根据权利要求2的方法，其中细菌为以下属中的一种或多种：游动放线菌属、土壤杆菌属、节杆菌属、芽胞杆菌属、双歧杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔氏德菌属、金色单胞菌属、丛毛单胞菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、巴斯德氏芽菌属、泛菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、拉恩氏菌属、Raoultella、沙雷氏菌属、Sporotrix、寡养单胞菌属、链球菌属、链霉菌属、根瘤菌属、慢生型根瘤菌属、Mezorhizobium、Sinorhizobium Seratia、欧文氏菌属、链霉菌属和诺卡氏菌属。

6.  根据权利要求2的方法，其中细菌为非孢子形成细菌。

7.  根据权利要求6的方法，其中非孢子形成细菌选自游动放线菌属、土壤杆菌属、节杆菌属、双歧杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔氏德菌属、金色单胞菌属、丛毛单胞菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、泛菌属、片球菌属、假单胞菌属、拉恩氏菌属、Raoultella、沙雷氏菌属、Sporotrix、寡养单胞菌属、链球菌属、链霉菌属、根瘤菌属、慢生型根瘤菌属、Mezorhizobium、SinorhizobiumSeratia、欧文氏菌属、链霉菌属和诺卡氏菌属。

8.  根据前述权利要求中任意一项的方法，其中载体为以下中的一种或多种：沸石载体，粘土载体，土质硅化合物。

9.  根据权利要求8的方法，其中沸石载体选自以下中的一种或多种：方沸石，钙霞石，菱沸石，斜发沸石，堇青石，钡沸石，毛沸石，八面沸石，镁碱沸石，钠菱沸石，片沸石，浊沸石，插晶菱沸石，中沸石，丝光沸石，钠沸石，钾沸石，方碱沸石，钙十字沸石，发光沸石，钙沸石，杆沸石，ZSM和ZK。

10.  根据权利要求8或9中任意一项的方法，其中沸石载体为斜发沸石。

11.  根据权利要求8的方法，其中粘土载体为下列粘土中的一种或多种：凹凸棒石，膨润土，漂白土，埃洛石，伊利石，高岭土，叶蜡石，蛭石，海泡石，蒙脱石和莫来石。

12.  根据权利要求8的方法，其中土质硅化合物为下列中的一种或多种：石棉，硬水铝石，硅藻土，硅藻土，长石，硅藻土，硅藻土，云母，石英，砂和二氧化硅。

13.  根据前述权利要求中任意一项的方法，其中将培养的微生物和载体混合使得培养物对载体的比例小于1.4(w/w)。

14.  根据前述权利要求中任意一项的方法，其中将培养的微生物和载体混合使得培养物对载体的比例约为1∶5或小于1∶5。

15.  根据前述权利要求中任意一项的方法，其中在下列阶段的一个或多个中进行PEMF处理：在微生物的培养过程中；在将培养的微生物和载体混合的过程中；在将培养的微生物和载体混合后；在(任选的)培养物∶载体混合物的培育过程中；在培养物∶载体混合物的干燥过程中；在将所述混合物施加到种子或种子成分上之后的任意时刻；在培养物∶载体混合物干燥后的任何时刻；在干燥的培养物∶载体混合物再水化后的任意时刻。

16.  根据权利要求15的方法，其中在微生物的培养期间进行PEMF处理。

17.  根据权利要求15的方法，其中在微生物的培养期间和再次在培养物∶载体混合物的培育期间进行PEMF处理。

18.  根据权利要求15的方法，其中只有一次PEMF处理。

19.  根据权利要求15的方法，其中有一次以上PEMF处理。

20.  根据权利要求1的方法，其中将培养物∶载体混合物培育0-14天。

21.  通过根据权利要求1-20中任意一项的方法制备的包括干微生物的组合物。

22.  根据权利要求1-20中任意一项的方法在延长干的休眠微生物的保存期限中的用途。

23.  干微生物在制备包覆的植物种子或其它植物繁殖材料中的用途，包括用通过根据权利要求1-20中任意一项的方法制备的包括干微生物的组合物包覆植物种子或其它植物繁殖材料。

