非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂及其制备方法与用途.pdf

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂及其制备方法与用途，设计合成了一套特异性的引物及Taqman探针和阳性对照，并利用该引物及探针建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR检测体系，可在3～4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地检出非洲猪瘟病毒CP204L基因，可用于来自家猪、野猪和软蜱的各种样本中微量非洲猪瘟病毒CP204L基因的检测。

1.  一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂，其特征在于，包含一对特异性引物、一条特异性探针和一个阳性对照，扩增目标长度为79bp，引物和探针序列为：
上游引物：CP204L-F:5’-GCAGGGCAAGGGTATACTGA-3’ SEQ ID NO.1
下游引物：CP204L-R：5’-CTGTCTCCTCTTCAAACAGCAC-3’ SEQ ID NO.2
探针：CP204L-P:5’-FAM-CCATTCTTCTTGAGCCTG-3’-MGB SEQ ID NO.3
阳性对照：CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGC TCAAGAAGAATGGAATATGATTCTGCATGTGCTGTTTGAAGAGGAGACAGAATCCTC SEQ ID NO.4。

2.  如利要求1所述的非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择非洲猪瘟病毒CP204L基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为：
CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGATTCTGCATGTGCTGTTTGAAGAGGAGACAGAATCCTC；
(2)设计4条引物，以之PCR扩增和制备CP204L基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8如下：
CP204LF1:5’-ATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGATTC-3’
CP204LR1：5’-GAATCATATTCCATTCTTCTTGAGCCTGATGTTCAGTATACCCTTGCCCTGCATATAT-3’
CP204LF2：5’-CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATAC-3’
CP204LR2：5’-GAGGATTCTGTCTCCTCTTCAAACAGCACATGCAGAATCATATTCCATTCTTCTTG-3’
(3)根据CP204L基因阳性对照序列设计多对引物和多条探针,经过大量的对比筛选试验，确定最适的引物对和标记探针组合：
上游引物：CP204L-F:5’-GCAGGGCAAGGGTATACTGA-3’ SEQ ID NO.1
下游引物：CP204L-R：5’-CTGTCTCCTCTTCAAACAGCAC-3’ SEQ ID NO.2
探针：CP204L-P:5’-FAM-CCATTCTTCTTGAGCCTG-3’-MGB SEQ ID NO.3
(4)探针的5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；
(5)经过大量的对比试验和反应条件优选，确定最适的反应条件、引物及探针的特异性和灵敏度。

3.  根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，所述(5)中的最适的反应条件为上、下游引物使用浓度为7.5pmol/μL，探针的使用浓度为2.0pmol/μL，在25μL体系中加入1μL引物及探针，引物及探针的特异性使其区别于猪源其它病毒，灵敏度达到42个拷贝。

4.  如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂在生产标准化试剂盒中的应用。

5.  如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂在绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途。

