苏糖酸及其盐的新用途 【发明领域】
本发明涉及L-苏糖酸及其衍生物和盐(L-苏糖酸钙及有毒重金属盐除外)在制备预防和治疗骨质疏松的药物中的用途。技术领域
骨质疏松是老年人常见的骨病之一，该疾病的发生与年龄增长及激素水平下降、钙代谢障碍等多种因素有关。其最终结果是骨形成明显减少，骨吸收大于骨形成，骨量减少，骨生物力学性能降低，容易导致骨折。因此，增加骨形成，减少骨吸收，使骨量增加是治疗骨质疏松的重要途径。
现有技术公开了多种治疗骨质疏松的方法，包括补充钙和激素(尤其雌激素)等。但单纯补充钙或者激素的疗效并不能达到理想。发明内容
本发明的目的是提供L-苏糖酸及其衍生物和盐(L-苏糖酸钙及有毒重金属盐除外)在制备预防和治疗骨质疏松的药物中的用途。
L-苏糖酸钙在制备治疗骨质疏松的药物中的用途是已知的，并获得了中国专利，当时认为，L-苏糖酸钙的抗骨质疏松活性源于它是一种有机钙。发明人经过进一步研究发现，L-苏糖酸以及它的非钙盐也具有很强的抗骨质疏松生物活性，并由此完成了本发明。
本发明以连续给予雄性大鼠维甲酸70mg/kg两周，停药2周，造成骨质疏松模型。从骨密度、骨生物力学，血尿生化和骨计量学四个方面的指标，观察了连续给予苏糖酸钠2.3g/kg对骨质疏松大鼠的治疗作用，并另设钙尔奇D(碳酸钙+VD)(300mg钙、62.5国际单位VD/kg)、柠檬酸钙(300mg钙/kg)和羟乙磷酸钠(100mg/kg)三组为阳性对照组。
造成模型后，模型对照组与空白对照组相比，大鼠股骨密度明显下降(p＜0.01)，说明骨质疏松造模成功。
给药10周后，模型对照组的骨密度继续有所下降，与空白对照组和给药前相比均有统计的差异(p＜0.01)，股骨的骨钙含量、骨面积与空白对照组相比也明显降低，说明此模型在实验期间能够维持稳定的骨质疏松状态。
研究结果表明，连续给予苏糖酸钠10周，对骨质疏松的多项病理指标均表现良好的改善作用，能显著提高大鼠股骨地骨密度(与给药前相比，p＜0.01)，与模型对照组相比，能显著增加大鼠股骨的骨密度和骨钙含量；与模型对照组相比，可增加骨小梁密度，增加骨小梁厚度；与给药前相比，能够显著减少给药后尿吡啶含量(p＜0.01)；与给药前相比，给药后能够减少尿钙含量(p＜0.05)。
柠檬酸钙组对骨小梁密度、骨小梁厚度的影响及生化指标与模型对照组比较未见明显差异，说明单独的补钙制剂对于骨质疏松的治疗不能取得较好的效果。
钙尔奇D属于将补钙与VD作用结合的情况，研究结果表明，其(300mg钙/kg)虽然能改进骨密度、生物力学指标，但同时表现出导致软骨钙化的不良作用。
单独使用羟乙磷酸钠，出现了骨软化症，即大量类骨质堆积。
需要说明的是，本发明所述的L-苏糖酸盐，不包括L-苏糖酸钙以及L-苏糖酸与有毒金属，如铅、镉、汞等形成的盐，例如包括L-苏糖酸与钠、钾、锌、镁、铵、铁、铜、铬等形成的盐。
本发明的L-苏糖酸和L-苏糖酸盐可以采用口服的给药方法，能以各种药物制剂如片剂、胶囊和药学可接受组合物的形式使用。也可以注射剂的形式使用。
根据本发明的药物组合物，可以含有-定量的L-苏糖酸或它的衍生物或盐作为活性成分，也可含有药学可接受的载体，这些药学可接受的载体可以是在现有技术中广泛用于药物中的各种载体，如赋形剂。本发明的药物组合物可以按现有技术中已知的方法如混合、造粒、压片来制备。
本发明的含有L-苏糖酸或其衍生物或盐的药物组合物还可以包括各种药学使用的任选组分，如香味剂、着色剂、甜味剂等。本发明优选含有L-苏糖酸或其衍生物或盐的药物组合物包括高达50wt％，优选80wt％，更优选90wt％的L-苏糖酸或其衍生物或盐，其余为赋形剂和其它任选组分。
L-苏糖酸及其衍生物和盐的用量可以根据具体化合物、病人体重、年龄等因素来决定。例如，L-苏糖酸钠用量可以是0.5克到10克/天。
