新型重组人白细胞介素2的制备方法及其表达载体和工程菌 本发明涉及利用重组DNA技术生产蛋白质或多肽药物的领域，更具体地，本发明涉及一种新型的125位为丝氨酸的重组人白细胞介素2(IL-2)的制备方法，还涉及有关的表达载体和工程菌。
人白细胞介素2可提高人体对病毒、细菌、真菌、原虫等感染的免疫应答，使细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、天然杀伤细胞(NK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖，并使其杀伤活性增强，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。它还可以增加抗体和干扰素(IFN)等细胞因子的分泌，在机体的免疫应答中具有非常重要的作用，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和提高机体免疫功能等作用。
白细胞介素2作为一种具有广泛的免疫调节作用的细胞因子，不管是全身系统应用、局部应用、与其它细胞因子类生物应答调节剂合用、与化疗药物合用、与LAK细胞合用、与TIL细胞合用等都可以产生较好的抗肿瘤作用；另一方面，IL-2的新剂型、新适应症、和新疗法不断被发现：例如IL-2经PEG化变成PEGIL-2后其血清半衰期延长20倍，抗肿瘤作用大大提高。联合应用IL-2与PEGIL-2治疗肾细癌和黑色素瘤、联合IL-2与异体外周血淋巴细胞的异体激活细胞疗法治疗白血病残留病灶、IL-2激活的NK细胞(A-NK)局部或全身用药治疗肿瘤肝转移、低剂量IL-2增强机体免疫功能治疗HIV病毒感染、低剂量IL-2发挥免疫调节作用治疗肿瘤以减少IL-2的毒性等等。总之，IL-2具有非常广阔地应用前景(曹雪涛。《白细胞介素2的基础与临床》，北京科学技术出版社，北京，1990年12月)。
天然人白细胞介素2分子量为15-17KD，是一个糖基化的蛋白质，由133个氨基酸组成，在组成白细胞介素2的氨基酸中，第58、105和125位是三个半胱氨酸，天然状态下具有生物活性的白细胞介素2分子中第58位与105位的半胱氨酸形成二硫键，维持白细胞介素2空间构象的稳定，第125位上的半胱氨酸呈游离状态。
IL-2用大肠杆菌表达十分合适，因为糖基化对IL-2的活性并无影响。因此，目前IL-2一般采用大肠杆菌来表达生产。表达的IL-2在大肠杆菌胞浆中以包含体(inclusion bodies)形式存在，这种表达方式的表达量一般为10％-40％左右(张智清等。病毒学报，1988；4:165-66.虞建良等。中国科学，1995；25:1063-1070；中华人民共和国专利公开号CN85103306A和CN1109907A)。用这种方法表达出IL-2尽管电泳测出的IL-2表达量较高，但在实际纯化中由于二硫键的错配，使纯化的IL-2不够稳定，终产率很低。
因此，人们设法通过改变IL-2的结构来克服这些缺点。对IL-2的结构研究表明，58位、105位和125位的半胱氨酸对IL-2的构象和生物学活性影响很大。去除或用丙氨酸、丝氨酸等氨基酸取代58或105位的半胱氨酸时，会使白细胞介素2的活性显著下降；当用丙氨酸或丝氨酸取代125位半胱氨酸时，白细胞介素2的生物活性非但不降低，反而有所增强，而且取代后的白细胞介素2稳定性也大大提高。这种改建后IL-2至少有以下几个优点：
第一，提高白细胞介素2的比活性。
第二，提高白细胞介素2的稳定性。由于野生型白细胞介素2分子中125位半胱氨酸是游离的，易于与58或105位的半胱氨酸形成错配的二硫键、或分子间形成二硫键导致二聚体的形成，不利于白细胞介素2的稳定。125位丝氨酸型白细胞介素2则不存在二硫键错配的问题，此外，还可能与稳定了α螺旋F区有关，稳定性有提高。