非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂及其制备方法与用途。
背景技术
非洲猪瘟病毒是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒，基因组长约170kb～193kb，含有151个～165ORF，其中的CP204L基因编码合成一种大小为30KDa的P30蛋白，该蛋白不仅是非洲猪瘟病毒感染宿主细胞早期在胞浆内高效表达的特有蛋白之一，同时也是非洲猪瘟病毒刺激感染动物产生中和抗体抗原性最强的结构蛋白之一(Afonso C.L.,Al caraz C.,Brun A.,Sussman M.D.,Onisk D.V.,Escribano J.M.,Rock D.L.Chara cterization of p30,a highly antigenic membrane and secreted protein of Afri can swine fever virus.Virology.1992；189:368–373，Gomez-Puertas P.,Rodrigu ez F.,Oviedo J.M.,Brun A.,Alonso C.,Escribano J.M.The African swine fev er virus proteins p54and p30are involved in two distinct steps of virus at tachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune resp onse.Virology.1998；243:461–471)。非洲猪瘟病毒是猪的一种急性、高度接触性传染病——非洲猪瘟的病原体，非洲猪瘟病毒感染猪后侵入血流并吸附于血细胞上而迅速散播至全身，猪血液中的非洲猪瘟病毒在5℃保存时,存活18个月，也可在腐败的血清和分泌物中长期保存，在冰冻肉尸内可以存活15周,骨髓中达6个月，这些样本都是非洲猪瘟重要的传播媒介。此外，非洲猪瘟病毒还具有多种自然宿主，包括家猪、野猪和软蜱，在家猪与野猪之间、野猪与软蜱之间以及家猪与软蜱之间存在复杂的感染循环方式(Penrith,M.L.,Vosloo,W.,2009.Review of African swine fever:transmiss ion,spread and control.J.S.Afr.Vet.Assoc.80,58–62.)对这些宿主及污染物中非洲猪瘟病毒CP204L基因的检测，可为非洲猪瘟的监测、诊断与防控提供病原学依据。目前，已建立的非洲猪瘟病毒检测方法包括病毒分离鉴定、病毒抗原检测方法和病毒核酸检测方法(OIE,2008.Chapter 2.8.1.African swine fever.In:Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2008.Office Inter-na tional des Epizooties,Pari France,http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/2008/pdf/2.08.01ASF.pdf.)，非洲猪瘟病毒的分离鉴定试验周期长，不适合快速检测。采用荧光抗体试验和抗原捕获ELISA试验检测非洲猪瘟病毒抗原，具备快速、准确的特点，但对低病毒载量样本缺乏足够的敏感性低，易出现假阴性结果。荧光PCR技术将PCR与荧光检测结合起来，克服了传统PCR费时、易污染和扩增后需电泳检测等缺点，已在非洲猪瘟病毒核酸检测方面得到应用，目前已报道的荧光PCR方法所采用的引物和标记 探针主要是针对非洲猪瘟病毒VP72、P54和K205R基因序列设计制备的(KING D.P.,RE ID S.M.,HUTCHINGS G.H.,GRIERSON S.S.,WILKINSON P.J.,DIXON L.K.,BASTOS A.D.S.&DREW T.W.(2003).Development of aPCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus.J.Virol.Methods,107,53–61.)，而基于非洲猪瘟病毒CP204L基因基因研制的荧光PCR检测试剂及应用还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂及其制备方法与途，具体涉及一种以非洲猪瘟病毒CP204L基因为扩增靶序列而研制的检测试剂，该检测试剂包括一对引物、一条标记探针和一个阳性对照。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是通过以下步骤实现的：一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂，包含一对特异性引物、一条特异性探针和一个阳性对照，扩增目标长度为79bp，引物和探针序列为：
上游引物：CP204L-F:5’-GCAGGGCAAGGGTATACTGA-3’SEQ ID NO.1
下游引物：CP204L-R：5’-CTGTCTCCTCTTCAAACAGCAC-3’SEQ ID NO.2
探针：CP204L-P:5’-FAM-CCATTCTTCTTGAGCCTG-3’-MGB SEQ ID NO.3
阳性对照：CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGATTCTGCATGTGCTGTTTGAAGAGGAGACAGAATCCTC SEQ ID NO.4。
上述的非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择非洲猪瘟病毒CP204L基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为：
CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGATTCTGCATGTGCTGTTTGAAGAGGAGACAGAATCCTC；
(2)设计4条引物，以之PCR扩增和制备CP204L基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8如下：
CP204LF1:5’-ATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGATTC-3’
CP204LR1：5’-GAATCATATTCCATTCTTCTTGAGCCTGATGTTCAGTATACCCTTGCCCTGCATATAT-3’
CP204LF2：5’-CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATAC-3’
CP204LR2：5’-GAGGATTCTGTCTCCTCTTCAAACAGCACATGCAGAATCATATTCCATTCTTCTTG-3’
(3)根据CP204L基因阳性对照序列设计多对引物和多条探针,经过大量的对比筛选试验，确定最适的引物对和标记探针组合：
上游引物：CP204L-F:5’-GCAGGGCAAGGGTATACTGA-3’SEQ ID NO.1
下游引物：CP204L-R：5’-CTGTCTCCTCTTCAAACAGCAC-3’SEQ ID NO.2
探针：CP204L-P:5’-FAM-CCATTCTTCTTGAGCCTG-3’-MGB SEQ ID NO.3
(4)探针的5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；
(5)经过大量的对比试验和反应条件优选，确定最适的反应条件、引物及探针的特异性和灵敏度。
所述(5)中的最适的反应条件为上、下游引物使用浓度为7.5pmol/μL，探针的使用浓度为2.0pmol/μL，在25μL体系中加入1μL引物及探针，引物及探针的特异性使其区别于猪源其它病毒，灵敏度达到42个拷贝。
上述的非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂在生产标准化试剂盒中的应用。
上述的非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂在绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途。
本发明的有益效果是：(1)具有特异、敏感、准确、快速的特点，可用于来自家猪、野猪和软蜱的各种样本中微量非洲猪瘟病毒核酸的检测。(2)本发明中的非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照制备方法，既不涉及非洲猪瘟病毒及其基因组核酸的使用，也不需要人工合成较长的非洲猪瘟病毒CP204L基因DNA片段，具有简便、安全和经济的优势。
附图说明
图1为最适引物对与标记探针对非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照的实时荧光PCR扩增曲线。
图2为最适引物对与标记探针的荧光PCR特异性扩增曲线。
图3为对4.2×10⁸～4.2×10⁰copies/μL浓度范围内的非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照的荧光定量扩增动力学曲线。
图4为非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光定量标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细描述。
本发明的非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂及其制备方法与用途，包括以下步骤。
第一步骤是制备CP204L基因的阳性对照物质，过程包括：
(1)在GenBank数据库中，对CP204L基因序列进行BLAST比对，选择一段保守序列用于CP204L基因阳性对照制备，如SEQ ID NO.4所示。