实验 L-苏糖酸钠对骨质疏松药理作用的研究
一、试验材料
1、药物
L-苏糖酸钠：透明溶液，含量36％，由北京巨能亚太生命科学研究中心提供。
钙尔奇D(成人制剂)：苏州立达制药有限公司生产，含钙量600mg/片(碳酸钙1500mg/片)，VD：125国际单位。
柠檬酸钙：原料，白色粉末，大宇生化公司生产。
羟乙磷酸钠：商品名，邦特磷。成都菊乐制药有限公司，200mg/片。药物均以0.5％CMC-Na配置，给药体积均为10ml/kg。
2、试剂：
维甲酸：东北制药总厂生产。批号：850501。
试剂盒：骨特异性碱性磷酸酶试剂盒(Nletra Biosystems，美国)，尿吡啶试剂盒(N1etra Biosystems，美国)，骨钙素试剂盒(BioSoure EuropeS.A，比利时)。
盐酸四环素：片剂，0.25g/片，中外合资天津飞鹰制药有限公司。
3、动物
Wistar大鼠，雄性，三月龄，约300g，由天津药物研究院动物室提供。
4、纯合成低钙饲料
40％富强粉，40％玉米面，10％酪蛋白，5％花生油，1％纤维素，3％AIN-76混合盐，1％AIN-76混合纤维素，0.3％蛋氨酸。其中钙盐以NaCl代替。含钙量：30mg/100g。磷含量22mg/100g。
二、试验方法
三月龄雄性大鼠90只，250～320g，随机取出12只作为空白对照，给予正常饲料和自来水，其它大鼠灌胃给予70mg/kg/天的维甲酸，给药体积为10ml/kg，并喂饲低钙饲料和去离子水，给药2周后，停药两周造成骨质疏松模型。按体重随机分为5组。
1、模型对照组(组2)，给予生理盐水；
2、钙尔奇D组(组3)，给予300mg钙/kg(VD 62.5国际单位/kg)；
3、柠檬酸钙组(组4)，给予300mg钙/kg；
4、L-苏糖酸钠组(组5)，给予2.3g/kg；
5、羟乙磷酸钠组(组6)，给予100mg/kg。
分别给予药物10周，观察药物对骨质疏松的治疗作用。在停药前第15天和第3天皮下给予盐酸四环素30mg/kg标记，用于测定骨的动态指标。整个试验期间除空白对照组给予正常饲料和自来水，其它5组给予低钙饲料和去离子水。
3.2试验观测指标的测定时间：
给药前指标的测定：测量每只大鼠右侧股骨的骨密度，并收集12h空腹尿样，用于测量尿磷、尿钙、尿吡啶含量。用于确定造成模型的程度。
给药后指标的测定：
1、停药前采集12h空腹尿样本；
2、停药后第二天，股动脉放血采集血样本；
3、处死后立即采骨样本：分离大鼠两后腿的股骨和胫骨，从关节面分离，右侧股骨标号冷冻用于测量骨密度和进行其它试验，左侧股骨固定于75％乙醇溶液中，用于骨计量学的测定，两侧胫骨固定于10％福尔马林溶液，用于生物力学测定。
3.3指标测定方法：
1、骨密度测定：以双能X线骨密度仪(HOLOGIC公司，QDR-4500W)测定试验大鼠右侧股骨骨密度。给药前以1％戊巴比妥钠0.8ml/kg麻醉，便于活体测定。给药后，大鼠放血处死，从胯关节至膝关节分离大鼠右侧股骨，用于测定骨密度。
2、骨的生物力学测定：以WD-1型电子万能试验机用试验大鼠的胫骨测定骨的抗弯和抗拉能力。由于每只大鼠胫骨的弹性模量无法测定，不能把试验过程中采集到的电位值与力的大小正相关，故以电位值代替力的大小值，以电位值的最高值进行统计，观察药物对骨的生物力学的影响。
3、生化指标的测定：以MRX-II型酶免疫生化仪(美国Dynex公司)用ELISA方法测定血清和尿样中的骨钙素，特异性骨碱性磷酸酶，尿吡啶磷的含量。以全自动生化分析仪(荷兰威图，Selectra)测定血清和尿中的钙、磷含量的含量。
4、骨计量学的测定：
