果糖基化葛根素及其制备方法与用途 【技术领域】
本发明属生物制药技术领域， 具体涉及葛根素的新衍生物、 生物转化方法及其药物应用。 背景技术 葛根素 (puerarin) 是从豆科植物野葛 (puerarialobata(Willd.)Ohwi) 及葛根 藤 (P.thomaonii Benth) 中提取， 分离得到的异黄酮葡萄糖碳苷， 化学名为 7， 4’ - 二羟 基 -8-β-D- 葡萄糖基异黄酮， 呈白色针状结晶， 能溶于水， 但溶解度小 (6.24g/L)， 其水溶 液为无色或微黄色， 分子量为 416.37。葛根素是中药葛根中主要活性成分之一， 是一种天 然的低毒有效的心脑血管系统疾病治疗药物， 药理作用广泛， 临床上已用于降低血压、 减慢 心率、 降低心肌耗氧量 ； 扩张冠状血管， 改善正常和缺血心肌的代谢 ； 对脑循环、 周围血管 及微循环有影响 ； 除此以外， 葛根素还有降血糖降血脂、 抗氧化、 抗肿瘤等作用 ( 姚丹， 丁选 胜 . 中国临床药理学与治疗学， 2008， 13， 468-474.)。
目前葛根素制剂有葛根素注射液、 滴眼剂、 冻干粉针剂， 实际使用中主要以注射给 药应用于临床 ( 吴燕红， 苏子仁， 赖小平等 . 中药新药与临床药理， 2004， 15(4) ： 259-261.)。 由于葛根素在水中的溶解度较低， 临床应用时需加入助溶剂， 以提高溶解度。 目前临床应用 的葛根素注射液大多需加入高浓度丙二醇做助溶剂， 不仅增加成本， 也因为药液粘度过大， 给生产造成过滤上的麻烦， 同时不溶性杂质增加， 对人体产生一定的毒副作用， 致使用药安 全性降低。为方便应用， 需要改善葛根素溶解性和生物利用度。据相关文献报道， 目前的 方法主要通过对葛根素进行糖基化结构修饰或采用特殊剂型有效改善葛根素溶解性。迄 今， 国内外关于葛根素的糖基化结构修饰的报道如下 ： 2004 年， Li 等人 (Li D， Park S H， Shim J H， et al.Carbohyd Res， 2004， 339， 2789 ～ 2797.) 首次报道了体外酶法糖基化葛 根素， 由来源于嗜热芽孢杆菌的麦芽糖淀粉酶催化合成得到了 C-6” 醇羟基上糖基代的葡 萄糖基 -α-(1， 6)- 葛根素 (CASRN ： 824959-75-3) 及麦芽糖基 -α-(1， 6)- 葛根素 (CASRN ： 824959-76-4)。催化反应在 1 ％ (w/v) 葛根素， 3 ％ (w/v) 可溶性淀粉为糖基供体的条件 下， 55℃反应 45min， 产物转化率达 70％。两转化产物经制备 液相色谱分离纯化后， 经测 定其水溶性较葛根素分别提高了 14 倍和 168 倍。蒋洁蓉等 (Jiang J R， Yuan S， Ding J F， et al.Appl Microbiol Biotechnol， 2008， 81， 647-657.) 利用氧化微杆菌糖基化葛根 素， 获得 7-O- 葡萄糖苷葛根素 (CASRN ： 1163249-06-6) 与 7-O- 异麦芽糖苷葛根素 (CASRN ： 1163249-07-7)。催化反应在 4g/L 葛根素， 50g/L 蔗糖为糖基供体条件下， 30 ℃反应 48h， 7-O- 葡萄糖苷葛根素摩尔转化率为 40％， 7-O- 异麦芽糖苷葛根素摩尔转化率为 5％。两转 化产物经制备液相色谱分离纯化后， 其水溶性较葛根素分别提高了 18 倍和 100 倍。 Huang 等 (Huang W， Ochiai H， Zhang X Y， et al.Carbohyd Res， 2008， 343， 2903-2913.) 利用一种乙 酰基半乳糖苷酶， 以三甘露糖乙酰氨基葡萄糖恶唑啉为糖基供体， 在 20％ DMSO 中对葛根素 进行糖基化转化， 得到相应的糖苷化合物 Puerarin-GlcNAcMan3(CASRN ： 1093135-90-0)。 催化反应在 4.16g/L 葛根素， 13g/L 三甘露糖乙酰氨基葡萄糖恶唑啉为糖基供体条件下，
23℃反应 2h， Puerarin-GlcNAcMan3 摩尔转化率为 60％， 该糖基化产物的制备及相关性质 未见报道。Choi 等 (Choi C H， Kim S H， Jang J H， et al.J Sci Food Agric， 2010， 90 ： 1179-1184.) 利用来源于脂肪嗜热芽孢杆菌的麦芽淀粉酶 (BSMA) 糖基化葛根素， 分别获得 葡萄糖基 -α-(1， 6)- 葛根素、 麦芽糖基 -α-(1， 6)- 葛根素和葡萄糖基 -α-(1， 3)- 葛根素 (CASRN ： 1219937-73-1)， 在 10g/L 葛根素时， 产物总转化率为 56.7％。Yu 等 (Yu C G， Xu H D， Huang G D， et al.Appl Microbiol Biotechnol， 2010， 86 ： 863-870.) 以 40％乙醇处理 氧化微杆菌后， 改变了细胞通透性， 氧化微杆菌可使 7-O- 葡萄糖苷葛根素转变为 7-O- 果 糖苷葛根素 (CASRN ： 1223091-93-7)。张连文等 ( 中国发明专利申请号 ： 200910068855.7 ； 公开号 ： CN 101575631A) 以半乳糖转移酶糖基化葛根素， 催化反应在 9.12g/L 葛根素， 4g/L UDP- 半乳糖为糖基供体条件下， 得到半乳糖基 -α-(1， 4)- 葛根素 (CASRN ： 1196677-60-7)， 其溶解度是葛根素的 12 倍。
葛根素糖苷化后， 水溶性得到显著提高， 糖苷化修饰后分子结构的变化不影响 葛根素的药效， 但提供了一种高浓度给药的葛根素糖苷化合物。相关报道如下 ： Chung 等 (Chung M J， Sung N J， Park C S， et al.Eur J Pharmacol， 2008， 578， 159-170.) 以等摩 尔的葡萄糖基 -α-(1， 6)- 葛根素 (CASRN ： 824959-75-3) 和麦芽糖基 -α-(1， 6)- 葛根素 (CASRN ： 824959-76-4) 的混合物为水溶性葛根素糖苷化产物， 在 HepG2 细胞与 C57BL/6J 小鼠中的药理实验表明 ： 水溶性葛根素糖苷化产物保持了与葛根素相同的抗氧化活性 及降低低密度脂蛋白氧化作用的药效。蒋洁蓉等 (Jiang J R， Yuan S， Ding J F， et al.Appl Microbiol Biotechnol， 2008， 81， 647-657.) 以 7-O- 葡萄糖苷葛根素 (CASRN ： 1163249-06-6) 进行的体外药物代谢动力学实验表明 ： 7-O- 葡萄糖苷葛根素与葛根素相比 表现了更好的药物代谢动力学性能， 7-O- 葡萄糖苷葛根素的血浆半衰期 (t1/2) 和平均滞留 时间 (MRT) 分别是葛根素的 2 倍和 2.8 倍， 该性能有可能增加 7-O- 葡萄糖苷葛根素的生 物利用度。袁生等 ( 中国发明专利申请号 ： 200710021700.9) 以 7-O- 葡萄糖苷葛根素或 7-O- 异麦芽糖苷葛根素及其药物组合物制成用于治疗和预防心脑血管疾病的药物。 张连文 等 ( 中国发明专利申请号 ： 200910068855.7 ； 公开号 ： CN 101575631A) 以主动脉血管平滑 肌为生理模型， 将葛根素和半乳糖基 -α-(1， 4)- 葛根素对血管平滑肌的舒张作用进行比 较， 发现半乳糖基 -α-(1， 4)- 葛根素的舒张作用好于葛根素。