24.  干微生物在生长培养基制备中的用途，包括将通过根据权利要求1-20中任意一项的方法制备的包括干微生物的组合物和土壤混合。

25.  干微生物在废水处理中的用途，包括将通过根据权利要求1-20中任意一项的方法制备的包括干微生物的组合物与废水接触并分离处理的水和组合物。

26.  将培养的微生物与一种或多种载体混合和用脉冲电磁场处理微生物的组合在包括干微生物的组合物的制备中的用途，其中所述干微生物具有显著增加的保存期限。

27.  本文中参照实施例一般描述的方法。

28.  本文中参照实施例一般描述的组合物。

方法
发明领域
本发明涉及制备包括干微生物的组合物的改进方法，该方法产生提高的微生物生存力，并涉及通过改进方法制备的干微生物组合物的用途。
技术背景
在农业中，接种物(innoculant)包括特定类型的微生物的使用是已知的。接种物通常被涂在种子或其它植物繁殖材料上，从而一旦播种或种植，就可建立支持种子发芽、刺激植物生长或生物保护种子和所得植物的增强环境。
例如，可使用能在豆科植物中起固氮作用的共生细菌如来自根瘤菌属和慢生型根瘤菌属的那些来接种豆科植物以帮助节(nodule)形成。可通过包覆种子、在农场对种子或庄稼喷粉或在种植时在犁沟中放置接种物来实现接种。
产生接种物的前述方法包括将活性的活微生物培养物如根瘤菌属细菌培养物与载体如腐殖质或泥炭混合。水分载体保持微生物在活的状态。但是，由于环境中养料和水分的消耗，这种活细菌培养物的保存期限短。
制备接种物的另一方法是通过将细菌转化到休眠状态如通过冻干细菌。为了防止细胞破裂，必须快速进行这种方法。
US 5,695,541中教导了制备干的休眠接种物的另一方法，该方法包括在生长培养基中培养微生物菌种，并将培养物和泥土载体混合，然后将混合物缓慢地空气干燥至少约1天，从而微生物中的水分水平被逐渐降低以形成干组合物。与制备干的休眠接种物的其它方法相比，干组合物被认为具有优良的生存力。
脉冲电磁场(PEMP)已被教导能刺激生物组织，包括微生物(参见US6,561,968)。US 6,561,968中表明，在干燥过程中微生物如细菌的存活率可通过用PEMF处理得到提高。但是，US 6,561,968中表明PEMF处理只对部分干燥的微生物有用，即只对部分干燥但仍包含约20％水含量的微生物有用。也就是说，US 6,561,968只公开了PEMF处理用于将被保持在存活状态的微生物(例如在20％水含量时，水分活性(water activity)(A_w)仍处在细菌群落为与休眠状态相对的存活状态的水平(在约1和0.95之间)的用途。另外，US 6,561,968教导PEMF处理只能使细菌更好地承受干燥过程(即细菌的初始存活率)。报道了对部分干燥微生物的长期保存期限没有影响。
干微生物降低的存活率尤其是降低的保存期限是相当大的问题，尤其当干微生物的水含量在约1％至约6％w/w时。
发明概述
本发明基于将微生物培养物和载体混合与用脉冲电磁场(PEMF)处理的组合显著了增加干微生物保存期限的惊人发现。换句话说，与仅仅在载体上干燥的微生物相比或与单独用PEMF处理的微生物相比，按照本发明处理的微生物在干燥阶段能保持存活明显较长的时间。观察到的差异有协同性。
因此，在广泛的方面，本发明提供使微生物培养物和载体混合与用脉冲电磁场(PEMF)处理的组合在制备包括干微生物的组合物中的用途。得到的微生物具有明显增加的保存期限。
详细方面
在一个方面，本发明提供一种制备包括干微生物的组合物的方法，其包括：培养一种或多种微生物；将培养的微生物与一种或多种载体混合；用脉冲电磁场处理微生物；将培养物∶载体混合物培育至少约6小时；和干燥微生物，以便将水分水平降低到约1wt％至约6wt％。
在另一个方面，本发明提供一种通过本发明的方法制备的包括干微生物的组合物。
在又一方面，本发明涉及干微生物在制备包覆的植物种子或其它植物繁殖材料中的用途，包括用通过本发明的方法制备的包括干微生物的组合物包覆植物种子或其它植物繁殖材料。
在本发明的另一方面中，提供了干微生物在生长介质制备中的用途，其包括将通过本发明的方法制备的包括干微生物的组合物和土壤混合。
在又一方面，本发明提供干微生物在废水处理中的用途，包括使通过本发明的方法制备的包括干微生物的组合物与废水接触并分离处理的水和组合物。
通过本发明的方法制备的干微生物具有下列性质中的一种或多种：与单独用载体制备的微生物和/或单独用PEMF处理制备的微生物相比，更好的初始存活率和增加的保存期限。
在其它实施方案中，本发明提供一种与单独用载体制备的微生物和/或单独用PEMF处理制备的微生物相比具有提高的初始存活率和/或保存期限的干微生物；包括所述干微生物的组合物；和其用途，包括例如在制备包覆的植物种子和/或其它繁殖材料中，在制备生长培养基中，和在废水处理中的用途。
优选方面
合适地，本发明可用于干燥能在干状态下存活的任何微生物。
优选地，微生物处于休眠状态。合适地，微生物可处于干燥或脱水状态。
优选地，本发明用于干燥在农业中使用的有益微生物。尤其感兴趣的是具有杀生物性质如杀真菌或杀虫和其它性质的微生物，和例如能在将被保护植物存在下在土壤中存活的生长促进微生物。
合适地，根据本发明的微生物可为真菌，包括酵母，细菌，藻类或原生动物(protozoans)中的一种或多种。
合适地，微生物可为已知的杀生物微生物，包括真菌木霉属(Trichoderma)和粘帚霉属(Gliocladium)。
优选地，微生物为细菌、真菌或酵母。
在一个方面，优选微生物为细菌。
在一种实施方案中，优选微生物为来自以下属的一种或多种的酵母：假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Cystofilobasidium、汉森酵母属(Hansenula)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、Rodotorula、糖酵母属(Saccharomyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、Richosporon。