第三，易于纯化。在重组白细胞介素2的纯化过程中，白细胞介素2要被还原剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素2。由于125位半胱氨酸是游离的，所以易与58或105位的半胱氨酸形成错配的二硫键导致异构体的形成，或分子间形成二硫键导致二聚体的形成。这些形成的异构体和二聚体一方面给纯化工作带来麻烦、另一方面比活性较低。125位半胱氨酸被丙氨酸或丝氨酸取代的白细胞介素2则不存在二硫键错配的问题，因而有利于白细胞介素2的纯化。
第四，降低毒性。125位半胱氨酸被丙氨酸或丝氨酸取代的白细胞介素2由于比活性进一步提高，在给予同等活性的白细胞介素2时，新型白细胞介素2由于蛋白质的绝对数量较少而可能具有较小的毒性，更容易被病人耐受，从而有利于临床治疗的进行。
这种通过改变IL-2的序列来生产非天然IL-2方法已有文献描述(美国专利公开号4517293)。
虽然IL-2的表达工作已开展多年，但是，目前IL-2的表达量和表达活性仍不能十分令人满意。用何种表达载体和宿主细胞来表达天然或非天然IL-2才能使IL-2的表达量和活性最高，一直是本领域技术人员研究的焦点所在。目前IL-2表达量如上所述一般为10-35％,IL-2的比活性一般为1.0×107单位/毫克。
因此，本发明的目的就是提供一种新的表达125位为丝氨酸的新型重组人白细胞介素2的表达质粒，该载体为含有人白细胞介素2序列的原核pBV220载体，其中人白细胞介素2的序列如图1所示。
本发明还提供了被该新型表达载体所转化的宿主细胞，较佳地，该宿主细胞是大肠杆菌。
基于所提供的新型表达载体和/或转化的宿主细胞(工程菌)，本发明还提供了一种制备重组人白细胞介素2的方法，该方法包括：
在培养条件下，培养权利要求4中所述的大肠杆菌宿主细胞，以及
分离纯化，得到所表达的重组人白细胞介素2。
分离纯化步骤，一般包括以下步骤：(a)制备包含体，(b)溶解包含体，(c)凝胶过滤，(d)缓冲液转换，(e)复性，和(f)反相高效液相色谱。
在一个较佳例子中，结合特别设计的分离纯化重组IL-2过程，充分体现出本发明的表达载体和/或工程菌的高效性，其中IL-2表达量42％，获得的纯化后的IL-2纯度大于98％且比活性高达3.0×107国家标准单位/毫克。
本发明的附图包括：
图1是突变的IL-2序列，其中125位的半胱氨酸密码子被突变为丝氨酸密码子。
图2是pGEM-125Ser-rhIL-2载体的构建示意图，其中将125Ser-rhIL-2 cDNA克隆入pGEM-T载体，形成pGEM-125Ser-rhIL-2载体。
图3是表达载体pBV-125Ser-rhIL-2的结构示意图。
图4是几种表达载体的图谱照片，其中泳道1为pBV-125Ser-rhHL-2/BamHⅠ；泳道2为pBV-125Ser-rhIL-2/BamHⅠ+BglⅡ；泳道3为pBV-125Ser-rhIL-2/HindⅢ；泳道4为pBV-125Ser-rhIL-2/EcoRⅠ+BamHⅠ；泳道5为入DNA/HindⅢ。
图5为用pBV-125Ser-rhIL-2转化的DH5α发酵后IL-2表达量的电泳照片。其中泳道M为分子量标记；泳道1-5分别为诱导后0.5小时、1.0小时、2.0小时、3.0小时和4.0小时的表达量。
图6是纯化后IL-2的SDS-PAGE电泳鉴定照片。其中泳道1-3为三批纯化的IL-2(非还原型)；泳道M为低分子量标准蛋白；泳道4-6为三批纯化的IL-2(还原型)。(见图6)
图7是纯化后IL-2的HPLC鉴定图谱。
本发明的发明人发现，通过将IL-2序列克隆入一种载体即pBV220，可十分高效地表达天然或非天然的IL-2。从而在此基础上，完成了本发明。
pBV220是一种表达质粒。要表达的异源蛋白序列被置于PRPL启动子的下游，当热诱导时该PRPL启动子可使位于其下游蛋白序列表达(张智清等.病毒学报，1990；6:111-116)。已有报道表明，一些研究者已用pBV220质粒表达了一些细胞因子(智刚等.病毒学报，1991；7:142-147.周圆等.病毒学报，1993；9:37-42.张智清等，病毒学报，1988；4:165-66)。这些细胞因子的表达效率一般在20％左右。