由于葛根素较差的水溶性， 利用生物转化方法进行葛根素糖基化修饰时， 转化前 葛根素浓度普遍较低 ( 均不超过 10g/L)， 产物摩尔转化率也较低 ( 均不超过 70％ )， 这些局 限性给获得足够产物进行心脑血管及肿瘤相关疾病的药理实验及后期的工业化生产都带 来了相当的难度。 发明内容 为了解决上述技术问题， 本发明的一个目的是提供一种新型的果糖基化葛根素。
本发明的另一个目的是所述果糖基化葛根素的制备方法， 具体地， 该方法以烟草 节杆菌 ( 拉丁文学名 ： Arthrobacter nicotianae XM6， 分类命名 ： 烟草节杆菌 XM6， 于 2010 年 6 月 29 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M2010164) 在水相或 非水相生物转化果糖基化葛根素。
本发明又一个目的是提供所述果糖基化葛根素在治疗心脑血管相关疾病的药物
制备中的用途。
本发明再一个目的是提供所述果糖基化葛根素在治疗肿瘤相关疾病的药物制备 中的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一方面， 本发明提供一种果糖基化葛根素， 所述果糖基化葛根素具有下式 (I) 所 示的结构 ：
其中， R1 和 R2 分别独立地选自氢、 甲基、 乙基、 甲酰基、 乙酰基、 甲氨基和硫酸基 ； R 为果糖单糖基或 2 至 5 个果糖连接的寡糖基， 其结构如式 (II) 所示 ：
其中 n ＝ 0 ～ 4。
另一方面， 本发明提供用于制备上述果糖基化葛根素的方法， 所述方法包括采用 具有果糖基化酶活力的发酵液或发酵液上清或纯化的果糖基化酶或其重组表达蛋白， 对含 有葛根素的转化液进行生物转化反应， 使葛根素转化为果糖基化葛根素。
优选地， 所述方法还包括转化结束后， 去除转化液中的菌体细胞或菌体蛋白等杂 质， 然后将经树脂纯化得到的目标馏分旋转蒸发或冷冻干燥后得到果糖基化葛根素粉末或 晶体。
优选地， 所述发酵液或发酵液上清由具有果糖基化葛根素活力的微生物发酵获 得； 进一步优选地， 所述微生物为烟草节杆菌 (Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)。
优选地， 用于微生物发酵的发酵培养基包含 ： 蔗糖 5-80g/L， 蛋白胨 5-50g/L， KH2PO4 0.4-4g/L， CaCl2 0.5-5g/L， MnSO4 0.1-2g/L， pH 6-8 ； 发酵条件优选为 ： 25 ～ 40℃， 10 ～ 400rpm 摇瓶振荡或发酵罐搅拌通气， 转速通气量为 1 ～ 6vvm， 10 ～ 400rpm， 发酵 6-48 小时 ； 进一步优选地， 发酵培养基包含蔗糖 15g/L， 蛋白胨 25g/L， KH2PO4 2g/L， CaCl2 2g/L， MnSO4 0.2g/L， pH 7.5 ； 发酵条件进一步优选为 ： 30℃， 240rpm 摇瓶振荡 16 小时或发酵罐搅
拌通气， 转速通气量为 4vvm， 300rpm， 发酵 6 小时。
优选地， 所述生物转化反应在水相或非水相中进行 ；
其中， 所述水相转化条件包括 ： 采用 10 ～ 400rpm 摇瓶振荡或发酵罐搅拌， 葛根素 浓度大于 0.1g/L 至饱和， 糖基供体为果糖或蔗糖或两者混合物， 葛根素与糖基供体摩尔比 为 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 200， 加入占反应体系 10％ -50％的发酵液或发酵液上清 ( 含果糖基化酶 10-100U/mL)， 在任意一种 pH 4 ～ 8 的缓冲溶液中进行， 转化温度为 25 ～ 40℃， 反应时间为 6 ～ 96 小时 ； 优选条件为 ： 以 10g/L 葛根素， 100g/L 蔗糖为糖基供体， 加入 20％的发酵液上 清 ( 含果糖基化酶 30U/mL)， 于 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH6.86) 的 5L 发酵罐中， 30℃， 300rpm 搅拌转化 12 小时。
所述非水相转化条件包括 ： 采用 10 ～ 400rpm 摇瓶振荡或发酵罐搅拌， 5 ～ 50％选 自二甲基亚砜 (DMSO)、 二甲基甲酰胺 (DMF)、 乙腈、 甲醇、 丙酮或乙醇的一种或几种的亲水 性有机溶剂， 葛根素浓度为 5 ～ 200g/L， 优选葛根素浓度 5 ～ 120g/L， 糖基供体为果糖或蔗 糖或两者混合物， 葛根素与糖基供体摩尔比为 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 200， 加入 10％ -50％的发酵液 或发酵液上清 ( 含果糖基化酶 10-100U/mL)， 在任意一种 pH4 ～ 8 的缓冲溶液中， 转化温度 为 25 ～ 40℃， 反应时间为 6 ～ 96 小时 ； 优选条件为 ： 采用 20％的 DMSO， 107.5g/L 葛根素， 350g/L 蔗糖为糖基供体， 加入 20％的发酵液上清 ( 含果糖基化酶 30U/mL)， 于 1/15mol/L 磷 酸盐缓冲液 (pH6.86) 的 5L 发酵罐中， 30℃， 300rpm 搅拌转化 72 小时。 优选地， 所述树脂纯化为将含有果糖基化葛根素的转化液通过 AB-8 大孔树脂的 吸附， 可选地， 如为非水相转化， 该吸附在将转化液中的有机溶剂低温蒸发去除或将有机溶 剂稀释至低于 2％体积比的条件下进行 ； 吸附后先采用洗脱液洗去残余的糖基供体， 然后 采用洗脱液梯度洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素 ； 进一步优选地， 采用 10 倍柱床 体积 pH 4 ～ 4.5 的蒸馏水洗去残余的糖基供体， 然后采用 5 ～ 30％的甲醇或乙醇溶液梯度 洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素。
优选地， 所述方法还包括采用洗脱液洗脱回收残余葛根素 ； 进一步优选地， 采用 100％甲醇或乙醇洗脱回收残余葛根素。
优选地， 所述果糖基化酶或其重组表达蛋白为 β-D- 呋喃果糖苷酶或其重组表达 蛋白。