(2)基于SEQ ID NO.4序列设计合成4条引物，引物序列如下：
CP204LF1:5’-ATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGATTC-3’
CP204LR1：5’-GAATCATATTCCATTCTTCTTGAGCCTGATGTTCAGTATACCCTTGCCCTGCATATAT-3’
CP204LF2：5’-CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATAC-3’
CP204LR2：5’-GAGGATTCTGTCTCCTCTTCAAACAGCACATGCAGAATCATATTCCATTCTTCTTG-3’
(3)以两条互补引物作为扩增模板，另外二条与用作模板的引物序列部分重叠的引物作为扩增引物进行常规PCR扩增；
(4)回收、纯化含有SEQ ID NO.1序列的PCR扩增产物，与PCR2.1克隆载体连接，转化至DH5α大肠杆菌基因工程菌，挑取、提取阳性克隆质粒；
(5)用核酸分析仪进行质量测定，按公式换算成拷贝数，即得已知拷贝数浓度的非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照(质粒)。
第二步骤是设计合成与筛选检测CP204L基因的引物、探针，过程包括：
(1)基于SEQ ID NO.1所示序列，设计合成多对引物和多个标记探针；
(2)以第一步骤制备的1000倍稀释的CP204L基因阳性对照质粒为模板，采用Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)荧光PCR反应扩增试剂及推荐的反应扩增条件，在Light480荧光PCR仪对所设计合成的多对引物和标记探针进行筛选试验；
(3)在相同荧光PCR反应扩增试剂及推荐的反应扩增条件下,以出现最小的Ct值、最高荧光强度增加值(ΔRn)以及典型的S型扩增曲线的综合判定标准，扩增曲线见图1，最终确定的检测非洲猪瘟病毒CP204L基因的最适引物和标记探针序列分别为：
上游引物：CP204L-F:5’-GCAGGGCAAGGGTATACTGA-3’SEQ ID NO.1
下游引物：CP204L-R：5’-CTGTCTCCTCTTCAAACAGCAC-3’SEQ ID NO.2
探针：CP204L-P:5’-FAM-CCATTCTTCTTGAGCCTG-3’-MGB SEQ ID NO.3
第三步骤是优化检测非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR反应体系与扩增条件，过程包括：
(1)对第二步骤确定的引物和标记探针，用无菌水分别配制成10pmol/μL、8pmol/μL、6pmol/μL、4pmol/μL、2pmol/μL的工作浓度，将探针用无菌水分别配制成3.5pmol/μL、3pmol/μL、2.5pmol/μL、2.0pmol/μL、1.5pmol/μL的工作浓度；
(2)采用Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)荧光PCR反应扩增试剂及推荐的反应扩增条件，在Light480荧光PCR仪上对不同使用浓度组合的引物和标记探针进行荧光PCR方阵筛选试验；
(3)以获得最小Ct值、较高的荧光强度增加值(ΔRn)以及典型的S型扩增曲线为综合判定依据，最终确定最适上、下游引物的使用浓度为7.5pmol/μL，最适探针的使用浓度为2.0pmol/μL，在25μL体系中加入1μL引物及探针；
(4)在最适引物和标记探针浓度以及通用荧光PCR反应扩增试剂条件下，对退火延伸温度在61℃～56℃范围内进行筛选试验，最终确定的最适荧光PCR扩增条件为：94℃预变性2min～10min；94℃变性10s，56℃退火10s，60℃延伸35s，共40个循环。
第四步骤是基于第二步骤、第三步骤确定的引物和标记探针荧光PCR方法建立检测非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR扩增标准曲线和确定最低检测限，过程包括：
(1)对CP204L基因阳性对照进行10倍系列稀释，以第三步骤确定的荧光PCR最适反应体系与扩增条件进行荧光PCR扩增，荧光PCR扩增结果的动力学曲线见图3；
(2)以扩增曲线的Ct值为横坐标，以CP204L基因阳性对照的拷贝数浓度的对数为 纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.4523X+39014，相关系数(r)为0.9988(见图4)，表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到至少42个拷贝的DNA分子，可用于微量非洲猪瘟病毒CP204L基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
第五步骤是对基于第二步骤确定的引物和标记探针建立的荧光PCR方法进行特异性试验，过程包括：
(1)对于猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒的细胞培养物和猪口蹄疫疫苗，采用TRIZOL试剂按操作说明书提取基因组RNA，然后使用TAKARA的PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，按说明书制备上述病毒的cDNA产物；
(2)对于伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的细胞培养物，采用TIANGEN的Tissure/Blood DNA kit按操作说明书提取基因组DNA。
(3)以第二步骤、第三步骤确定的引物和标记探针建立的荧光PCR方法，对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒的细胞培养物和猪口蹄疫疫苗的基因组cDNA产物以及伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒的基因组DNA进行荧光PCR扩增，检测结果显示基于第二步骤、第三步骤确定的引物和标记探针建立的荧光PCR方法具有良好的特异性，与上述猪相关病毒核酸不出现非特异性扩增曲线(见图2)。
第六步骤是确定检测家猪、野猪和软蜱各种样本中非洲猪瘟病毒CP204L基因的操作方法，过程包括：
(1)建立处理家猪、野猪和软蜱各种样本方法；
(2)提取样本的基因组DNA；
(3)利用第二步骤、第三步骤确定的引物和标记探针建立的荧光PCR方法，对这些样本进行非洲猪瘟病毒CP204L基因检测及结果判定。
实施例1非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照的制备
1.参照基因序列的选择
对非洲猪瘟病毒CP204L基因序列(GenBank收录号：KC610555)进行BLAST，选取一段保守且适宜设计实时定量荧光PCR引物和探针的序列作为制备非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照质粒的参考序列，如SEQ ID NO.4所示。
2.扩增引物设计与合成
基于上述序列，设计合成4条PCR扩增引物，其中CP204LF1和CP204LR1序列完全互补用做模板，CP204LF2和CP204LR2分别与CP204LF1和CP204LR1序列部分重叠，合成的序列如下：
CP204LF1:5’-ATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGATTC-3’
CP204LR1：5’-GAATCATATTCCATTCTTCTTGAGCCTGATGTTCAGTATACCCTTGCCCTGCATATAT-3’
CP204LF2：5’-CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATAC-3’
CP204LR2：5’-GAGGATTCTGTCTCCTCTTCAAACAGCACATGCAGAATCATATTCCATTCTTCTTG-3’
3.PCR扩增
在50μL PCR扩增体系中，依次加入10×Buffer(含MgCl₂)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，TaKaRa Taq聚合酶(5.0U/μL)0.2μL，CP204LF1(1pmmol/μL)和CP204LR1(1pmmol/μL)各1μL，CP204LF2(25pmmol/μL)和CP204LR2(25pmmol/μL)各1μL，补足ddH₂O至50μL。
PCR扩增反应参数条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸6min；4℃保温1min。
4.PCR产物的回收、纯化
取PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，切割大小为121bp的目的扩增条带，按照小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明书纯化回收目的DNA片段。
5.PCR产物与克隆载体的连接、转化
按照PCR2.1克隆载体操作说明书，将纯化的目的DNA片段与PCR2.1克隆载体在16℃条件下过夜连接，将该连接产物与DH5α大肠杆菌基因工程菌混合，42℃热激90s，冰浴2min后，加入1mL LB培养基37℃振摇培养1h，然后于AMP⁺LB平板上涂布后37℃过夜培养。
6.CP204L基因阳性对照(质粒)的挑选、鉴定及测定
挑取10个单菌落，于3mL LB培养基中37℃振摇过夜培养，然后用小量质粒提取试剂盒按操作说明书提取和纯化克隆质粒，用PCR方法筛选插入PP62保守序列的阳性克隆质粒；用核酸含量分析仪对纯化的阳性克隆质粒进行质量测定，并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数：

