人白介素6核转录因子表达质粒系列及其在肿瘤治疗中的应用 本发明涉及基因工程和基因治疗领域，是关于一种人白介素6核转录因子(NF-IL6)表达质粒系列及其在肿瘤治疗中的应用。
现有的肿瘤治疗药物因毒性和副作用大(如化疗药物)和效果低(如中草药及其制剂)，不能满意地控制肿瘤和挽救病人的生命。
本发明人在研究工作中发现了外源的人白介素6核转录因子在某些恶性细胞中的人工表达引起这些恶性细胞凋亡的现象，该工作已发表在[Zhu Min-sheng and Liu Ding-gan et al.,DNA and Cell Biology,1997,16(2):127-135]。国际上也公布了NF-IL6是巨噬细胞发挥其杀灭细菌和恶性细胞的功能所必需的研究结果[Tanaka,T.et al.,Cell,1995,80(2):353-361]。这些研究结果显示，NF-IL6基因可能被用来治疗恶性肿瘤。
为了使NF-IL6基因能在恶性细胞和有关效应细胞中表达，需要将它与质粒载体相连接。质粒载体是目前普遍用于分子生物学和基因工程研究的一种工具DNA；它们具有使人工插入的基因能够表达(即转录成信息核糖核酸[mRNA]，再按照mRNA提供的遗传信息合成起生理作用的蛋白质)的全部元件(如参见[Sambrook et al.,Molecular cloning:A Laboratory Manual.2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,1989])。因此，设计构建含有NF-IL6基因的表达质粒系列，并对其在肿瘤治疗中的应用进行研究，是很有意义和实用价值的。
本发明的目的是提供NF-IL6表达质粒系列，该质粒能抑制体内肿瘤的生长，可应用于肿瘤的治疗。
本发明提供地NF-IL6表达质粒系列(也称为“14-6RS”)是根据本发明人和国际上关于肿瘤表型和基因表达的研究结果设计和构建的，它具有下列基本结构：
基本结构1见图1，它是由启动子，NF-IL6编码区，DNA序列1,polyA信号和DNA序列2顺序连接而成的环状双链DNA分子，其中：
NF-IL6编码区=人白介素6核转录因子基因的编码区；
启动子=任何真核基因的启动子，它是启动它下游紧邻之基因的表达的元件，例如SV40病毒早期启动子；SV40病毒晚期启动子；巨细胞病毒启动子；金属硫蛋白基因的启动子；肌球蛋白基因的启动子；腺病毒启动子；痘苗病毒启动子；疱疹病毒启动子；流感病毒启动子；肌动蛋白基因的启动子；胶原蛋白基因的启动子；乳头状瘤病毒启动子；多瘤病毒启动子；甲胎蛋白基因的启动子；癌胚抗原基因的启动子；小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子等。
DNA序列1=任何真核质粒载体的介于多克隆位点和polyA信号之间的DNA序列，一般含有mRNA(信息核糖核酸)的剪接信号；
polyA信号=任何真核质粒载体的polyA信号，它是mRNA的polyA(多腺嘌呤核苷酸)尾的起始位点；
DNA序列2=任何真核质粒载体的介于polyA信号和启动子之间的DNA序列，一般含有质粒载体DNA的复制起始位点，也可含有抗生素抗性基因，包括使细菌获得对某种抗生素的抗性的基因(如氨基苄青霉素抗性基因amp，四环素抗性基因tet，卡那霉素抗性基因kan等)，或使真核细胞获得对某种抗生素的抗性的基因(如抗生素G418抗性的基因neo等)。
以上所述的任何真核质粒载体，可用下列质粒为例：pSV.SPORT1,pSPORT1,pMSEx-1,pMSEx-2,pMSEx-3,pcDNA3,pSFV1,pCDV-1,pSVK3,pBPV,pMSG等。
基本结构2见图2，是由DNA序列2(一部分)，启动子，NF-IL6编码区，DNA序列1,polyA信号和DNA序列2(另一部分)顺序连接而成的的线型双链DNA分子，其中：
NF-IL6编码区=人白介素6核转录因子基因的编码区；
启动子=任何真核基因的启动子，它是启动它下游紧邻之基因的表达的元件，例如SV40病毒早期启动子；SV40病毒晚期启动子；巨细胞病毒启动子；金属硫蛋白基因的启动子；肌球蛋白基因的启动子；腺病毒启动子；痘苗病毒启动子；疱疹病毒启动子；流感病毒启动子；肌动蛋白基因的启动子；胶原蛋白基因的启动子；乳头状瘤病毒启动子；多瘤病毒启动子；甲胎蛋白基因的启动子；癌胚抗原基因的启动子；小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子等。
DNA序列1=任何真核质粒载体的介于多克隆位点和polyA信号之间的DNA序列，一般含有mRNA(信息核糖核酸)的剪接信号；
polyA信号=任何真核质粒载体的polyA信号，它是mRNA的polyA(多腺嘌呤核苷酸)尾的起始位点；
DNA序列2=任何真核质粒载体的在polyA信号下游和/或启动子上游的DNA序列，一般含有质粒载体DNA的复制起始位点，也可含有抗生素抗性基因，包括使细菌获得对某种抗生素的抗性的基因(如氨基苄青霉素抗性基因amp，四环素抗性基因tet，卡那霉素抗性基因kan等)，或使真核细胞获得对某种抗生素的抗性的基因(如抗生素G418抗性的基因neo等)。