更优选地， 所述 β-D- 呋喃果糖苷酶是来源于节杆菌属细菌， 其分子量约 60kDa， N 端前 5 个氨基酸序列分别为 ATEPV。
又一方面， 本发明还提供所述果糖基化葛根素在制备治疗心脑血管相关 疾病的 药物中的用途。
再一方面， 本发明还提供所述果糖基化葛根素在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中 的用途。
优选地， 所述药物为注射剂或口服制剂。
以下是本发明的详细描述 ：
为了完成本发明之目的， 本申请采取如下技术方案 ：
根据本发明的一个实施方式， 本发明提供一种如式 (I) 所示新型的果糖基化葛根 素：
其中， R1 和 R2 分别选自的取代基是氢基， 甲基， 乙基， 甲酰基， 乙酰基， 甲氨基和硫 酸基中的一种。
式 (I) 中， R 为式 (II) 所示 ：
其中 n ＝ 0 ～ 4。R 为果糖单糖基或 2 至 5 个果糖连接的寡糖基。
该化合物由酶法制备， 可以用各种通常的方法如色谱分离、 液相萃取、 重结晶方法 进行纯化。 该化合物的结构可以通过元素分析， 红外光谱， 可见紫外光谱， 核磁共振谱， 单晶 X-Ray 衍射手段进行表征。
根据本发明的另一个实施方式， 本发明提供一种生物转化果糖基化葛根素的方 法。
本发明采用具有葛根素果糖基化酶活力的发酵液、 或发酵液上清 ( 胞外酶 )、 或该 酶的重组表达蛋白， 加入到含有葛根素的水相或非水相转化液中， 使葛根素转化为果糖基 化葛根素 ； 转化结束后， 转化液中的菌体细胞或菌体 酶蛋白经加热沉淀、 离心去除 ； 然后 转化液经 AB-8 大孔树脂进行分离， 目标馏分旋转蒸发或冷冻干燥后得到果糖基化葛根素 粉末或晶体。
上述具有葛根素果糖基化活力的微生物菌种可以是任何果糖基化葛根素的微生 物或糖苷酶， 特别是烟草节杆菌 (Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)。
上述具有葛根素果糖基化活力的胞外酶、 或该酶的重组表达蛋白为 β-D- 呋喃果 糖苷酶或 β-D- 呋喃果糖苷酶重组表达蛋白。
上述 β-D- 呋喃果糖苷酶由节杆菌属细菌所产生。
所述培养基的营养物质没有特别的限制， 可以是任何一种合适于微生物生长的 营养介质， 如任何以淀粉、 葡萄糖、 玉米粉、 蔗糖为碳源， 以玉米浆、 黄豆饼粉、 花生饼粉等 为氮源的培养基。上述用于发酵培养的培养基是 ： 蔗糖 5-80g/L， 蛋白胨 5-50g/L， KH2PO4 0.4-4g/L， CaCl2 0.5-5g/L， MnSO40.1-2g/L， pH 6-8。
上述用于发酵培养的条件是 ： 25 ～ 40℃， 10 ～ 400rpm 摇瓶振荡或 5L 发酵罐搅拌
通气， 转速通气量为 1 ～ 6vvm， 10 ～ 400rpm， 发酵 6-48 小时。
上述生物转化方法， 转化反应可在水相或非水相中进行， 转化温度范围在 25 ～ 40℃， 10 ～ 400rpm 摇瓶振荡或 5L 发酵罐搅拌， 反应时间 6 ～ 96h。(1) 水相转化条件为 ： 葛 根素浓度大于 0.1g/L 至饱和， 糖基供体为果糖或蔗糖或两者混合物， 葛根素与糖基供体摩 尔比为 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 200， 在任意一种 pH4 ～ 8 的缓冲溶液中 ； (2) 非水相转化条件为 ： 采用 5 ～ 50％的亲水性有机溶剂二甲基亚砜 (DMSO)、 二甲基甲酰胺 (DMF)、 乙腈、 甲醇、 丙酮、 乙 醇， 葛根素浓度 5 ～ 200g/L， 优选葛根素浓度 5 ～ 120g/L， 糖基供体为果糖、 蔗糖或两者混 合物， 葛根素与糖基供体摩尔比为 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 200， 在任意一种 pH4 ～ 8 的缓冲溶液中 ；
上述含有果糖基化葛根素的转化液通过 AB-8 大孔树脂的吸附， 是将转化液中的 有机溶剂低温蒸发去除或将有机溶剂稀释至低于 2％体积比的条件下进行吸附 ； 第一步洗 脱液为 10 倍柱床体积 pH4 ～ 4.5 的蒸馏水 ( 乙酸调节 pH) 洗去残余的糖基供体， 第二步洗 脱液为 5 ～ 30％的甲醇或乙醇溶液梯度洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素， 第三步 洗脱液为 100％甲醇或乙醇洗脱回收残留葛根素。
上述经树脂纯化得到的果糖基化葛根素溶液旋转蒸发或冷冻干燥后得到果糖基 化葛根素粉末或晶体。
根据本发明的又一种实施方式， 本发明提供一种新型葛根素糖基化衍生 物在制 备治疗心脑血管相关疾病的药物中的用途。
用本发明的单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素可制成任何一种药剂学上所述的剂型的 药物 ； 在所述的剂型中优选注射剂或口服制剂。
利用本发明的化合物单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素对大鼠心肌缺血 T 波幅度变化 的试验表明 ： 受试样品单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的剂量分别为 12.5mg/kg、 25mg/kg 和 50mg/kg 均能显著减少由垂体后叶素引发的 T 波振幅， 并且对于 T 波的减少幅度小于葛根 素， 说明受试样品单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素能比葛根素更为有效地抗心肌缺血作用。利 用本发明的化合物单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素对心肌缺血大鼠心率的实验结果表明， 注射 垂体后叶素后 2min 内各组大鼠均出现心率明显下降， 2 ～ 10min 各组心率开始恢复。与对 照组相比， 受试样品单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的不同剂量组均能加快心肌缺血大鼠心率 的恢复， 并且单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素低剂量组的恢复时间快于葛根素组。说明受试样 品单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素对心肌缺血导致的心率失常具有一定的治疗作用。本发明所 述果糖基化葛根素可制备成治疗心脑血管疾病的药物。
根据本发明的再一种实施方式， 本发明提供一种新型葛根素糖基化衍生物在制备 治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途。
用本发明的单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素可制成任何一种药剂学上所述的剂型的 药物 ； 在所述的剂型中优选注射剂或口服制剂。