本发明人将天然IL-2的125半胱氨酸突变为丝氨酸，采用pBV220作为表达载体，表达新型重组入白细胞介素2时，意外地发现，重组的含有IL-2序列的pBV220可高效地表达IL-2，表达量约为40％。
简而言之，本发明新型的表达载体是这样构建的：采用中国人外周血单个核细胞作为人白细胞介素2基因的来源，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得编码125位为丝氨酸的白细胞介素2的eDNA(突变后的白细胞介素2 eDNA序列经测序证实)；将125Ser-rhIL-2 eDNA克隆到原核表达载体pBV220中。经核酸测序证明，IL-2序列是正确，它被克隆至原核表达载体pBV220，受到PRPL启动子的控制，从而构建成重组表达载体pBV-125Ser-rhIL-2；
采用大肠杆菌DH5α作为宿主细胞，用载体pBV-125Ser-rhIL-2转化DH5α细菌，经过反复筛选和表达分析，获得高表达新型白细胞介素2的生产菌株DH5α/pBV-125Ser-rhIL-2。
可用于本发明的宿主细胞宜为原核细胞，更佳地为大肠杆菌，最佳地为大肠杆菌DH5α菌株。
表达载体的转化可采用常规的方法，如氯化钙法、电穿孔法等。选用的培养基可以是本领域的常规使用的培养基。
在本发明中，可用多种方法使携带表达载体的菌株表达IL-2。在下面的实施例4给出了一个优选方案。在一级种子培养中，培养时间一般为12-16，收获时的OD600光吸收应大于约1.0，一般为1.2-1.8。在二级种子培养中，培养时间一般为12-16，收获时的OD600光吸收应大于约2.0。在发酵罐培养中，当收获时的OD600光吸收大于约3.0时，可升高温度以诱导IL-2在热诱导调控元件下进行表达。诱导时间一般为2-8小时，较佳地为2.5-6小时。收获时OD600光吸收一般应大于约7.0，一般为7.5-8.5。这样，获得的IL-2表达量一般占菌体中蛋白的35-43％。
随后的纯化工艺可采用本领域中常规使用的纯化工艺，也可采用本发明人专门设计的纯化工艺，其中纯化工艺包括包含体制备、溶解包含体、凝胶过滤、复性等步骤。在实施例5中给出了一个纯化方案，即用工程菌DH5α/pBV-125Ser-rhIL-2，在本发明人筛选的特定发酵条件下进行发酵，收集菌体粗提后进行Sephacryl S-200凝胶过滤纯化，然后复性，最后进行反相高效液相分离并去除乙腈制成半成品，用本发明人选择的工艺进行纯化，最终可获得程度大于98％的产物新型白细胞介素2。
以下结合实施例和附图，来进一步详细地阐述本发明。下列实施例用于说明目的而并非用于限制本发明范围。在下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、125Ser-rhIL-2 cDNA的PCR克隆
天然成熟的人白细胞介素2由133个氨基酸组成，第58、105和125位为三个半胱氨酸，天然状态下具有生物活性的白细胞介素2分子中第58位与105位的半胱氨酸形成二硫键，维持白细胞介素2的空间构象。
本发明人通过反转录PCR从中国人的健康成人外周血单个核细胞中克隆出人白细胞介素2的cDNA，同时通过PCR突变的方法，即在下游引物中将对应125位Cys的密码子TGT突变为TCT，从而使编码的氨基酸由天然IL-2中的Cys突变为Ser。
本发明所采用的上游引物为：
5’-ag gaa ttcc atg gca cct act tca agt-3’(含EcoRⅠ酶切位点)，
下游引物为：
5’-atggatcc tta tca agt cag agt cga gat gat gct ttg aGa aaa gg-3’(含BamHⅠ酶切位点)(其中，突变的核苷酸用大写表示)。