由上述方法即制备成非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照。
实施例2非洲猪瘟病毒CP204L基因荧光定量PCR检测标准曲线的绘制
1.CP204L基因阳性对照(质粒)的稀释
对浓度为4.2×10¹⁰的非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照(质粒)进行10倍系列稀释，选择4.2×10⁸～4.2×10⁰倍稀释的CP204L基因阳性对照(质粒)作为标准品模板。
2.荧光PCR反应的体系配制及扩增
采用TaKaRa公司的Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)荧光PCR反应试剂，按表1的反应体系组成配制反应体系，充分混合均匀后向每个荧光PCR管中分装24.0μL，然后依次加入1.0μL10倍系列稀释的CP204L基因阳性对照(质粒)，每个稀释度做3个平行检测体系，密封后离心后，放置于Light480荧光PCR仪上的样本检测槽中。反应参数为95℃2min，然后95℃10sec，56℃10sec，60℃30sec，40 个循环，在每一次循环60℃退火结束前采集FAM通道荧光信号。
表1荧光PCR反应体系组成

3.标准曲线的绘制
反应结束后，非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照荧光PCR扩增动力学曲线见图3，非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照的拷贝数浓度与对应的Ct值见表2.
表2.非洲猪瘟病毒CP204L基因阳性对照的荧光定量PCR各拷贝数对应Ct值