利用本发明的化合物单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素对人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 和人慢粒白血病细胞株 K562 体外增殖抑制的试验表明 ： 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素作用 48 小时后均可减少 MDA-MB-231 细胞的细胞数目。与相同时间内的对照组比较， 当单果糖 基 -β(2， 6)- 葛根素剂量达到 50μmol/L 时有差异 (P ＜ 0.05)， 剂量在 100μmol/L 时有显 著性差异 (P ＜ 0.01)， 当剂量达到 150 和 200μmol/L 时该差异具有极显著性 (P ＜ 0.001)， 对 MDA-MB-231 细胞的抑制率分别达到 44.04 ％和 59.42 ％， 说明单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素能明显抑制人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 的增殖， 且抑制率随剂量增加而增加。单果 糖基 -β(2， 6)- 葛根素作用 48 小时后均可减少 K562 细胞的细胞数目。与相同时间内的 对照组比较， 当单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素在低剂量 1μmol/L 其结果就有显著性差异 (P ＜ 0.05)， 剂量在 100、 150 和 200μmol/L 时该差异具有极显著性 (P ＜ 0.001)， 对 K562 细 胞的抑制率分别达到 16.41％、 29.84％和 46.41％， 说明单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素能明显 抑制人慢粒白血病细胞株 K562 的增殖， 且抑制率随剂量增加而增加。说明受试样品单果糖 基 -β(2， 6)- 葛根素在体外对肿瘤细胞具有一定的抑制作用。本发明所述果糖基化葛根素 可制备 成治疗肿瘤疾病的药物。
与现有技术相比， 本发明具有的有益效果在于 ：
首先， 本发明人发明了一种新的果糖基化葛根素， 实验证明这种新型葛根素衍生 物对于心肌缺血导致的心律失常具有一定的治疗作用， 可以有效用于治疗心脑血管疾病， 并且实验同时证明这种新型葛根素衍生物在体外对人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 和人慢粒 白血病细胞株 K562 有显著的抑制作用， 可以用于治疗肿瘤疾病， 这都丰富了葛根素糖基化 衍生物作为药物的来源， 而现有的葛根素糖苷化衍生物未见这方面的报道 ；
其次， 相比葛根素， 这种新型果糖基化葛根素的溶解度更好， 药理活性高， 弥补了 葛根素产品的缺陷， 使用药的安全性提高， 疗效增加， 是一种具有较好发展前景的新药产 品； 再次， 本发明人还提供了该新型果糖基化葛根素的生物转化方法。在现有利用 生物转化方法进行葛根素糖基化修饰时， 由于葛根素较差的水溶性， 葛根素浓度普遍较低 ( 均不超过 10g/L)， 产物摩尔转化率也较低 ( 均不超过 70％ )， 而采用本发明的生物转化方 法， 所获得的单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素浓度达 111.7g/L， 底物转化率达 90％以上， 解决了 现有技术中所存在的技术难题， 有利于利用该产物进行心脑血管及肿瘤相关疾病的药理试 验及后期的工业化生产。
附图说明 以下， 结合附图来详细说明本发明的实施例， 其中 ：
图 1 为水相生物转化葛根素的 HPLC 图谱， 该图中 ： 保留时间 14.910min 的峰为 葛根素， 保留时间 10.131min 的峰为单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素， 保留时间 6.130min 的峰 为双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素， 保留时间 5.409min 的峰为三果糖基 -β(2， 6)- 葛根素， 保 留时间 5.144min 的峰为四果糖基 -β(2， 6)- 葛根素， 保留时间 4.968min 的峰为五果糖 基 -β(2， 6)- 葛根素。
图 2 为非水相生物转化葛根素的 HPLC 图谱， 该图中 ： 保留时间 13.735min 的峰为 葛根素 ； 保留时间 7.450min 的峰为单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素， 保留时间 4.603min 的峰为 双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素 ； 保留时间 4.192min 的峰为三果糖基 -β(2， 6)- 葛根素。 1
图 3 为单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的 HNMR 谱图。
图 4 为单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的 13CNMR 谱图。
图 5 为单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的 H-H COSY 谱图。
图 6 为单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的 C-H HSQC 谱图。
图 7 为单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的高分辨质谱图。
图 8 为葛根素的 1HNMR 谱图。
图 9 为葛根素的 13CNMR 谱图。
图 10 为双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的 1HNMR 谱图。
图 11 为双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的 13CNMR 谱图。
图 12 为双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的 H-H COSY 谱图。
图 13 为双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的 C-H HSQC 谱图。
图 14 为双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的高分辨质谱图。