在另一实施方案中，优选微生物为来自以下属中一种或多种的真菌：Acrophialospora、Ampelomyces、短梗霉属(Aureobasidium)、双极菌属(Bipolaris)、毛壳属(Chaetomium)、Cladorrhinum、Clonostachys、盾壳霉属(Coniothyrium)、附球菌属(Epicoccum)、粘帚霉属(Gliocladium)、Glomus、镰孢属(Fusarium)、Laetisaria、小球壳孢属(Microsphaeropsis)、Mycothecium、Muscador、Mycoleptodiscus、新赤壳属(Neocosmospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、隔孢伏革菌属(Peniophora)、Phlebiopsis、瓶霉属(Phialophora)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、根霉属(Rhizopus)、喙孢属(Rhynchosporium)、葚孢属(Sporidesmium)、Stephanonectria、篮状菌属(Talaromyces)、Tilletiopsis、木霉属(Trichoderma)、单隔孢属(Ulocladium)、轮枝孢属(Verticillium)、被毛孢属(Hirsutella)、漆斑菌属(Myrothecium)、Nematophthora、指隔孢属(Dactylella)、枝顶孢霉属(Acremonium)、链枝菌属(Catenaria)、柱孢属(Cylindrocapon)、指隔孢属(Dactylella)、单顶孢属(Monacrosporium)、Pochonia。
合适地，真菌可为以下中的一种或多种：局限枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)、Caternaria auxiliaris、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)、Dactylella oviparasitica、Hirsutella rhossiliensis、Monacrosporiumellipsosporum、柱捕单顶孢菌(Monacrosporium cionopagum)、Nematophthoragynophila、马昆德拟青霉(Paecilomyces marquandii)、普可尼亚厚垣菌(Pochonia chlamydosporium)、粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)、Coniothyrium minitans、黑附球菌(Epicoccum nigrum)、紫附球菌(Eppicoccumpurpurascens)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、烟草镰刀霉(Fusarium tabacinum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、Gliocladiumatrum、链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、粉红粘帚霉(Gliocladiumroseum)、绿粘帚霉(Gliocladium virens)、Glomus claroideum、Glomusfasciculatum、Glomus intraradices、Glomus mossae、Laetisaria arvalis、Microsphaeropsis ochracea、Muscador albus、Mycoleptodiscus terrestris、Mycothecium verrucaria、Necosmospora vasinfecta、玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、常现青霉(Penicillium frequentans)、蓝绿边青霉(Penicillium godlewskii)、黑青霉(Penicillium nigricans)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、大隔孢伏革菌(Peniophora gigantea)、瓶霉属菌种(Phialophora sp.)I-52、Phlebiopsisgigantea、棘腐霉(Pythium acanthicum)、刺器腐霉(Pythium acanthophoron)、Pythium mycoparasiticum、Pythium nunn、寡雄腐霉(Pythium oligandrum)、缠器腐霉(Pythium periplocum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、Rhynchosporium alismatis、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、Sporidesmiumsclerotivorum、Stephanonectria keitii、Talaromyces flavus、Tilletiopsis sp.、Trichoderma asperellum、Trichoderma atroviride、Trichoderma hamatum、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、Trichoderma inhatum、康氏木霉(Trichoderma koningii)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、Trichoderma stromaticum、绿色木霉(Trichoderma viride)、Ulocladium atrum、Verticilium chlamydosporium、大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)、Verticillium suchlasporium。