以扩增曲线的Ct值为横坐标，以CP204L基因阳性对照的拷贝数浓度为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.4523X+39014，相关系数(r)为0.9988(见图4)，表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到至少42个拷贝的DNA分子，可用于微量非洲猪瘟病毒CP204L基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
实施例3实际样本中非洲猪瘟病毒CP204L基因的检测
1.样本的处理及其基因组DNA提取
(1)样本的处理
对于猪血液血液样本，直接吸取200μL，用于基因组DNA提取；对于猪肉样本，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中，充分研磨，再加10mL PBS混匀，或置于组织匀浆器中，加入10mL PBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，3 000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌1.5mL离心管中，吸取200μL悬液，用于基因组DNA提取。
(2)基因组DNA提取
采用血液/天根生化科技有限公司的组织基因组提取试剂盒(TIANGEN BIOTECH)，按照操作说明书，对猪血液样本和处理的猪肉样本进行基因组DNA提取。同时，按同法处理和提取阳性对照和阴性对照(正常的阴性猪组织样品)的基因组DNA。
2.荧光PCR反应体系配制及扩增条件
(1)反应体系配制
采用TaKaRa公司的Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)荧光PCR反应试剂，按表3的反应体系组成配制反应体系，充分混合均匀后向每个荧光PCR管中分装15.5μL，然后加入9.5μL核酸检测样本，密封后离心后，放置于Light480荧光PCR仪上的样本检测槽中。
表3荧光PCR反应体系组成

(2)扩增条件
反应参数为95℃2min，然后95℃10sec，56℃10sec，60℃30sec，40个循环，在每一次循环60℃退火结束前采集FAM通道荧光信号。
3.结果判定
试验结束后，观察阳性对照、阴性对照和样本的扩增曲线和Ct值，判定试验是否成立及样本检测的结果。当阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线，则试验成立，否则此次实验视为无效。Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在病毒，判为阳性结果，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无病毒，判为阴性结果。
本发明建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的实时荧光定量PCR检测体系，可在3～4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地检出ASFV CP204L基因，可用于来自家猪、野猪和软蜱的各种样本中微量非洲猪瘟病毒CP204L基因的检测。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。