图 15 为三果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的质谱图。
图 16 为四果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的质谱图。
图 17 为五果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的质谱图。 生物材料的保藏信息 拉丁文学名 ： Arthrobacter nicotianae XM6， 分类命名 ： 烟草节杆菌 XM6， 于 2010 年 6 月 29 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号 ： CCTCC NO ： M2010164。 具体实施方式 下面结合具体的实施例， 并参照数据进一步详细描述本发明。 应理解， 这些实施例 只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制发明的范围。
在以下的实施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、 商品名以及有必要列出其组成成分者， 均在首次出现时标明， 其后所用相 同试剂如无特殊说明， 均以首次标明的内容相同。
实施例 1 ： 采用水相生物转化葛根素获得果糖基化葛根素
将 40ml 发酵培养的培养基 2( 培养基组成见表 1) 放入 250ml 三角瓶， 121℃高压 蒸汽灭菌 20min 后， 接入烟草节杆菌 (Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)， 于 30℃， 180rpm 振荡发酵培养 16 小时作为种子液接种至 5L 发酵罐中， 接种量 5 体积％， 发 酵罐装液量 3L， 发酵罐灭菌方式与摇瓶相同。在 30℃， 300rpm 发酵培养， 通气量 3vvm， 发酵 培养 6 小时 (OD 约 10 左右 ) 后 8000rpm 离心 20min， 收集上清酶液， 测定上清酶液中含果糖 基化酶 30U/mL。其中， 酶活力的测定采用以下方法 ：
底物溶液的配制 ： 0.4g 葛根素， 10g 蔗糖充分溶解在 100mL 1/15mol/L 磷酸盐缓冲 液 (pH6.86) 中。反应体系 ： 取 2mL 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH6.86) 加入 18mL 底物溶液 中， 置于 30℃中反应 10min， 后立即取出 100μL 加入 900μL 的甲醇中终止反应， 作为空白 对照。 同时另取 2mL 酶液加入 18mL 底物溶液中， 置于 30℃中反应 10min， 后立即取出 100μL 加入 900μL 的甲醇中终止反应， 作为样品。之后用 HPLC 进行测定。酶活力单位定义为 ： 在 30℃条件下， 每分钟转化 1μmol 葛根素所需酶的量为一个活力单位 (1U 即 1μmol/min)。 比活力定义 (U/mL) ： 单位体积 (mL) 酶液中具有的酶活力 (U) 数。
将 600ml 上清酶液加入至总体积 3000ml 含有 10g/L 葛根素 ( 购自南京泽朗医药科 技有限责任公司 )， 100g/L 蔗糖， 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH6.86) 的 5L 发酵罐中， 30℃， 300rpm 进行葛根素糖基化反应， 12 小时后， 45℃加热 2 小时终止转化反应。转化液经 HPLC 检测， 果糖基化葛根素转化率达 95％。结果参考图 1。
将 上 述 含 有 果 糖 基 化 葛 根 素 的 转 化 液 经 AB-8 大 孔 树 脂 的 吸 附 ( 层 析 柱
40×600mm， 流速 10ml/min)， 然后用 10 倍柱床体积 pH4 ～ 4.5 的蒸馏水 ( 冰乙酸调节 pH) 洗 去残余的糖基供体， 接着用 5％ -30％的甲醇溶液梯度洗脱， 分别获得果糖基化葛根素 ( 纯 度＞ 97％ )， 最后用 100％甲醇洗脱去除色素与葛根素。
纯度＞ 97 ％的果糖基化葛根素分别于 45 ℃旋转蒸发或冷冻干燥后得到单果糖 基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 7.9g， 双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 16.8g， 三果 糖基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 3.3g， 四果糖基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 3.2g， 五 果糖基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 2.2g。
经 测 定， 在 25 ℃ 时， 单 果 糖 基 -β(2， 6)- 葛 根 素 溶 解 度 为 26.0g/L， 双果糖 基 -β(2， 6)- 葛根素溶解度为 280.8g/L， 分别是相同条件下葛根素溶解度 (5.2g/L) 的 5 倍 和 54 倍。
上 述 单 果 糖 基 -β(2， 6)- 葛 根 素 ： HR-MS ： m/z 577.1563[M-H]-， 元素组成为 1 13 C27H29O14( 图 7)， M-H 计算值 577.1557 ； 在 DMSO 的 H-NMR 和 C-NMR 化学位移的特征分别如 下： 1
H-NMR(500MHz， DMSO-d6)δ ： 8.29(1H， s， H-2)， 7.93(1H， d， J ＝ 8.7Hz， H-5)， 6.98(1H， d， J ＝ 8.7Hz， H-6)， 7.40(2H， d， J ＝ 8.5Hz， H-2′ /H-6′ )， 6.80(2H， d， J ＝ 8.7Hz， H-3′ /H-5′ )， 9.48(1H， s， 4′ -OH)， 4.81(1H， d， J ＝ 9.1Hz， H-1″ )， 3.93-3.96(2H， m， H-2″ /H-4″′ )， 3.79-3.89(2H， m， H-5″ /H-6″′ )， 3.48-3.61(3H， m， H-6″， H-5″′， H-6″′ )， 3.29-3.42(6H， m， H-3″， H-4″， H-6″， 2H-1″′， H-3″′ )( 图 3、 图 5、 图 6) C-NMR(500MHz ，DMSO-d 6 ) δ ： 174.9 ， 160.9 ， 157.1 ， 152.6 ， 130.0 ， 126.2 ， 123.0， 122.5， 114.9， 112.5， 116.8， 104.1(C-2 ″ ′ )， 82.1(C-5 ″ ′ )， 79.7， 78.4， 76.7， 75.1(C-5″ )， 73.4， 70.7， 70.3， 62.3(C-6″ )， 61.5(C-6″′ )， 61.1( 图 4)。 1 13