在又一实施方案中，优选微生物为以下属中的一种或多种的细菌：游动放线菌属(Actinoplanes)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽胞杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔氏德菌属(Burkholderia)、金色单胞菌属(Chryseomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、泛菌属(Pantoea)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拉恩氏菌属(Rahnella)、Raoultella、沙雷氏菌属(Serratia)、Sporotrix、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、慢生型根瘤菌属(Bradyrhizobium)、Mezorhizobium、Sinorhizobium Seratia、欧文氏菌属、链霉菌属(Streptomycetes)和诺卡氏菌属(Nocardia)。
优选细菌为选自以下的非孢子形成细菌：游动放线菌属、土壤杆菌属、节杆菌属、双歧杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔氏德菌属、金色单胞菌属、丛毛单胞菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、泛菌属、片球菌属(Pediococcus)、假单胞菌属、拉恩氏菌属、Raoultella、沙雷氏菌属、Sporotrix、寡养单胞菌属、链球菌属、链霉菌属、根瘤菌属、慢生型根瘤菌属、Mezorhizobium、SinorhizobiumSeratia、欧文氏菌属、链霉菌属和诺卡氏菌属。
合适地，细菌可为以下中的一种或多种：放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、简单节杆菌(Arthrobacter simplex)、Bacillus chitinosporus、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、Bacillus amylofaciens、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacilluspopilliae)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、双歧双歧杆菌(Bifidbacteriumbifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、Bifidobacterium lactis、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、浅黄金色单胞菌(Chryseomonas luteola)、食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、大比目鱼黄杆菌(Flavobacterium balustinum)、肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)、Flavobacterium psycrophilium、Flavobacterium columnae、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus grayii、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、甜菜疫病假单胞菌(Pseudomonas aptata)、致金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、pseudomonas brassicacearum、洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、托拉氏假单胞杆菌(Pseudomonastolaasii)、Rahnella aqualis、Raoultella terrigena、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesscens)、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)、Sporotrix flocculosa、嗜麦芽糖寡养单孢菌(Stenotrophomonas malthophilia)、乳链球菌(Streptoccuslactis)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)。
合适地，微生物可为来自假单胞菌属的细菌。合适地，微生物可为荧光假单胞菌。合适地，微生物可为产生环脂肽的荧光假单胞菌。
优选地，在合适的培养基中培养微生物。合适地，可在常规发酵罐或摇瓶内在生长培养基中培养微生物。合适地，发酵罐可为固定、半连续或连续发酵罐。优选地，培养微生物直到培养达到稳定期。
合适地，培养物和培养基可与载体混合。在与载体混合前，可用新鲜的或过滤的培养基和/或蒸馏水稀释微生物培养物和/或培养基。优选恰好在使培养基与载体混合前用新鲜的或过滤的培养基稀释微生物培养物。
合适地，可以以连续方式或分批方式进行混合。
优选地，载体可为粉状形式或被造粒。载体为粉状形式还是粒状形式可取决于预定用途。
合适地，粉状载体可具有例如约1μm-约0.5mm的平均颗粒直径。合适地，粒状载体可具有例如约0.5mm-约3mm的平均颗粒直径。
在一种实施方案中，优选的载体为具有大的表面积的那些，优选表面积大于200m²/克、优选大于300m²/克的那些。
在另一实施方案中，优选的载体为具有低天然水含量(WC)的那些。低天然水含量为保持细菌处于休眠状态的含量。优选地，低天然水含量为8.0％WC或以下，优选7.5％WC或以下，优选低于约7％WC。
合适地，优选的载体可为天然水含量在3％-7.5％范围内的那些。这在例如使用混合物包覆种子或其它繁殖材料的应用中尤其有效。