RT-PCR按常规方法进行，得到的PCR产物被直接克隆至pGEM-T载体(图2)，从而得到重组载体pGEM-125Ser-hIL-2。该重组载体pGEM-125Ser-hIL-2被直接用于DNA测序。DNA测序证实，本发明人所克隆的人白细胞介素2 cDNA序列是正确，在125位实现了预计的Cys→Ser突变(图1)。实施例2、125Ser-rhIL-2表达载体的构建
在该实施例中所采用pBV220原核载体含有PRPL串联启动子，CIts857热诱导表达调控元件等元件。
如图3所示，对实施例1制备的pGEM-125Ser-rhIL-2载体，用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，制备纯化125Ser-rhIL-2基因片段，然后定向克隆至pBV220的EcoRⅠ、BamHⅠ位点，构建成重组表达载体pBV-125Ser-rhIL-2。经酶切鉴定，pBV-125Ser-rhIL-2载体的图谱正确，含有所插入的rhIL-2基因片段(图4)。实施例3.125Ser-rhIL-2表达工程菌的建立及其鉴定
在该实施例中，将pBV-125Ser-rhIL-2载体转化至大肠杆菌DH5α，从而建立表达突变型人IL-2的转化的宿主细胞(工程菌)DH5α/125Ser-rHIL-2。
获得的原始工程菌菌种用含15％甘油的LB培养基保存于-70℃，每支1.0ml。工程菌在LB软琼脂平板上生长呈典型的大肠杆菌菌落特征。为检查工程菌的稳定性，每传20代作一次酶切图谱分析，结果与原始菌种一致，这证明本发明中的工程菌是很稳定的。
该大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α/pBV-125Ser rhIL-2于1997年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国，武汉市，保藏号为CCTCCNo.:M97023。实施例4．发酵(a)种子培养
将菌种0.1ml接种入含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(一级种子培养基)，在摇床中30℃、200rpm培养12-16小时，在OD600光吸收为大于1.0时(在该例子中为1.2)进行收取。
取一级种子培养基中扩增后的种子0.5ml，接种入含250ml二级种子培养基(同发酵培养基)的1L培养瓶中，在摇床中30℃、200rpm培养12～16小时，在OD600光吸收应大于2.0时(在该例子中为2.2)。发酵罐培养
发酵培养基以M9基本培养为基础，添加其它物质，其配方如下：
酪蛋白水解氨基酸 5.0g/L
Na2HPO4 6.0g/L
KH2PO4 3.0g/L
NaCl 3.0g/L
NH4Cl 0.5g/L
用NaOH调PH值至7.2，高压灭菌。
微量元素配方：
FeCl3 125mM
MnSO4 20mM
ZnSO4、 20mM
CuSO4、 20mM
CoCl2、 20mM
H3BO3、20mM
Na2MoO420mM
上述物质分别溶解于1N HCl中，过滤除菌。
临用前无菌加入下述物质：
1MMgSO4 1ml/L
0.1M CaCl2 1ml/L
1mg/ml硫胺素 1ml/L
葡萄糖 5g/L
微量元素 1ml/L
100mg/ml氨苄青霉素 1ml/L
工作体积为10L的发酵罐，接种入500ml培养好的二级种子培养液，开始发酵。发酵参数设置如下：
搅拌速率： 200-400rpm
通气量： 10.0L/分钟
罐压： 6.0PSI
溶解氧： 40％
PH值控制： 6.5
温度： 30.0℃
发酵中用KOH控制PH值；产生过量泡沫时，用Antifoam 204(Sigma)0.2ml消泡；溶氧控制为与搅拌速率级联，溶氧低于40％时自动加快搅拌速度，以满足氧的供应。发酵过程中测定OD600光密度值，监测细菌的生长情况，OD600光密度值为3.0左右时，开始升温至42℃，诱导细菌表达IL-2。