葛根素 H-NMR 和 C-NMR 化学位移的特征分别如下 ： 1
H-NMR(500MHz， DMSO-d6)δ ： 8.33(1H， s， H-2)， 7.97(1H， d， J ＝ 8.8Hz， H-5)， 7.01(1H， d， J ＝ 8.8Hz， H-6)， 7.41(2H， d， J ＝ 8.8Hz， H-2 ′ /H-6 ′ )， 6.83(2H， d， J＝ 8.8Hz， H-3′ /H-5′ )， 9.52(1H， s， 4′ -OH)， 4.85(1H， d， J ＝ 9.0Hz， H-1″ )， 4.05(1H， s， H-2″ )， 3.52， 3.75(2H， m， 2H-6″ )， 3.26-3.36(3H， m， H-3″， H-4″， H-5″ )( 图 8) 13
C-NMR(500MHz， DMSO-d6)δ ： 175.1， 161.2， 157.2， 152.7， 130.1， 126.4， 123.2， 122.6， 117.0， 115.19， 112.7， 81.8(C-5″ )， 78.8， 73.6， 71.0， 70.6， 61.5(C-6″ )( 图 9)。
双 果 糖 基 -β(2， 6)- 葛 根 素 ： HR-MS ： m/z 739.2080[M-H]-，元 素 组 成 为 C33H39O19( 图 14)， M-H 计算值 739.2086 ； 在 DMSO 的 1H-NMR 和 13C-NMR 化学位移的特征分别 如下 ： 1
H-NMR(500MHz， DMSO-d6)δ ： 8.29(1H， s， H-2)， 7.95(1H， d， J ＝ 8.7Hz， H-5)， 6.97(1H， d， J ＝ 8.8Hz， H-6)， 7.40(2H， d， J ＝ 8.6Hz， H-2′ /H-6′ )， 6.80(2H， d， J ＝ 8.8Hz， H-3 ′ /H-5 ′ )， 9.48(1H， s， 4 ′ -OH)， 4.81(1H， d， J ＝ 9.2Hz， H-1 ″ )， 3.92-3.99(3H， m， H-2 ″， H-4 ″ ′， H-4 ″ ″ )， 3.69-3.87(4H， m， H-6 ″， H-5 ″， H-5 ″ ′， H-6 ″ ″ )， 3.48-3.58(5H， m， H-6″， H-3″′， H-6″′， H-5″″， H-6″″ )， 3.25-3.42(8H， m， H-3″， H-4″， 2H-1″′， H-6″′， 2H-1″″， H-3″″ )( 图 10、 图 12、 图 13)。 13
C-NMR(500MHz， DMSO-d6)δ ： 174.7， 160.7， 156.9， 152.4， 129.8， 126.0， 122.9， 122.4， 116.6， 114.8， 112.3， 104.2， 104.0， 81.9(C-5 ″ ″ )， 80.1， 79.6， 78.3， 76.3，
1276.0， 75.5(C-5 ″ ′ )， 75.1(C-5 ″ )， 73.3， 70.6， 70.4， 62.7(C-6 ″ )， 62.4(C-6 ″ ′ )， 62.0(C-6″″ )， 61.1， 60.8， ( 图 11)。
三 果 糖 基 -β(2， 6)- 葛 根 素 ： ESI-MS ： m/z 925.3[M+Na]+，元 素 组 成 为 C39H50O24Na( 图 15) ； 四 果 糖 基 -β(2， 6)- 葛 根 素 ： ESI-MS ： m/z 1064.3[M-H]-， 元素组成 为 C45H59O29( 图 16) ； 五果糖基 -β(2， 6)- 葛根素 ： ESI-MS ： m/z1226.5[M-H] ， 元素组成为 C51H69O34( 图 17)。
实施例 2 ： 采用非水相生物转化葛根素获得果糖基化葛根素
将 40ml 发酵培养的培养基 2( 培养基组成见表 1) 放入 250ml 三角瓶， 121℃高压 蒸汽灭菌 20min 后， 接入烟草节杆菌 (Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)， 于 30℃， 180rpm 振荡发酵培养 16 小时作为种子液接种至 5L 发酵罐中， 接种量 5％， 发酵罐 装液量 3L， 发酵罐灭菌方式与摇瓶相同， 30℃， 300rpm 发酵培养， 通气量 3vvm， 发酵培养 6 小 时 (OD 约 10 左右 ) 后 8000rpm 离心 20min， 收集上清酶液， 测定上清酶液中含果糖基化酶 30U/mL。
将 600ml 上清酶液加入至总体积 3000ml 含有 107.5g/L 葛根素， 350g/L 蔗糖， 20％ DMSO 的 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH6.86) 的 5L 发酵罐中， 30 ℃， 300rpm 振荡转化， 72 小 时后， 45℃加热 2 小时终止转化反应。转化液经 HPLC 检测 ： 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素达 111.7g/L， 双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素达 28.3g/L， 三果糖基 -β(2， 6)- 葛根素达 2.3g/L， 果糖基化葛根素衍生物转化率达 90％。结果参考图 2。
上述含有果糖基化葛根素的转化液稀释 10 倍后经 AB-8 大孔树脂的吸附 ( 层析柱 40×600mm， 流速 10ml/min)， 然后用 10 倍柱床体积 pH4 ～ 4.5 的蒸馏水 ( 冰乙酸调节 pH) 洗 去残余的糖基供体， 接着用 5％ -30％的甲醇溶液梯度洗脱， 分别获得果糖基化葛根素 ( 纯 度＞ 97％ )， 最后用 100％甲醇洗脱去除色素与葛根素。
纯度＞ 97 ％的果糖基化葛根素分别于 45 ℃旋转蒸发或冷冻干燥后得到单果糖 基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 270g， 双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 68g， 三果糖 基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 5g。
实施例 3 ： 采用非水相生物转化葛根素获得果糖基化葛根素