以上所述的任何真核质粒载体，可用下列质粒为例：pSV.SPORT1,pSPORT1,pMSEx-1,pMSEx-2,pMSEx-3,pcDNA3,pSFV1,pCDV-1,pSVK3,pBPV,pMSG等。
本发明的NF-IL6表达质粒系列是用基因工程的方法构建的。将含有启动子，polyA位点，质粒复制起点，抗生素抗性基因和其它调控序列的质粒载体用适当的限制性内切酶切成线型；NF-IL6编码区也用限制性内切酶从克隆有NF-IL6基因的质粒切下，纯化并经适当处理；然后用DNA连接酶将二者连成环状，转化细菌并扩增后，提取质粒并加以纯化，即得。最终的产物为纯的质粒DNA，不含任何蛋白，多糖(包括热原)。
如将纯化的质粒在上述DNA序列2的区域内用适当的限制性内切酶酶解切断，即得线型的质粒。
以下的实施例中将以pSN,pCN,pVN,pTN和pGN为例，详细描述制备方法。其它结构的“14-6RS”均可参照该例，用一般的基因工程方法制备。
本发明的“14-6RS”以pSN为例经过对实验动物所荷的人类肿瘤的治疗实验，证明其能有效地抑制肿瘤生长，甚至使肿瘤消失而痊愈，而无明显副作用。例如对裸小鼠皮下接种人肝癌细胞所形成之肿瘤，每瘤单次注射1-10微克“14-6RS”,3天后均能观察到肿瘤逐渐缩小并趋于消失，而对照的肿瘤则在增长；对裸小鼠腹腔接种人胃癌细胞后，每鼠腹腔单次注射10微克“14-6RS”，半月后，对照者腹腔内大量出血，解剖发现肿瘤大而坏死，而注射“14-6RS”者解剖示1/3无病变，2/3肿瘤显著小于对照；对裸小鼠皮下接种人肺癌细胞所形成之肿瘤，每瘤注射1-10微克“14-6RS”，观察到瘤的增殖比对照显著减慢。
因而，本发明的NF-IL6表达质粒系列是一种具有在体内使肿瘤缩小和/或消失的功能的质粒DNA。使用含不同启动子的质粒载体构建本发明表达质粒系列，将使其可能治疗不同组织中的各种恶性肿瘤，例如含甲胎蛋白启动子的表达质粒，特别适用于治疗肝癌。将它注射到荷有各种人恶性肿瘤的裸小鼠的肿瘤部位或其附近，与对照相比，肿瘤明显地缩小甚至消失。它使用的有效剂量很低，在荷瘤裸鼠中，一般每个瘤注射数微克即能抑制肿瘤增殖。在至今的观察中，注射“14-6RS”的动物未见明显毒性反应和药物副作用。因此，“14-6RS”可被开发为一种高效而安全的基因药物，以应用于各种肿瘤的治疗和预防。
附图说明：
图1是NF-IL6表达质粒系列的基本结构1(环状)。
图2是NF-IL6表达质粒系列的基本结构2(线型)。
图3是质粒pSN构建方法的流程图。
图4是质粒pCN构建方法的流程图。
图5是质粒pVN构建方法的流程图。
图6是质粒pTN构建方法的流程图。
图7是质粒pGN构建方法的流程图。
图8是质粒pSN对人肝癌裸鼠种植瘤的治疗曲线与对照组的结果曲线图。
图9是质粒pSN对人胃癌裸鼠种植瘤的治疗实验(1)，鼠框中：右面为治疗有效的裸鼠，左面为濒死的裸鼠。
图10是质粒pSN对人胃癌裸鼠种植瘤的治疗实验(2)，裸鼠的解剖：右面为治疗有效的裸鼠，左面为病死的裸鼠。
图11是质粒pSN对人肺癌裸鼠种植瘤的治疗结果曲线与对照组的曲线图。
本发明通过以下实施例作进一步描述，但并不限止本发明的范围。
实施例1质粒pSN的构建方法a．质粒载体和NF-IL6基因片段的准备
1．取质粒pMSEx-l(德国Schuemann博士赠，含有SV40病毒早期启动子)0.5μg(0.5μl)，加10X限制性内切酶StuI缓冲液2μl，灭菌水17μl和限制性内切酶StuI 1μl，混合，37℃保温1小时进行酶反应。反应液用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀质粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HClpH8.0-1m mol/L EDTA。
2．取上述溶解的pMSEx-19μl,10X小牛肠碱性磷酸酯酶缓冲液1μl和小牛肠碱性磷酸酯酶0.5μl，混合，37℃保温30分钟进行酶反应。反应液加1μl 50m mol/L EDTA,75℃加热10分钟，然后用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀质粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA，是为A液。
