一种提高孢子量的方法.pdf

本发明公开一种提高孢子量的方法，包括步骤：1)获取带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物；2)对所述获取的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物进行灭活处理；3)将经步骤2)灭活处理后的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物添加至低产孢量菌株的培养基中。与现有技术相比，本发明能够解决低产孢量菌株工业化应用中扩大培养的问题，并且成本低廉。

1.  一种提高孢子量的方法，其特征在于，包括步骤：
1)获取带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物；
2)对所述获取的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物进行灭活处理；
3)将经步骤2)灭活处理后的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物添加至低产孢量菌株的培养基中。

2.  根据权利要求1所述的一种提高孢子量的方法，其特征在于，所述步骤1)中的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物含有孢子、菌丝体或培养基物质中的一种或多种。

3.  根据权利要求1所述的一种提高孢子量的方法，其特征在于，所述步骤2)中的灭活处理为利用温度、水分、氧气、射线、压强、化学试剂灭活处理方式中的一种或多种。

4.  根据权利要求3所述的一种提高孢子量的方法，其特征在于，所述利用温度进行灭活处理方式中的条件具体为：温度60℃～150℃，灭活时间5s～24h。

5.  根据权利要求3所述的一种提高孢子量的方法，其特征在于，所述利用压强、温度进行灭活处理方式中的条件具体为：压强0.11MPa，温度121℃，灭活时间30min。

6.  根据权利要求1所述的一种提高孢子量的方法，其特征在于，所述步骤3)中的添加具体为：添加的时间为低产孢量菌株培养阶段的0h～72h，添加量为培养基成分重量的0.01％～100％。

7.  根据权利要求1所述的一种提高孢子量的方法，其特征在于，所述步骤1)中的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物为带有孢子的培养物。

8.  根据权利要求1所述的一种提高孢子量的方法，其特征在于，所述步骤1)中的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物为取走孢子后的培养物废料。

9.  根据权利要求1所述的一种提高孢子量的方法，其特征在于，所述步骤1)中的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物为孢子。

10.  根据权利要求1所述的一种提高孢子量的方法，其特征在于，所述步骤1)中带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物的培养时间为1h～150h。