将 40ml 发酵培养的培养基 2( 培养基组成见表 1) 放入 250ml 三角瓶， 121℃高压 蒸汽灭菌 20min 后， 接入烟草节杆菌 (Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)， 于 30℃， 180rpm 振荡发酵培养 16 小时后 (OD 约 10 左右 )， 8000rpm 离心 20min， 收集上清酶 液， 上清酶液中含果糖基化酶 30U/mL。
将 4ml 上清酶液至总体积 20ml 含有 107.5g/L 葛根素， 350g/L 蔗糖， 20％ DMSO 的 磷酸盐缓冲液 (pH6.86) 的 250ml 具塞三角瓶中， 30℃， 180rpm 振荡转化， 72 小时后， 45℃加 热 2 小时终止转化反应。转化液经 HPLC 检测 ： 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素达 111.7g/L， 双 果糖基 -β(2， 6)- 葛根素达 28.3g/L， 三果糖基 -β(2， 6)- 葛根素达 2.3g/L， 果糖基化葛根 素转化率达 90％。
上述含有果糖基化葛根素的转化液稀释 10 倍后经 AB-8 大孔树脂的吸附 ( 层析柱 20×600mm， 流速 10ml/min)， 然后用 10 倍柱床体积 pH4 ～ 4.5 的蒸馏水 ( 冰乙酸调节 pH) 洗 去残余的糖基供体， 接着用 5％ -30％的甲醇溶液梯度洗脱， 分别获得果糖基化葛根素 ( 纯 度＞ 97％ )， 最后用 100％甲醇洗脱去除色素与葛根素。纯度＞ 97％的果糖基化葛根素分别于 45℃旋转蒸发或冷 冻干燥后得到单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 1.8g， 双果 糖基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 0.5g， 三果糖基 -β(2， 6)- 葛根素粉末或晶体 0.03g。 。
实施例 4 ： 不同发酵和转化条件对产物形成的影响
将 40ml 发酵培养的培养基 ( 培养基组成见表 1) 放入 250ml 三角瓶， 121℃高压蒸 汽灭菌 20min 后， 接入烟草节杆菌 (Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)， 在 不同的发酵条件下 ( 发酵条件见表 2) 振荡发酵培养后， 8000rpm 离心 20min， 收集上清酶 液， 上清酶液中含果糖基化酶 10-100U/mL。以 20％上清酶液加入至转化体系中， 在不同转 化条件下 ( 转化条件见表 2)， 振荡转化后 45℃加热 2 小时终止转化反应， 转化液经 HPLC 检 测。
不同菌种发酵条件以及转化条件， 对葛根素糖基化产物的形成均产生不同影响， 表 1 和表 2 列出了在不同条件下进行葛根素糖基化反应时主要产物单果糖基化葛根素与双 果糖基化葛根素的摩尔转化率的变化。
表 1 培养基成分的不同配比组成
表 2 不同条件下单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素 (P1) 与双果糖基 -β(2， 6)- 葛根素 (P2) 的摩尔转化率
从表 2 中结果可以看出， 非水相转化优点在于转化体系中葛根素浓度可增加至 120g/L， 在优选的非水相转化条件下， 非水相转化率可达 90％， 转化产物浓度显著提高 ( 在 107.5g/L 葛根素时， 转化总产物可达 140g/L 以上 )， 且可通过溶剂的选择与比例调控转化 产物， 非水相转化的这些优势将有利于工业化生产。
实施例 5 ： 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素在血液中的代谢动力学实验
1. 仪器和色谱条件
HPLC 分析采用 DIONEX， 色谱柱为 Discovery HS C18 柱 (250×4.6um， 5um)， 进样 体积为 20μl， 柱温为 30℃， 检测器为 UVD170U， 检测波长 254nm， 流动相 ： A， 水， B， 色谱级甲 醇， A ∶ B ＝ 80 ∶ 20， 流速 1ml/min。
2. 实验动物
Sprague-Dawley 大鼠 (SD 大鼠 )， 体重 180-220g， 雌雄各半， 由南通大学医学实验 中心提供， 生产许可证号 ： SCXK( 苏 )20080010。
3. 实验方法
3.1 样品采集
SD 大鼠随机分成 2 组， 每组 5 只， 实验前禁食 12 小时。葛根素及单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素分别溶解于 20％的 1， 2- 丙二醇生理盐水中， 按 50mg/kg 的剂量给予大鼠尾静脉 注射葛根素和单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素。服用后经 t ＝ 0min、 4min、 7min、 17min、 40min、 60min、 120min、 180min 后， 眼眶采集 0.5ml 血液置于肝素钠处理过的离心管中， 立即以 3000rpm 的条件下 离心分离 15min， 分离血浆以备分析。
3.2 样品处理
精密取血浆 100μl 置试管中， 再加入 400μl 甲醇沉淀蛋白， 于漩涡混合器上混合 5min， 然后 10000rpm 离心 10min， 上清液用于 HPLC 分析。
3.3 数据分析
按照 3.2 制备的葛根素及单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素样品的血浆浓度用外标法计 算得到。得到的数据用药代动力学统计软件进行分析。
4. 结果
从葛根素及单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的主要代谢动力学参数 ( 表 3) 可见， 单果 糖基 -β(2， 6)- 葛根素的 t1/2， MRT(0-t) 和 MRT(0- ∞ ) 的值明显高于葛根素， 表明葛根素 衍生物在血液中的滞留时间与葛根素相比得到延长， 因而有利于其在体内有较长的作用时 间。同时葛根素衍生物的 AUC(0-t) 和 ACU(0- ∞ ) 值显著高于葛根素， 表明葛根素衍生物 与葛根素相比具有更高的生物利用度。
表 3 葛根素及单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素在大鼠中的代谢动力学参数 (n ＝ 5)
t1/2 ＝清除的半衰期
CL ＝全身清除率
AUC ＝浓度 - 时间曲线下的面积
MRT ＝平均滞留时间
实施例 6 ： 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素对大鼠急性心肌缺血的保护作用实验
1. 实验材料