3．取质粒pBlue610(日本审良静男博士赠)0.5μg(0.5μl)，加10X限制性内切酶SalI缓冲液2μl，灭菌水17μl和限制性内切酶SalI 1μl，混合，37℃保温1小时进行酶反应。反应液中加2μl含dATP,dCTP,dTTP和dGTP各10m mol/L的溶液，以及1μl T4 DNA聚合酶，继续保温20分钟。反应液用0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切下1.0kb区带，从凝胶中提取出质粒DNA，用苯酚/氯仿抽提1次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀质粒，溶于10μl的10mmol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA备用，是为B液，即平头的NF-IL6编码区。b．平头NF-IL6编码区和质粒载体pMSEx-1的连接，细菌转化和鉴定
取A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA连接酶缓冲液2μl,10m mol/L ATP2μl和T4 DNA连接酶2μl，混合，4℃保温过夜。次日，取2μl反应液转化大肠杆菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，培养过夜，随机挑取集落，用1ml LB液体培养基扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶EcoRI酶解，反应液用0.7％普通琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现1.3kb插入片段的质粒，即为质粒pSN。可保存和扩增备用。
以上过程如图3所示。
实施例2质粒pCN的构建方法a．质粒载体和NF-IL6基因片段的准备
1．取质粒pcDNA3(源自Invitrogen公司，含有SV40病毒早期启动子)0.5μg(0.5μl),10X限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，灭菌水16μl，限制性内切酶EcoRI 1μl和限制性内切酶XhoI 1μl，混合，37℃保温1小时进行酶反应。反应液用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀质粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA,是为A液。
2．取质粒pBlue610 0.5μg(0.5μl),10X限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，灭菌水.17μl，限制性内切酶EcoRI 1μl和限制性内切酶XhoI 1μl，混合，37℃保温1小时进行酶反应。反应液用0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切下1.0kb区带，从凝胶中提取出质粒DNA，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1mmol/LEDTA备用，是为B液，即NF-IL6编码区。b．NF-IL6编码区和质粒载体pcDNA3的连接和细菌转化
取A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA连接酶缓冲液2μl,10m mol/L ATP2μl和T4 DNA连接酶1μl，混合，16℃保温过夜进行酶反应。次日，取1μl反应液转化大肠杆菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，培养过夜，随机挑取集落，用1ml LB液体培养基扩增细菌，抽提质粒，各质粒均用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶解，反应液用0.7％普通琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现约1.0kb插入片段的质粒(不必另行鉴定)，即为质粒pCN。可保存和扩增备用。
以上过程如图4所示。
实施例3质粒pVN的构建方法a．质粒载体和NF-IL6基因片段的准备
1．取质粒pSV.SPORT1(购自GibcoBRL公司，含有SV40病毒早期启动子)0.5μg(0.5μl),10X限制性内切酶SalI缓冲液2μl，灭菌水17μl和限制性内切酶SalI 1μl，混合，37℃保温1小时进行酶反应。反应液用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀质粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1mmol/L EDTA。
2．取上述溶解的pSV.SPORT1 9μl,10X小牛肠碱性磷酸酶缓冲液1μl和小牛肠碱性磷酸酶0.5μl，混合，37℃保温30分钟进行酶反应。反应液加1μl 50m mol/L EDTA,75℃加热10分钟，然后用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀质粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA，是为A液。