(1)切片方法：各组实验大鼠左侧股骨以75％乙醇固定，每组随机抽取5例标本，逐级脱水后，选择股骨内踝平面塑料包埋、固化；以Jung K型切骨机切片，厚约7um，连续切4片，随机取其中2片分别进行Gemisa、von Kossa染色，待封片后观察各项指标。
(2)观察方法：组织学观察采用Gemisa染色的切片，以普通光源观察；四环素标记观察采用Gemisa染色的切片，以荧光光源观察；类骨质观察采用von Kossa染色的切片，以普通光源观察。
各个股骨内踝标本选择骺板下骨小梁，分内、中、外三点，采用OLYMPUS-BHT荧光显微镜，MPLAS-500彩色病理图文仪利用同济医科大学清平影像公司软件进行图象扫描，录入微机，进行骨组织形态计量学测定。三点的实测值取均值，作为此骨标本的指标值，各标本数据再进行统计学处理。
5、统计方法：试验结果表示为X(均值)±SD(标准差)。给药前后比较，采用配对t-test，组间比较采用非配对t-test。
四、试验结果
4.1骨密度测定的结果：
临床上骨质疏松病人外在基本表现为：骨钙丢失，骨密度下降，骨萎缩，及其并发症-骨生物力学性能下降，易发生骨折(内在性-骨微骨折，外在性-易骨折部位骨折或压缩)。
骨密度既是临床上判定病人骨质疏松程度的基本指标，同时也是判定药物的疗效的重要指标。所以各组试验大鼠给药后对骨密度的改善对判定治疗骨质疏松的疗效具有重要意义。在测量骨密度的同时得到大鼠股骨骨钙含量和骨面积(可视为骨体积)两项指标。以双能X线骨密度仪(DEXA)测定大鼠股骨骨矿含量与单光子骨密度仪(SPA)相比，测定具有准确度高，重复性好的优点。
各组试验大鼠股骨骨密度结果见表1，试验结果表明给药前模型对照组骨密度明显低于空白对照组(p＜0.01)，其它各组与模型对照组相当，未见统计学差异(P＞0.05)，说明骨质疏松模型复制成功。
连续给予药物10周后，模型对照组和空白对照组整个股骨的骨密度与给药前相比略有降低。模型对照组的股骨的骨矿含量，骨体积，骨密度与空白对照组相比明显降低，表明此模型不仅可影响骨的生长，使骨的体积萎缩或生长缓慢，而且可以抑制骨钙沉积，致使骨钙丢失严重，骨密度明显降低(p＜0.01)。
在给予苏糖酸钠后骨密度和骨钙含量与给药前相比显著增加(p＜0.01)，也明显高于模型对照组，说明苏糖酸根能提高钙的利用率，使骨再建/吸收平衡倾向于骨再建，促进骨钙沉积，从而提高骨矿含量，增加骨密度，使骨能正常伸长、加粗。另外，钙尔奇D、柠檬酸钙、羟乙磷酸钠组也能明显增加大鼠的骨密度。
4.2骨的生物力学测定结果
各组试验大鼠的胫骨抗弯和抗拉能力见表2。由表可见，各组对抗弯和抗拉能力与明显差异，本发明的苏糖酸钠组有增加的趋势。钙尔奇D组虽然以碳酸钙为碳源，吸收不好，但加入了VD，故对生物力学具有一定影响。而且注意到，苏糖酸钠组在弹性阶段结束后出现明显的塑性平台，而后再出现塑性阶段，最后断裂，而模型对照组和空白对照组均未出现明显的塑性平台，弹性阶段和塑性阶段分别不明显。从力学角度看，出现塑性平台是因为随着外力的增加，达到一定程度后，骨的弹性消失，骨在外力的作用下，内部骨板或是其它结构之间出现滑动，以抵抗外力的作用，当滑动至极限后，就是骨的塑性阶段，骨出现不可逆的变形，最后断裂。由此可见，骨出现塑性平台，一方面表明骨内部骨钙的排列规则，不是无序的状态，另一方面也说明骨的抗弯能力增强，说明苏糖酸钠具有改善大鼠胫骨抗弯能力的效果。
4.3生化指标的测定结果
为考察苏糖酸钠的作用机制，特观察了各给药组对血、尿生化指标的影响。骨钙素(osteocalcin)和特异性骨碱性磷酸酶(血清热不稳定性碱性磷酸酶serum heat-labile alkal ine phosphatase)均为成骨细胞所产生，其在血清中的含量反映成骨细胞活动程度。尿吡啶交联产物(urinarypyridinium cross-links)显示胶原蛋白分解情况，显示骨的吸收情况。