一种提高孢子量的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵工程领域，尤其涉及在微生物培养过程中的一种提高孢子量的方法。
背景技术
在发酵工程中，米曲霉作为最为重要的工业微生物菌种之一，被广泛用于食品发酵、酶工程等领域，菌种质量是微生物工业中的核心技术。优良的工业菌种，除了具有优良的代谢能力以外，还必须易于扩大培养。因此，在米曲霉菌株的工业化应用中，孢子的形成情况对产品质量起着非常重要的作用，是米曲霉扩大培养的关键性指标。扩大培养的直接目的就是为了获得大量的优良孢子。
如果筛选获得了具有优良性状的菌株，但因产孢量低而满足不了工业化生产使用需求，该菌株也是难以被产业化应用的。因此，提高米曲霉的孢子量一直以来是米曲霉菌种研究中的重要工作，方法主要包括菌种选育和条件控制两个方面。
菌种选育主要指通过诱变、融合等技术手段、结合大量的筛选工作，获得目标菌株。菌种选育的首要目标一般是代谢能力，未有专门通过菌种选育来定向提高产孢量的专利报道。发明人曾在“双亲灭活电融合技术选育酱油生产菌株”一文中通过电融合技术使得曲霉菌种的产孢能力有了比较大的提升。但是，产孢能力与综合酶系等性能之间并无直接关联，选育获得的高产孢子量菌株多数不具有综合酶系性能优良的特征，一些综合酶系性能优良的菌株，也由于产孢量的不足而难以被产业化应用。因此，该方法的优点是提高幅度大、缺点是工作量大且会存在负突变，难以获得高产孢量且综合酶系性能优良的菌种。因而该方法不能直接用于解决低产孢量菌株的工业化应用问题。
条件控制是提高孢子量的重要手段。目前工作中，采用的方法主要包括营养条件(调整碳氮比、微量元素、草木灰等)和环境条件(光照、温度、湿度、磁场等)。如在“磁场对白僵菌菌丝生长和产孢量的影响”一文中利用磁场处理提高了白僵菌产孢量；在“响应面法优化米曲霉产孢工艺条件”一文中通过工艺优化提高了米曲霉的产孢量；在“一种链格孢菌培养基及其制备方法”专利中通过培养基营养成分的优化提高了链格孢菌的产孢量。以上方法的优点是容易实现、缺 点是由于产孢量主要是由菌株本身的基因决定的，因而提升幅度有限，故同样难以解决低产孢量菌株的工业化应用问题。
日本研究人员从米曲霉中分离获得了产孢促进剂物质，表明通过化学合成获得了产孢促进剂的结构类似物，同样具有促进产孢的作用。但是，不论是分离纯化还是人工合成，该物质的应用成本均很高，且难以实现工业应用，因而未有该物质的应用技术报道。
综上，如何提供一种能够提升孢子产量、工作量不大又不致形成负突变，且成本相对较小的孢子量提高方法，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明实施例提供了一种提高孢子量的方法，能够解决低产孢量菌株工业化应用中扩大培养的问题，并且成本低廉。
一种提高孢子量的方法，包括步骤：
1)获取带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物；
2)对所述获取的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物进行灭活处理；
3)将经步骤2)灭活处理后的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物添加至低产孢量菌株的培养基中。
本发明中高产孢量菌株是相对于低产孢量菌株而言，即相对于低产孢量、产孢量少的菌株，能够产生较多孢量的菌株。
优选地，所述步骤1)中的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物含有孢子、菌丝体或培养基物质中的一种或多种。
优选地，所述步骤2)中的灭活处理为利用温度、水分、氧气、射线、压强、化学试剂灭活处理方式中的一种或多种。
优选地，所述利用温度进行灭活处理方式中的条件具体为：温度60℃～150℃，灭活时间5s～24h。
优选地，所述利用压强、温度进行灭活处理方式中的条件具体为：压强 0.11MPa，温度121℃，灭活时间30min。
优选地，所述步骤3)中的添加具体为：添加的时间为低产孢量菌株培养阶段的0h～72h，添加量为培养基成分重量的0.01％～100％。
优选地，所述步骤1)中的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物为带有孢子的培养物。
优选地，所述步骤1)中的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物为取走孢子后的培养物废料。
优选地，所述步骤1)中的带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物为孢子。
优选地，所述步骤1)中带有产孢促进剂的高产孢量菌株培养物的培养时间为1h～150h。
本发明中所采用的产孢促进剂，一般为杂环类有机化合物。
从以上技术方案可以看出，本发明实施例具有以下优点：
本发明中，通过利用高产孢量菌株的培养物中带有产孢促进剂，通过将该培养物加入到低产孢量菌株的扩培工艺中，使得低产孢量菌株的产孢量大幅度提高，同时，工作量不大又不致形成负突变，且成本相对较小，解决了低产孢量菌株的产业化应用中的扩培难题，具有很好的应用前景。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种提高孢子量的方法，用于解决低产孢量菌株工业化应用中扩大培养的问题，并且成本相对较为低廉。
为了说明本发明的原理和扩培过程，本发明实施例中的培养以米曲霉和酱油曲霉菌株为例进行说明，本发明实施例中，为了实现提高低产孢量米曲霉或酱油曲霉菌株产孢量的目的，进行了综合的条件控制实验，主要包括原料碳氮比的调整、添加微量元素或无机盐，同时调整培养过程中的光照、温度和湿度等条件，从而确定了最优培养条件。本发明实施例利用高产孢量米曲霉菌株的培养物作为产孢促进剂，灭活后添加到低产孢量菌株的扩培工艺中，从而提高了低产孢量菌株的产孢量。
详细步骤如下：
步骤一：带有产孢促进剂培养物的获取：高产孢量菌株是指在最优培养条件下，比低产孢量菌株的产孢量高出5亿/g干基以上的菌株，且菌株培养物的产孢量越高，其中所含的产孢促进剂越多。将高产孢量菌株的培养物作为产孢促进剂，该培养物可以是含有孢子、菌丝体和培养基物质的混合物，也可以是混合物中的单独一种或多种组分。本发明实施例中选取的用于制备产孢促进剂培养物的高产孢量菌株，可以是一株菌株，也可以是多株菌株的复合。而产孢促进剂培养物的培养基，是能够让高产孢量菌株大量产孢的任何一种培养基，培养时间为1h～150h，以48h～72h为最佳培养时间。
步骤二：带有产孢促进剂培养物添加前的预处理：带有产孢促进剂的高产孢量菌株的培养物在用于添加使用前，需要进行灭活处理。灭活处理的方式可以是利用温度、水分、氧气、压强、化学试剂处理等针对微生物的灭活方式之一或多种组合使用，其中，以温度、压强组合方式、即高压蒸汽灭活方式效果最好，本发明实施例中采用高压蒸汽灭活方式，通过温度和压强的调节对其进行灭活处理，一般灭活的温度选取为60℃～150℃，灭活时间为5s～24h，但以在0.11MPa，温度为121℃下灭活30min为最佳条件。
步骤三：带有产孢促进剂培养物的添加：前述培养物在灭活后用于添加到低产孢量菌株的培养工艺中，一般添加的时间节点为低产孢量菌株培养阶段的0h～72h，以在0h时添加为最优添加时间节点；前述经灭活后的带有产孢促进剂的培养物的添加量为低产孢量菌株培养基成分重量的0.01％～100％，最佳添加量根据不同菌株对碳氮比和产孢促进剂培养物的需求而不同。
本发明实施例中采用的米曲霉和酱油曲霉菌株来源于申请人实验室菌种保藏中心，由申请人实验室选育获得，但不限于该实验室选育、保藏的菌株。
本发明实施例培养采用的是米曲霉或酱油曲霉，但不限于米曲霉或酱油曲霉，同样适用于黑曲霉等其他产孢微生物菌种。
本发明实施例采用的是高产孢量米曲霉菌株的培养物，但不限于该培养物，同样适用于对培养物进行再加工后的产物。
本发明实施例中采用的高产孢量米曲霉菌株的培养物的蛋白原料包括食用豆类作物，糖类原料包括食用淀粉类作物。
本发明实施例中，通过利用带有产孢促进剂的高产孢量米曲霉菌株的培养物， 低产孢量米曲霉或酱油曲霉菌株的产孢量一般会由30～40亿/g干基提高到了60～70亿/g干基，大幅度提高低产孢量菌株的产孢量，解决了低产孢量米曲霉和酱油曲霉菌株的产业化应用中的扩培难题，具有很好的应用前景。
而且，利用取走孢子后的培养物废料作为产孢促进剂，亦能实现低产孢量米曲霉和酱油曲霉菌株孢子量的高产，实现了变废为宝，降低了成本，具有很好的应用效果。
下面以四个具体的实施例进行说明。
实施例一
最优培养条件下，高产孢量米曲霉菌株培养物的产孢量为115～120亿/g干基，低产孢量米曲霉菌株在不添加产孢促进剂的情况下，培养物的产孢量为35～40亿/g干基。将高产孢量菌株培养物烘干到一定水分，备用；采用谷糠、麸皮、面粉为主要培养基原料，添加麸皮重量10％的高产孢量菌株培养物代替相应重量的麸皮，润水并拌料均匀后，121℃，0.11MPa高温蒸汽灭菌30min后，冷却至常温，接种低产孢量米曲霉菌株后培养72h。
培养基中分别添加不同麸皮重量比例的高产孢量菌株培养物，检测低产孢量菌株培养物的孢子数和发芽率。主要指标见表1：
表1 添加不同比例麸皮重量的高产孢量菌株培养物来培养低产孢量菌株的培养物指标(一)