在一种实施方案中，优选的载体为具有非常高的天然水含量的那种。非常高的天然水含量为能维持细菌处于新陈代谢阶段的含量。通常，非常高的天然水含量可为例如＞20％。
载体的天然水含量为结合到阳离子的水量或在天然沸石或粘土的孔内携带的水量。不希望受理论约束，沸石为水合铝硅酸盐，意味着它们在它们的基本结构中包含水，即一种斜发沸石的结构式为(Na，K，Ca)_2-3A₁₃(Al，Si)₂Si₁₃O₃₆-12H₂O，其为水合钠钾钙铝硅酸盐。
本文中使用的术语“天然水含量”是指在105℃的烘箱中保持4小时可从样品载体中除去的水量。为了避免疑虑，该方法没有必要从载体中除去全部水分子。
优选地，根据本发明的载体将在一段时间内(over time)具有相对稳定的水含量。载体水含量在一段时间内的稳定性将决定载体最适合的应用。例如，斜发沸石和膨润土在一段时间内的水分含量是相对稳定的。因此，这些载体可特别好地适用于其中培养物∶载体混合物可在长期贮存后被再使用的应用，例如这可使这些载体特别好地适用于例如包覆种子或其它繁殖材料。另一方面，部分载体可能具有相对较不稳定的水含量。这可使这些载体特别好地适用于只在短期贮存而没有长期贮存后就使用培养物∶载体混合物的应用。
确定载体水分含量的相对稳定性的一种方法是干燥载体得到％MC，然后在将载体放在控制环境(即控制温度和/或相对湿度)中30天后测量载体的％MC。水分损失或增加指示载体的不稳定性。在30天时间内保持相同％MC的载体被认为非常稳定。载体吸收或损失的水分量与正对照载体(如膨润土或斜发沸石)吸收或损失的水分量相比确定载体的“相对”稳定性。根据本发明，膨润土和斜发沸石被认为是稳定载体。比膨润土或斜发沸石吸收更多水分或失去更多水分的载体被认为是相对较不稳定的载体。
换句话说，在一段时间内具有较稳定的水分含量的载体可被认为是能充分“缓冲”水分变化的载体。相反，在一段时间内具有较不稳定的水分含量的载体可被认为是不能缓冲水分变化的载体。适当地，根据本发明的载体为能缓冲水分变化的载体。
合适地，载体可为下列载体中的一种或多种：沸石载体；粘土载体；其它土质硅化合物。
沸石为具有明确结构的微孔结晶固体。通常它们在它们的框架内包含硅、铝和氧，在它们的孔内包含阳离子、水和/或其它分子(如氨、碳酸盐离子和硝酸盐离子)。许多作为矿物天然存在。其它一些为合成的和商业制备的。在本发明中，可使用天然沸石和/或合成沸石。
沸石的定义特征在于它们具有连接的(Si，Al)O₄四面体的三维框架结构，(Si，Al)和O以1∶2的比例存在。沸石由于这种三维结构而不同于粘土矿物，其中氧原子在化学上用阳离子平衡。
合适地，沸石载体可为下列沸石中的一种或多种：方沸石(analcite)，钙霞石(cancrinite)，菱沸石(chabazite)，斜发沸石(clinoptilolite)，堇青石(cordierite)，钡沸石(edingtonite)，毛沸石(erionite)，八面沸石(faujasite)，镁碱沸石(ferrierite)，钠菱沸石(gmelinite)，片沸石(heulandite)，浊沸石(laumontite)，插晶菱沸石(levynite)，中沸石(mesolite)，丝光沸石(mordenite)，钠沸石(natrolite)，钾沸石(offretite)，方碱沸石(paulingite)，钙十字沸石(phillipsite)，发光沸石(ptilolite)，钙沸石(scolecite)，杆沸石(thomsonite)，ZSM和ZK。
在一些方面中，优选沸石载体为斜发沸石。适当地，本文中使用的斜发沸石可为斜发沸石-K、斜发沸石-Ca或斜发沸石-Na。优选地，本文中使用的斜发沸石为斜发沸石-Na。合适地，本文中使用的斜发沸石可具有4.7-5.4％的天然水含量，优选约5％。在一个实施方案中，优选斜发沸石为可从丹麦NorNatur得到的产品名为Klinomin^TM的斜发沸石-Na。合适地，按照本发明使用的斜发沸石由大于80％的斜发沸石组成。合适地，载体可具有6.9-7.1的pH值和/或260-290m²/g的表面积。
粘土为最初从至少部分因为胶质颗粒的尺寸和分布而具有物理性质的土中得到的天然存在的水合铝硅酸盐，并且性质包括塑性。通常，粘土中30％或更多颗粒的直径在0.002mn以下。
合适地，粘土载体可为下列粘土中的一种或多种：凹凸棒石(attapulgite)，膨润土(bentonite)，漂白土(fuller’s earth)，埃洛石(halloysite)，伊利石(illite)，高岭土(kaolin)，叶蜡石(pyrophyllite)，蛭石(vermiculite)，海泡石(sepiolite)，蒙脱石(montmorillonite)和莫来石(mulite)。
在一种实施方案中，优选载体可为膨润土。膨润土表示具有良好膨胀能力和可变蒙脱石含量的粘土。优选地，膨润土的主要组分为蒙脱石，优选Na-蒙脱石。按照本发明使用的一种合适的膨润土包含约50％蒙脱石、10％高岭石、10％伊利石和20％蛭石。这种膨润土可从丹麦Tierra Products ApS作为OB-lergranulate得到。为了避免疑虑，这在下面的实验部分中称为膨润土。
在另一实施方案中，优选载体为蛭石。
本领域的普通技术人员将理解的是，天然粘土或沸石材料不必是纯的。因此，在一些实施方案中，当通过名称提到粘土或沸石，如斜发沸石时，它指主要由这种粘土或沸石组成的载体(即主要由例如斜发沸石组成)。优选地，粘土或沸石包括超过50％的指定粘土或沸石(例如斜发沸石)，优选超过60％，更优选超过70％，更优选超过80％指定的粘土或沸石。合适地，粘土或沸石可包括超过90％的指定粘土或沸石或者甚至100％的指定粘土或沸石。
一些土质硅化合物不被归类为粘土或沸石。这种土质硅化合物包括例如以下中的一种或多种：石棉，硬水铝石，硅藻土，硅藻土，长石，硅藻土，硅藻土，云母，石英，砂和二氧化硅。
在一个方面，载体可适当地为一种或多种粘土载体与一种或多种沸石载体的组合。
不希望受理论约束，能预见到某些种类的微生物可具有优选的载体，即可在某些载体中存活得更好。一旦本领域的普通技术人员受到本发明教导，则在他们的常规技能内就能很好地确定任何给定微生物的优选载体。实现它的一种方法是进行以下试验：
1.通过在105℃下培育载体4小时测定载体的天然水含量。
2.按1∶5比例混合液体微生物培养物和不同的载体。