各给药组骨钙素、特异性骨碱性磷酸酶、尿吡啶，及血清钙、磷、尿钙、磷的含量见表4、5和6。由表中的数据可知，给予苏糖酸钠，尿吡啶明显降低，与给药前相比p＜0.01，与模型对照组相比p＜0.05。说明苏糖酸根对骨的吸收具有较显著的抑制作用；对骨特异性碱性磷酸酶具有降低作用，与模型对照组比较p＜0.01；减少给药后尿钙含量，与模型对照组比较p＜0.05。而其它各给药组血尿生化指标与模型对照组比较无明显差异。
4.4骨计量学测定指标
骨计量学是通过观察骨的微结构的改变来了解骨的生长状态。各组骨组织计量学参数见表7。
由表中数据可知，给予苏糖酸钠10周，大鼠股骨骨小梁密度、厚度有增加的趋势。
钙尔奇D(300mg钙/kg)组，骨小梁密度与模型对照组相比，同样增加明显，但类骨质量明显减少，甚至测定不出，说明钙尔奇D虽然能够增加骨小梁密度，但长期使用有促进软骨矿化的作用。
柠檬酸钙(300mg钙/kg)组，骨小梁密度与模型对照组相比未见明显增加，而且类骨质和骨细胞明显减少，说明单纯给以钙制剂不能对骨质疏松起到好的治疗作用，相反可能由于反馈抑制而影响正常的骨生长。
羟乙磷酸钠组(100mg/kg)组，骨小梁密度与模型对照组相比未见明显变化(p＞0.05)，而且类骨质明显增加，致使骨小梁厚度明显增加，成骨细胞明显增加，破骨细胞明显减少。由于二磷酸盐类药物长期服用具有引发骨软化的可能，本试验已经说明，羟乙磷酸钠已出现此副作用，致使类骨质大量堆积，骨难以钙化，引起上述现象。
表1剂量药前骨密度 药后骨密度药后骨量药后骨体积空白对照组-0.132±0.012** 0.112±0.01 6**#0.145±0.027**1.295±0.091*模型对照组-0.080±0.025 0.068±0.01 10.082±0.0131.197±0.084钙尔奇D组300mg钙/kg0.083±0.020 0.100±0.02 2**0.129±0.040**1.263±0.138柠檬酸钙组300mg钙/kg0.083±0.021 0.106±0.01 8**#0.135±0.036**1.253±0.123羟乙磷酸钙组100mg/kg0.082±0.029 0.093±0.00 8**0.105±0.016**1.133±0.096苏糖酸钠组2.3g/kg0.078±0.023 0.100±0.00 8**##0.123±0.017**1.222±0.100
#，##与给药前相比P＜0.05，0.01 *，**与模型对照组相比P＜0,05，0.01
表2剂量N 拉弹性极限值 拉强度极限值空白对照组-6 334±59* 382±68*模型对照组-4 230±62 272±74钙尔奇D组300mg钙/kg5 340±45* 403±50*柠檬酸钙组300mg钙/kg6 271±56 319±67羟乙磷酸钙组100mg/kg6 146±41* 172±48*苏糖酸钠组2.3g/kg6 255±57 297±68
*为与模型对照组比较P＜0.05，0.01
表3 L-苏糖酸钠对骨质疏松大鼠生物力学参数的影响 剂量(钙/kg) n 弯曲破坏载荷值空白对照组 - 6 474±46*#模型对照组 - 4 304±107钙尔奇D组 300mg钙/kg 5 433±72柠檬酸钙组 300mg钙/kg 6 369±75羟乙磷酸钙组 100mg/kg 6 267±48#苏糖酸钠组 2.3g/kg 6 350±116
*，**为与模型对照组比较P＜0.05，0.01 #，##为与柠檬酸钙组比较p＜0.05，0.01