3．取质粒pBlue610 0.5μg(0.5μl),10X限制性内切酶SalI缓冲液2μl，灭菌水17μl和限制性内切酶SalI 1μl，混合，37℃保温1小时进行酶反应。反应液用0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切下1.0kb区带，从凝胶中提取出质粒DNA，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA备用，是为B液，即NF-IL6编码区。b．NF-IL6编码区和质粒载体pSV.SPORT1的连接，细菌转化和鉴定
取上述A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA连接酶缓冲液2μl,10mmol/LATP 2μl和T4 DNA连接酶1μl，混合，16℃保温过夜进行酶反应。次日，取1μl反应液转化大肠杆菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，培养过夜，随机挑取集落，用1ml LB液体培养基扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶SalI酶解，反应液用0.7％普通琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现约1.0kb插入片段的质粒，进一步提纯，以便鉴定。c．正向插入的重组质粒的鉴定
取在b步得到的重组质粒9μl，加10XEcoRI酶缓冲液1μl和EcoRI酶4单位，混合，37℃保温2小时进行酶反应，反应液用0.7％普通琼脂糖凝胶电泳分离，选择不出现约1.0kb片段的重组质粒，此即为质粒pVN。可保存和扩增备用。
以上过程如图5所示。
实施例4．质粒pTN的构建a．质粒载体和NF-IL6基因片段的准备
1．取质粒pSMT(中国科学院动物研究所沈孝宙教授赠，该质粒含有金属硫蛋白基因启动子)0.5μg(0.5μl),10X限制性内切酶缓冲液A(Boehringer-Mannheim公司)2μl，灭菌水17μl和限制性内切酶SmaI 1μl，混合，25℃保温2小时进行酶反应，然后加限制性内切酶KpnI 1μl,37℃继续保温2小时。反应液用苯酚/氯仿抽提1次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀质粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA,是为A液。
2．取质粒pBlue610 0.5μg(0.5μl),10X限制性内切酶缓冲液A2μl，灭菌水17μl和限制性内切酶SmaI 1μl，混合，25℃保温2小时进行酶反应，然后加限制性内切酶KpnI 1μl,37℃继续保温2小时。反应液用0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切下1.0kb区带，从凝胶中提取出质粒DNA，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA备用，是为B液，即NF-IL6编码区。b．NF-IL6编码区和质粒载体pSMT的连接和细菌转化
取A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA连接酶缓冲液2μl,10m mol/L ATP2μl和T4 DNA连接酶1μl，混合，4℃保温过夜进行酶反应。次日，取1μl反应液转化大肠杆菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，培养过夜，随机挑取集落，用1ml LB液体培养基扩增细菌，提取质粒，各质粒均用限制性内切酶SmaI和KprI双酶解，反应液用0.7％普通琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现约1.0kb插入片段的质粒(不必另行鉴定)，即为质粒pTN。可保存和扩增备用。
以上过程如图6所示。
实施例5．质粒pGN的构建a．质粒载体和NF-IL6基因片段的准备
1．取质粒pMSG(Pharmacia Biotech公司，该质粒含有小鼠乳腺肿瘤病毒[MMTV]启动子)0.5μg(0.5μl),10X限制性内切酶缓冲液A(Boehringer-Mannheim公司)2μl，灭菌水17μl和限制性内切酶SmaI 1μl，混合，25℃保温2小时进行酶反应，然后加限制性内切酶XhoI 3μl,37℃继续保温2小时。反应液用苯酚/氯仿抽提1次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀质粒，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA，是为A液。