在诱导过程中的不同时间取样，进行SDS-PAGE电泳分析，检测IL-2的表达量，发现在诱导3小时左右时的IL-2表达量最高(图5)。
诱导表达3小时后，此时OD600值为7.5-8.5时收获菌体，这相当于菌体湿重为7～10克/升发酵终产物。IL-2表达量为菌体总蛋白的35～43％(图5)。4℃离心收集菌体，保存于-20℃备用。实施例5．纯化包含体制备
取实施例4中发酵好的冻存菌体50克，加入50mM Tris 2mM EDTA pH 8.3缓冲液250ml，待样品融化后制成悬液，5000rpm离心15分钟收集菌体。
加入含0.1％溶菌酶的50mM Tris 2mM EDTA pH 8.3缓冲液500ml，制成悬液后，静置20分钟。
冰浴下超声，功率300W，占空比为50％，每个循环30秒，总时间为15分钟，处理样品体积为250ml，超声粉碎的细菌经革兰氏染色格后，4℃、7000rpm离心20分钟，收集沉淀。
在收集的沉淀中，加入4M尿素、50mM Tris 2mM EDTA pH 8.3缓冲液200ml，制成悬液，室温下搅拌洗涤30分钟。4℃、7000rpm离心20分钟收集菌体。
再加入4M尿素、50mM Tris 2mM EDTA PH8.3缓冲液200ml，制成悬液，室温下搅拌洗涤30分钟。4℃、7000rpm离心20分钟收集菌体。
加入50mM Tris 2mM EDTA PH8.3缓冲液200ml，制成悬液，室温下搅拌洗涤30分钟。
最后按上述方法用50mM PB 1mMEDTA PH7.0搅拌洗涤菌体一次，离心收集沉淀。溶解包含体
在如上制备的包含体中，加入2％SDS、10mM DTT、1mM EDTA、50mM PBpH 6.8的溶液(按每克包含体加入5ml)，吹打，充分搅拌，直至包含体完全溶解。15℃、7000rpm离心20分钟，取上清，置40℃水浴15分钟，室温冷却备用。凝胶过滤
层析柱为Sephacryl S-200 HP5.0×110cm，样品为上述的包含体溶解液，缓冲液为50mM PB 1mM EDTA 1mM DTT 1％SDS pH 6.8，流速为100ml/小时。收集IL-2活性蛋白峰。缓冲液转换
收集IL-2活性蛋白峰中，加入1M DTT，使DTT终浓度为2.5mM,60℃水浴15分钟，冷却备用。用G-25柱进行缓冲液转换，方法如下：层析柱为SephadexG-25,5.0×10cm，缓冲液为50mM PB 0.1％SDS PH7.0，流速为200ml/小时，收集蛋白峰。复性
收集的活性蛋白峰，测定蛋白浓度，加入50mMPB 0.1％SDSpH7.0，使蛋白终浓度为0.5mg/ml以下，最好小于浓度小于0.1mg/ml。加入1M CuCl2，使终浓度为5μM。室温静置1-2h。加入100mM EDTA，使终浓度为5mM，终止反应。反相高效液相色谱
色谱柱为Waters Delta-pak C4,4.0×10cm，流动相为0.1％TFA水(A)和0.1％TFA(B)乙腈，洗脱方法0％-55％B 10分钟，55％-70％B 45分钟，流速为40ml/分钟，收集相当于60％左右处的蛋白峰。实施例6重组IL-2的鉴定和活性测定
HPLC测定：图6是纯化后IL-2的鉴定图谱，IL-2的活性蛋白峰达100％以上。
用常规方法进行SDS-PAGE电泳测定：纯化后的IL-2进行常规SDS-PAGE电泳，银染后扫描测得IL-2为单一条带。图7是纯化后IL-2电泳图谱。
用常规方法进行N末端氨基酸残基测定：N端15个氨基酸鉴定结果与天然的IL-2完全一致，为APTSSSTKKTQLQLEHLL。
用常规方法进行比活性测定：即采用CTLL-2依赖株、MTT法测定纯化的IL-2活性，测定的活性单位IL-2蛋白质绝对含量之比为比活性(单位为国家标准单位/毫克)。结果表明，采用实施例5方法纯化的IL-2终产品比活性为3.0×107国家标准单位/毫克。