表4 L-苏糖酸钠对骨质疏松大鼠尿吡啶含量的影响(n＝12)剂量(钙/kg)药前尿吡啶 药后尿吡啶空白对照组-102±14 93±26模型对照组-105±12 93±34钙尔奇D组300mg钙/kg103±15 111±18柠檬酸钙组300mg钙/kg106±20 109±36羟乙磷酸钙组100mg/kg105±18 117±25苏糖酸钠组2.3g/kg107±14 57±19**#
*，**为与给药前比较P＜0.05，0.01 #，##为与模型对照组比较p＜0.05，0.01
表5 L-苏糖酸钠对骨质疏松大鼠尿钙、磷含量的影响(X±SD，n＝12)剂量(钙/kg)药前尿钙药后尿钙药前尿磷 药后尿磷空白对照组-0.29±0.24 0.16±0.0718.64±18.08 19.50±17.43模型对照组-0.42±0.16 0.12±0.12*10.40±10.90 8.35±7.77钙尔奇D组300mg钙/kg0.31±0.17 0.27±0.399.84±3.68 4.92±2.09*柠檬酸钙组300mg钙/kg0.30±0.19 0.40±0.4311.23±8.84 6.88±3.14羟乙磷酸钙组100mg/kg0.29±0.18 0.12±0.07*13.39±13.34 15.27±9.32苏糖酸钠组2.3g/kg0.44±0.23 0.39±0.30#13.83±17.72 7.93±2.58
*与给药前相比p＜0.05，#与模型对照组比较，p＜0.05
表6 L-苏糖酸钠对骨质疏松大鼠血液生化指标的影响(n＝8)剂量(钙/kg)骨钙素 骨特异性碱 磷酶 血钙 血磷空白对照组-0.98±0.10* 10.64±1.00 3.83±1.53 2.87±1.19模型对照组-0.84±0.07 10.83±0.55 2.62±0.37 2.53±0.26钙尔奇D组300mg0.79±0.17 10.36±0.35 3.09±0.39* 1.48±0.14**柠檬酸钙组300mg0.77±0.09 10.46±0.99 3.07±0.25** 1.45±0.19**羟乙磷酸钠组100mg0.93±0.14 9.73±0.93* 2.88±0.13 1.69±0.26**苏糖酸钠组2.3g0.82±0.09 9.71±0.67** 2.89±0.13 1.30±0.16**
*，**与模型对照组比较，p＜0.05，0.01
表7 L-苏糖酸钠对骨质疏松大鼠骨计量学指标的影响剂量(钙/kg)平均骨小梁密度平均骨小梁厚 类骨质比 平均类骨 质宽 成骨细胞 破骨细胞空白对照组-54.18±5.61**108.24±25.05 32.72±6. 43 7.76±1.5 2 40.16±13 .75 21.50±5. 65模型对照组-34.66±7.37100.09±18.96 32.97±4. 63 5.81±1.1 7 52.7 3±6. 98 23.52±6. 43钙尔奇D组300mg52.04±7.01**112.18±31.20 - - 39.98±10 .62 22.16±4. 69柠檬酸钙300mg36.03±4.79120.28±10.30 6.13±2.6 3** 2.00±0.5 3** 10.24±2. 01** 5.92±1.3 3**羟乙磷酸钠组100mg34.96±9.01174.63±35.15** 65. 88±9.80* * 57. 64±18.32 ** 65. 40±13.77 13. 41±5.08*苏糖酸钠组2.3g42.40±7.17128.22±32.28 37.96±7. 08 5.12±1.1 0 44.82±4. 38 21.04±2. 18
*，**与空白对照组相比p＜0.05，0.01
实施例
L-苏糖酸钠400克与预胶化淀粉200克混合，再与硬脂酸镁7克充分混合，然后加入5％PVP(含PVP30克)溶液，混合均匀，制粒，烘干，整粒，压片，制成1000单位片剂。