3.培育1-2天以使细菌生长。
4.将MicxCarriers干燥至(1)中测定的天然水含量的1.5x、1x、0.75x(或更多点)，然后研磨成细粉末。
5.在室温下培育＞7天。
6.通过平板培养计数CFU。优选的载体为在给定范围内载有大量微生物的载体。
7.任选地-一旦确定一组优选的载体，就可确定WC和A_w之间的关系。优选的载体为在一段时间内在给定储存条件下A_w不会改变(或只稍微变化，即变化可被携载的微生物忍受)的载体。
特别地，优选的粘土/沸石载体为天然水含量类似于干燥后培养物∶载体混合物中的最终水分含量的那些载体，对于种子应用目的，通常在3％-7.5％(w/w)范围内，和/或为在一段时间内具有相对稳定水分含量的那些载体。
在又一实施方案中，微生物在载体中的分布优选是均匀的。微生物在载体中的分布均匀性可通过将载体喷涂(spray coating)到表面上并测定每面积单位的微生物数目来确定。
优选地，将培养的微生物和载体混合使得培养物对载体的比例在约1∶2至约1∶6(w/w)之间，优选约1∶3至约1∶5(w/w)，更优选小于1∶4(w/w)，例如1∶4.1、1∶4.2、1∶4.5、1∶4.75或约1∶5。
在一种实施方案中，优选将培养的微生物和载体混合使得培养物对载体的比例小于1.5(w/w)。
不希望受理论约束，已经令人惊讶地发现，微生物培养物对载体的比例越低，存活的可培养细胞数(干载体中的菌落形成单位(CFU))就越多。发现优选将培养的微生物和载体混合使得培养物对载体的比例小于1∶4(w/w)，合适地小于例如1∶4.1、1∶4.2、1∶4.5、1∶4.75或1∶5。
为了制备标准载体配方，可适当地采取以下方法步骤：以小于1.4(w/w)、适当地小于例如1∶4.1、1∶4.2、1∶4.5、1∶4.75或1∶5的微生物细胞∶载体比例将微生物细胞和载体混合；在10℃下放置混合物7天，然后可在3-4天的时间内在32.5-35％湿度的控制气氛中将混合物干燥至5％水含量或更少。
合适地，在与载体即将混合前，微生物培养物中微生物(例如细菌)的浓度为大约10⁷-10⁹个微生物/ml培养基，优选大约10⁸个微生物/ml培养基。
合适地，如果载体为干的(即具有0％水含量)，例如在烘箱杀菌后，可在将培养的微生物和载体混合前加入少量等分试样的水和/或培养基。合适地，直到载体中的水分含量为被视为该载体的天然含量时才加入水和/或培养基。水和/或培养基的加入防止由于混合过程中产生的热造成的细胞破坏。如果认为需要，可通过真空除去载体中积存的空气。
优选地，在混合培养物∶载体混合物后，培育混合物约6小时以上，优选约8小时以上，优选12小时以上，优选约18小时以上，优选0.5-14天。更优选将培养物∶载体混合物培育约12小时以上。合适地，将培养物∶载体混合物培育约12小时至约14天。
合适地，在混合后，可在5℃-30℃下、优选10℃-15℃下将培养物∶载体混合物培育约0至约14天，优选0.5-约14天。在培育过程中，允许微生物生长并增殖。优选地，如果培育培养物∶载体混合物超过1天，则在该培育期间不发生除湿。
合适地，可在过程中的任何时刻进行脉冲电磁场(PEMF)-处理。例如，可在以下阶段中的一个或多个中进行PEMF处理：在微生物的培养过程中；在将培养的微生物和载体混合的过程中；在将培养的微生物和载体混合后；在培养物∶载体混合物(任选的)培育过程中；在培养物∶载体混合物的干燥过程中；在干燥的培养物∶载体混合物的储存过程中；在施加到种子或种子成分上后；在将培养物∶载体混合物干燥后的任何时刻；在将干燥的培养物∶载体混合物再水化(re-hydration)后的任意时刻。
在一种实施方案中，优选在微生物的培养过程中进行PEMF处理。
在另一种实施方案中，合适地，可在微生物的培养过程中进行PEMF处理，并任选地在培养物∶载体混合物的培育过程中再次进行。
合适地，可有一次以上的PEMF处理。在一种实施方案中，可有二次以上的PEMF处理。
在一种实施方案中，可在连续发酵罐中培养微生物，并在全部或部分培养物被进一步处理前将微生物在发酵罐的一个区域中暴露于PEMF处理，任选地，部分培养物被再循环回到发酵罐中。通常，当从发酵罐通过管道(如管，合适地为盘管(wound tube))时，微生物可被暴露于PEMF。
合适地，每次PEMF处理可从约0.5h至约48h，优选在约4h至约24h，优选在约8h至约16h。
在一个方面中，优选恰好在将细菌培养物与载体混合前用PEMF处理细菌培养物1-16小时。
但是，可以预见，每次PEMF处理可包括大量PEMF处理，每次处理持续几分钟(即1-20分钟，优选1-10分钟，更优选1-5分钟)。合适地，可将微生物暴露于一次以上处理，优选二次以上，优选三次以上，优选四次以上，优选五次以上，优选六次以上，优选七次以上，优选八次以上，优选九次以上，或优选10次以上处理。
如本领域的技术人员所理解的，在本发明的方法中可使用产生脉冲电磁场(PEMF)的任何装置。
US 6,561,968中教导了一种这样的装置(该参考文献并入本文作为参考)。US 6,5619,68中的装置包括多个各自具有中心轴的导电线圈，每个中心轴定向于微生物；和操作上连接到每个线圈用于供应在每个线圈内传导的一系列电流脉冲的脉冲产生器，系列脉冲适合从感应电场的每个线圈中产生周期性变化磁场。在US 6,561,968的装置中，存在大量成对线圈，每对线圈包括第一线圈和相邻的第二线圈。对于脉冲产生器提供的给定脉冲，第一线圈中心处的磁场定向于微生物上，第二线圈中心处的磁场定向远离微生物。
线圈的中心轴为沿管状线圈的中心轴对称轴垂直定向或垂直(位于中心)于扁绕线圈(flat coil)的平面。
由于PEMF装置可产生热，因此可预见装置可另外包括冷却装置。
脉冲型电磁场(PEMF)为最常用的电磁治疗类型，尤其用于骨愈合、关节炎治疗和运动以及重复性应激损伤。许多不同的商业型PEMF装置已被报道用于保健。仅仅作为例子，一种这种PEMF装置为Curatron 2000-系列；Wavetek；Bi Osteogen装置。技术人员将容易地知道其它PEMF装置。可以预知，根据本发明，可使用这些装置中的任何一个。
优选地，将微生物干燥到接近载体天然水分含量的水分含量，一般其在约3至约6％(w/w)之间。