实施例二
最优培养条件下，高产孢量米曲霉菌株培养物的产孢量为90～100亿/g干基，低产孢量米曲霉菌株在不添加产孢促进剂的情况下，培养物的产孢量为35～40亿/g干基。将高产孢量菌株的培养物取走孢子后，收集剩余培养物，烘干到一定水分，备用；采用谷糠、麸皮、面粉为主要原料，添加麸皮重量10％的培养物代替相应重量的麸皮，润水并拌料均匀后，121℃，0.11MPa高温蒸汽灭菌30min后，冷却至常温，接种低产孢量米曲霉菌株培养72h。
培养基中分别添加不同麸皮重量比例的高产孢量菌株培养物，检测低产孢量菌株培养物的孢子数和发芽率。主要指标见表2：
表2 添加不同比例麸皮重量的高产孢量菌株培养物来培养低产孢量菌株的培养物指标(二)

实施例三
最优条件下，高产孢量米曲霉菌株培养物的产孢量为115～120亿/g干基，低产孢量酱油曲霉菌株在不添加产孢促进剂的情况下，培养物的产孢量为25～30亿/g干基。将高产孢量菌株的培养物取走孢子后，收集剩余培养物，烘干到一定水分，备用；采用谷糠、麸皮、面粉为主要原料，添加麸皮重量10％的培养物代替相应重量的麸皮，润水并拌料均匀后，121℃，0.11MPa高温蒸汽灭菌30min后，冷却至常温，接种低产孢量酱油曲霉菌株培养72h。
培养基中分别添加不同麸皮重量比例的高产孢量菌株培养物，检测低产孢量菌株培养物的孢子数和发芽率。主要指标见表3：
表3 添加不同比例麸皮重量的高产孢量菌株培养物来培养低产孢量菌株的培养物指标(三)

实施例四
最优条件下，高产孢量米曲霉菌株1培养物的产孢量为115～120亿/g干基，高产孢量米曲霉菌株2培养物的产孢量为90～100亿/g干基，低产孢量酱油曲霉菌株在不添加产孢促进剂的情况下，培养物的产孢量为25～30亿/g干基。将高产孢量菌株的培养物取走孢子后，收集剩余培养物，烘干到一定水分，备用；采用 谷糠、麸皮、面粉为主要原料，添加麸皮重量10％的培养物代替相应重量的麸皮，润水并拌料均匀后，121℃，0.11MPa高温蒸汽灭菌30min后，冷却至常温，接种低产孢量米曲霉菌株培养72h。
培养基中分别添加不同麸皮重量比例的高产孢量菌株培养物，检测低产孢量菌株培养物的孢子数和发芽率。主要指标见表4：
表4 添加不同比例麸皮重量的高产孢量菌株培养物来培养低产孢量菌株的培养物指标(四)

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。