2．取质粒pBlue610 0.5μg(0.5μl),10X限制性内切酶缓冲液A2μl，灭菌水17μl和限制性内切酶SmaI 1μl，混合，25℃保温2小时进行酶反应，然后加限制性内切酶XhoI 3μl,37℃继续保温2小时。反应液用0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切下1.0kb区带，从凝胶中提取出质粒DNA，溶于10μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA备用，是为B液，即NF-IL6编码区。b．NF-IL6编码区和质粒载体pMSG的连接和细菌转化
取A液5μl,B液10μl,10XT4 DNA连接酶缓冲液2μl,10m mol/L ATP2μl和T4 DNA连接酶1μl，混合，16℃保温过夜进行酶反应。次日，取1μl反应液转化大肠杆菌DH5α，涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，培养过夜，随机挑取集落，用1ml LB液体培养基扩增细菌，提取质粒，各质粒均用限制性内切酶SmaI和XhoI双酶解，反应液用0.7％普通琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现约1.0kb插入片段的质粒(不必另行鉴定)，即为质粒pGN。可保存和扩增备用。
以上过程如图7所示。
实施例6线型质粒pVN的构建
取实施例3构建的质粒pVN 100μg(100μl)，加10×限制性内切酶PvuI缓冲液20μl，灭菌水70μl和限制性内切酶PvulI 10μl(100单位)，混合，37℃保温2小时进行酶反应。反应液用苯酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀质粒，溶于100μl的10m mol/L Tris.HCl pH8.0-1m mol/L EDTA，即得线型质粒pVN。可保存备用。
实施例7：质粒pSN对人肝癌裸鼠种植瘤的治疗实验
裸小鼠15只，皮下每注射点接种107人肝癌SMMC7721细胞。1周后，均形成肿瘤。每4只为一组(不注射任何药物的对照组为3只)，各组分别在肿瘤部位注射如下物质：
0.1组……………pSN 0.1μg加脂质体50μg
1组……………pSN 1μg加脂质体50μl
10组……………pSN 10μg加脂质体50μl 对照组……………0
注射后，每隔3天测量一次各肿瘤的长径(a)和短径(b)，并按下列公式计算肿瘤体积V：
V=0.4ab2。结果表明，注射了pSN的肿瘤均停止增殖而趋于缩小，部分肿瘤最后消失。如表1和图8所示。
表1 质粒pSN对人肝癌裸鼠种植瘤的治疗实验注射后天数 0.1组 1组 10组 对照组 0 1 1 1 1 3 0.49+-0.41 0.53+-0.11 0.66+-0.10 0.94+-0.21 6 0.21+-0.20 0.21+-0.08 0.24+-0.14 1.7+-0.56 9 0.06+-0.04 0.11+-0.08 0.04+-0.05 1.9+-0.67表中数据为观察日肿瘤体积和注射时该肿瘤体积之比(平均值+-标准差)，以该实施数据作曲线图8。
实施例8质粒pSN对人胃癌裸鼠种植瘤的治疗实验(1)
裸小鼠12只，各腹腔注射6×106个人胃癌MKN-45细胞，一周后对其中8只各腹腔注射10μg pSN加脂质体50μl和生理盐水250μl，其余4只为对照。8天后观察，结果如下：
a)4只对照鼠全部处于濒死状态，腹部膨隆，解剖发现大量腹腔内出血(见图9)；
b)12只治疗鼠中，5只也处于濒死状态，腹部膨隆，解剖发现大的肿瘤和大量腹腔内出血；4只表现活泼，解剖也发现有肿瘤和内出血，但程度比对照显著轻；3只与正常鼠无异，解剖亦未发现肿瘤，说明被治愈(见图10)。因此pSN的注射能显著减慢肿瘤增殖速度，甚至治愈肿瘤。
实施例9质粒pSN对人肺癌裸鼠种植瘤的治疗实验(2)
裸小鼠6只，各皮下注射107个人肺癌SPC-A-1细胞，一周后，均形成肿瘤。将荷瘤鼠平均分为3组，1组为对照，其余2组分别在肿瘤部位注射pSN0.1μg和1μg。每隔2-3天测量一次各肿瘤的长径(a)和短径(b)，并按下列公式计算肿瘤体积V：
V=0.4ab2。结果表明，注射了pSN的肿瘤的增殖速度较对照显著减慢，如表2和图11所示。
表2 质粒pSN对人肺癌种植瘤的治疗实验注射后天数 0.1组 1组 对照组
0 1 1 1
4 2.19+-1.11 0.80+-0,48 3.53+-1.11
6 2.15+-0.16 1.40+-0.58 6.18+-1.63
8 6.45+-3.45 2.63+-0.76 9.78+-4.47
12 9.38+-3.76 5.48+-1.74 16.2+-6.44表中数据为观察日肿瘤体积和注射时该肿瘤体积之比(平均值+-标准差)，以该实验数据作曲线图11。