优选地，干燥微生物培养物∶载体混合物。合适地，将微生物培养物∶载体混合物干燥到接近载体天然水分含量的水分含量，其在约1wt％至约7wt％之间，优选约3wt％至约6wt％之间。
不希望受理论约束，已经令人惊讶地发现，具有少于6wt％水的载体中细胞的PEMF处理能大大增加微生物(尤其是细菌)的保存期限，少于6wt％水即其中A_w(水分活性)小于约0.7，合适地小于约0.5。发现可提高保存期限例如到1年以上。
水分活性(A_w)表示混合物中水对细菌的相对可用性。1或接近1的水分活性表示细菌不处于休眠状态，而处于活的状态；而小于0.9、优选小于约0.7的水分活性意味着微生物将处于休眠状态。同样，约0.4-0.6的水分活性意味着细菌将处于休眠状态。优选地。根据本发明，干的培养物∶载体混合物的水分活性小于0.9，优选小于约0.7，优选约0.4-0.7，优选约0.6。
在本发明中，第一次显示PEMF处理可用于延长干的休眠微生物的保存期限。
优选地，空气干燥微生物和/或微生物培养物∶载体混合物。合适地，可使用强制通风干燥。例如，可将培养物∶载体混合物放置在出口栅格上方的空气层流试验台上。在这种情况下，干燥可在小于1天内发生，优选在约16小时内。或者，可使用在盘中或类似容器中的简单室内空气干燥。优选在约10℃-30℃、一般约20℃-24℃的温度下和小于75％、优选约30-60％、更优选约32.5-35％的相对湿度下进行室内空气干燥。对于室内空气干燥，干燥可能需要1至5天，优选1至4天，合适地为3-4天。合适地，在室内空气干燥过程中，在气氛中有Ca²⁺离子对微生物存活可为有利的。作为又一种替代方案，可通过将培养物∶载体混合物放在袋中进行干燥，所述的袋例如Milli-Wrap^RTM袋，该袋允许水分蒸发。
将水分水平逐渐降低到约1％至约6％(w/w)之间。
可在非无菌条件下进行干燥步骤。
根据本发明的方法可包括研磨微生物培养物∶载体混合物的组合物和/或用该组合物包覆种子或其它繁殖材料的更多步骤。
例如，可使用空气分级磨(classifier mill)将干燥的产物磨碎到约0.1-约150微米的最终粒度。
在一种实施方案中，合适地，可在约10-15℃和约18-33％(湿重)的水分含量下培育培养物∶载体混合物，然后在饱和氯化钙上在20℃下干燥3-4天，提供大约32.5％的相对水分，或然后在少于24小时内快速干燥。可将培养物∶载体混合物的水分含量减少到约4-约7％。
在一种实施方案中，载体的pH或微生物培养物∶载体混合物的pH为约6-约9，优选约7-约9，更优选约8-约9，更优选约8.2-约8.8，更优选约8.6。
在一种实施方案中，优选向载体中加入尽可能少的液体。通常在一些情况下，过多的培养基可能意味着干载体中细菌存活率的降低。
优点和令人惊讶的发现
发现根据本发明的方法处理的微生物能明显更好地在干燥后存活，即比如果仅使用载体和/或如果单独进行PEMF处理具有更好的初始存活率。但是，特别发现，载体与PEMF处理的组合能使微生物在干燥阶段存活明显更长的时间且存活得更好，即增加了干微生物的保存期限。令人惊讶和意想不到地，与任何一种单独处理相比，这些处理尤其对干微生物保存期限的组合效果是协同性的。
本文使用的术语“初始存活率”是指微生物在干燥例如0-约14天、合适地为1-约5天、合适地为2天后立即试验时承受实际干燥过程的能力，在干燥后且不管干燥的微生物或干燥的培养物∶载体混合物是否被包覆到例如种子或其它繁殖材料上。
本文使用的术语干燥微生物的“保存期限”是指微生物在长时间储存后一旦再水化时生长和/或增殖的能力，即微生物在干燥状态下长时间(例如至少24小时，至少48小时，至少6个月，或至少12个月)储存后存活、被再水化重新激活和成为活的可培养细胞的能力。
为了再进一步提高初始存活率和/或保存期限，可向培养物中加入渗透保护剂(osmoprotectant)或细胞稳定剂(cell stabiliser)。例如，向培养物中加入10-100mM蔗糖可使存活微生物如假单胞菌属菌种的数目增加大约10倍。其它已知的保护剂和细胞稳定剂包括氨基酸和它们的衍生物、胆碱、ectoine、二价阳离子、碳水化合物、甘油、树胶、抗氧化剂、非脂肪乳固体、结晶纤维素、羧甲基纤维素(CMC)和CMC衍生物。
根据本发明，使用本发明的方法干燥并被包覆到粒状(pelleted)甜菜种子上的根移植的对抗性(root colonising antagonistic)假单胞菌可在种子上以足够高的数量存活1.5年以上，并仍恢复它们对病原体的生物对抗性和它们的根移植特性。
用途
可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物用于将以下中的一种或多种施用到种子或其它植物繁殖材料上：生物控制剂；生长刺激剂；杀真菌剂；杀虫剂。
可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物直接施加到温室和土壤中的生长培养基中。
另外，可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物用于污水清洁和/或化学/生物溢出物(spills)如农场溢出物的清除。或者，当组合物包括有生物补救能力的微生物时，可将组合物用于清洁污染的固体，例如PCB污染的固体。有生物补救能力的微生物是众所周知的，并可为能降解有毒化合物的任何微生物，包括但不限于基因修饰的微生物。
或者，可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物用于将微生物施加到食品和/或动物饲料上。用于食品工业的合适微生物是众所周知的，并可为例如乳酸菌。
另外，可将包括通过本发明的方法制备的干微生物的组合物用于医疗应用，例如用于乳酸菌的供应。
协同效应
在包括干微生物的组合物的制备中，使将微生物培养物和载体混合与用脉冲电磁场(PEMF)处理的组合产生对初始存活率和/或微生物保存期限的协同效应。
可通过观察下列处理后活的可培养微生物细胞的数目来确定协同作用：a)将微生物培养物和载体混合；b)用PEMF处理；或c)a)和(b)的组合。当组合(c)比单独处理(a)或(b)的任何一个产生更好的效果(即当评价初始存活率和/或当评价微生物的保存期限时更多的活的可培养细胞)时显示了协同作用。优选地，当评价初始存活率和/或当评价微生物的保存期限时，与通过处理(a)产生的活的可培养微生物细胞数加上通过处理(b)产生的活的可培养微生物细胞数相比，组合处理(c)产生更多的活的可培养微生物细胞。
食品
本文使用的术语“食品”具有宽泛意义--并覆盖了人的食品以及动物的食品(即饲料)。在优选的方面中，食品用于人食用。
食品可为溶液或固体形式—这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
食品成分
本发明的组合物可用作食品成分。
本文使用的术语“食品成分”包括加入或可加入到功能食品或食品中的配方，并包括可在要求例如酸化或乳化的各种产品中以低水平使用的配方。
食品成分可为溶液或固体形式--取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
食品补充剂
本发明的组合物可为--或可被加入到--食品补充剂。
功能食品
本发明的组合物可为--或可被加入到--功能食品。
本文使用的术语“功能食品”是指不仅能提供营养效果和/或味觉满足，而且能为消费者带来更多有益效果的食品。
尽管没有功能食品的法定定义，但关注该领域的大多数团体都认为它们是作为具有特定保健作用而销售的食品。
食品产品
本发明的组合物可用于制备食品产品，如以下中的一种或多种：糖果产品，乳制品，肉制品，家禽制品，鱼制品，和面包制品。
例如，本发明的组合物可用作以下的成分：软饮料、果汁或包括乳清蛋白的饮料、保健茶、可可饮料、牛奶饮料和乳酸菌饮料、酸乳(yoghurt)、饮用酸乳和酒。
本发明还提供制备食品或食品成分的方法，该方法包括将通过本发明的方法产生的组合物或根据本发明的组合物与另外的食品成分混合。制备食品成分的方法也是本发明的另一方面。
药物
通过本发明的方法产生的组合物和/或根据本发明的组合物也可用作-或-用于制备-药物。本文中，在广泛的意义上使用术语“药物”，并包括人的药物以及动物的药物(即兽医应用)。在优选的方面中，药物用于人应用和/或畜牧业(animal husbandry)。
药物可用于治疗目的--在性质上其可为治疗性的或姑息性的(palliative)或预防性的。药物甚至可用于诊断目的。
当用作--或用于制备--药物时，可将本发明的组合物与以下中的一种或多种一起使用：可药用的载体，可药用的稀释剂，可药用的赋形剂，可药用的佐剂，药物活性成分。
药物可为溶液或固体形式--取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
药物成分
通过本发明的方法产生的组合物和/或本发明的组合物可用作药物成分。本文中，本发明的产品和/或组合物可为单一活性组分或它可为多种(即2种或以上)活性组分中的至少一种。
药物成分可为溶液或固体形式--取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
药物成分可为泡腾剂(effervescent)产品形式以改善药物的溶解性能。
化学工业
通过本发明的方法产生的组合物和/或本发明的组合物也可用作生物补救剂，即消耗和分解环境污染物。
形式(Forms)
通过本发明的方法产生的组合物和/或本发明的组合物可以以任何合适的形式使用。
形式的合适例子包括以下中的一种或多种：片剂，丸剂，胶囊，胚珠(ovules)，溶液或悬浮液，它们可包含调味剂或着色剂，用于即时释放、延时释放、改进释放、持续释放、脉冲释放或控制释放应用。
例如，如果产品和/或组合物以片剂形式使用--如用作食品成分--片剂还可包含以下中的一种或多种：赋形剂，崩解剂(disintegrant)，造粒粘合剂(granulation binder)或润滑剂。
用于制备形式的营养学可接受载体的例子包括例如水、盐溶液、醇、硅酮(silicone)、蜡、凡士林(petroleum jelly)等。
用于形式的优选赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖或高分子量聚乙二醇。
对于含水悬浮液和/或酏剂(elixirs)，通过本发明的方法产生的组合物和/或本发明的组合物可结合各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料、乳化剂和/或悬浮剂、和稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油，及其组合。
形式还可包括明胶胶囊、纤维胶囊、纤维片剂等。
实施例
现在将仅通过实施例描述本发明，其中参考以下图：
图1显示了在4天内缓慢干燥前用PEMF(55V)处理0、8、16或48小时并与沸石载体混合后，包覆到粒状甜菜种子上的干燥的荧光假单胞菌(处理后0-544天)的初始存活率和保存期限；
图2显示了快速干燥前用PEMF(55V)处理0、8、16或48小时并与沸石载体混合后，包覆到粒状甜菜种子上的干燥的荧光假单胞菌(处理后0-544天)的初始存活率和保存期限；
图3显示了与载体水分含量相比的荧光假单胞菌的平均存活百分比。
实施例  1-PEMF处理与载体组合对干微生物的初始存活率和保存期限的影响
在液体LB中培养荧光假单胞菌株DS96.578过夜至接近静止期(stationary phase)，用新鲜LB稀释10倍，并按1∶2比例混合到斜发沸石载体内(斜发沸石-Na，可从丹麦NorNatur作为Klinomin^TM得到)。然后通过在层流气流试验台中进行空气干燥以将混合物干燥至大约22％水分含量，装袋，并在10℃在大约22％(w/w)水分水平下培育10天。在该阶段结束时，将载体在55伏(55V)下暴露于脉动电磁场处理(PEMF处理-2mV/cm，50Hz下)不同的时间(8、16、24和48小时)或不暴露于PEMF处理(0小时)。PEMF装置为US 6,561,968中教导的装置。在培育期间，细菌菌落增加到2×10⁸至7.1×10⁸个细菌/克沸石。然后在包覆到粒状甜菜种子上前将培养物∶沸石混合物干燥到3％-6％(w/w)水分含量。在16小时内通过强制空气干燥或通过将混合物放置在相对湿度约35％的室中缓慢干燥4天完成将培养物∶沸石混合物干燥到3％-6％(w/w)。
在处理后第2、71和544天(基于菌落形成单位(CFU)/种子)评价甜菜种子上细菌的存活(包括初始存活率和保存期限)。
结果提供在下面的表中和图示在图1(慢干燥)和图2(快干燥)中。