垂体后叶素注射液购自南京新百药业有限公司， 生理盐水注射液购自南京小营药 业有限公司， 二甲基亚砜、 丙二醇、 无水乙醇均采用色谱级。葛根素购自南京泽朗医药科技 有限责任公司， 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素由本发明方法制备， 经高效液相色谱检测纯度 在 99％以上。
2. 实验动物
Sprague-Dawley 大鼠 (SD 大鼠 )， 体重 180-220g， 雌雄各半， 由南通大学医学实验 中心提供， 生产许可证号 ： SCXK( 苏 )20080010。
3. 试验方法
取对垂体后叶素敏感的 SD 大鼠 50 只适应性饲养 3 天后， 随机分为溶剂组、 葛根 素组和单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素低、 中、 高三组， 每组 SD 大鼠 10 只。所给药物均用 10％ 的丙二醇溶液助溶， 均给药 0.5ml， 溶剂组使用丙二醇生理盐水溶液， 葛根素组使用葛根素
丙二醇生理盐水溶液， 剂量为 50mg/kg， 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素组使用丙二醇生理盐水 溶液， 剂量分别为 12.5mg/kg， 25mg/kg， 50mg/kg。给药后 5min， 各组大鼠静脉缓慢注射 Pit 0.5U/kg 复制急性心肌缺血模型， 观察注射 Pit 后 15s、 30s、 1min、 5min、 10min 时各组大鼠的 心电图变化， 计算以上各时间点的心率和 T 波的幅度变化。
4. 统计方法
数据采用 表示， 采用 t 检验。P ＜ 0.05， 表示差异有显著性 ； 若 P ＜ 0.01， 表示差异非常显著 ； 若 P ＜ 0.001， 表示差异极端显著。
5. 结果
5.1 葛根素衍生物对大鼠心肌缺血 T 波幅度变化的影响
表 4 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素 (P1) 对心肌缺血大鼠 T 波幅度变化的影响 (N ＝ 10， )
** *** 注： 与溶剂组比较 *P ＜ 0.05， P ＜ 0.01， P ＜ 0.001
实验结果表明， 受试样品单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的剂量分别为 12.5mg/kg、 25mg/kg 和 50mg/kg 均能显著减少由垂体后叶素引发的 T 波振幅， 并且对于 T 波的减少幅度 小于葛根素， 说明受试样品单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素能比葛根素更为有效地抗心肌缺血 作用。
5.2 葛根素衍生物对心肌缺血大鼠心率的影响
表 5 单 果 糖 基 -β(2， 6)- 葛 根 素 (P1) 对 心 肌 缺 血 大 鼠 心 率 的 影 响 (N ＝ 10， )
实验结果表明， 注射垂体后叶素后 2min 内各组大鼠均出现心率明显下降， 2～ 10min 各组心率开始恢复。 与对照组相比， 受试样品单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素的不同剂量 组均能加快心肌缺血大鼠心率的恢复， 并且单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素低剂量组的恢复时 间快于葛根素组。说明受试样品单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素对心肌缺血导致的心率失常具 有一定的治疗作用。
实施例 7 ： 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素对肿瘤细胞增殖的抑制作用实验
1. 细胞株与药品
人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231， 购自上海复蒙基因生物科技有限公司 ； 人慢粒白血 病细胞株 K562， 购自中国科学院上海细胞研究所细胞库 ； 葛根素， 购自南京泽朗医药科技 有限责任公司 ； 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素由本发明方法制备， 经高效液相色谱检测纯度 在 99％以上。
2. 实验药物及溶液配制
药液储液 ： 称取 8.32mg 葛根素粉末， 溶于 2mLDMSO 中， 配制成 10mmol/L 的葛根素 ； 称取 11.56mg 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素粉末， 溶于 2mLDMSO 中， 配制成 10mmol/L 的单果糖 基 -β(2， 6)- 葛根素 ； 以 0.22μm 滤器过滤， 1000μL/doff 分装， -20℃存储， 同时 0.22μm 滤器过滤高浓度 DMSO 以备对照组之用。
细胞培养液 ： 取 RPM I-1640 培养基 ( 粉剂 )1 包， 溶于 800mL 三蒸水中， 磁力搅拌 器搅拌至少半小时， 至完全溶解， 补加 NaHCO3 2g， 充分溶解后定容至 1L。用 0.22pm 孔径的 滤膜过滤除菌， 加入血清， 使血清终浓度为 10％， 4℃贮存。
PBS 磷 酸 盐 缓 冲 液 ： 在 800ml 蒸 馏 水 中 溶 解 8gNaCl、 0.2gKCl、 1.44gNa2PO4 和 0.24gKH2PO4， 用 HCl 调节溶液 PH 值至 7.4， 加水定容至 1L， 高压蒸汽灭菌 20 分钟， 低温保 存。
MTT 应用液 ： 称取 500mgMTT 粉剂， 溶于 100m1PBS 中， 搅拌溶解后， 0.22pm 孔径的滤 膜过滤除菌， 分装后 4℃避光保存备用。
三联液 ： 取 SDS 25g， 异丙醇 12.5mL， 浓 HCl 2.5mL 用三蒸水定容至 1L， 低温保存。
3. 主要试剂与仪器
高效液相色谱仪 ( 美国戴安型号 ： P600) ； 酶 标 仪 (Molecular Devices 公 司 型号 ： spectra MAX 190/GEMINIXS) ； CO2 培 养 箱 (Forma 公 司 型 号 ： 3111) ； 低速离心机 (Thermostat 型号 ： PICO-17) ； 倒置显微镜 (leica 公司型号 ： DMIL) ； 水平脱色摇床 ( 南京 大学仪器公司型号 ： TY-80S) ； 胎牛血清 (Hyclone 公司 ) ； 小牛血清 (GibacoBRL 公司 ) ； RPMI1640( 美国 Gibco 公司 ) ； Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO 公司 ) ； Streptomycin Sulfate(AMRESCO 公司 ) ； Trypsin(AMRESCO 公司 ) ； MTT(AMRESCO 公司 )。
4. 细胞培养
MDA-MB-231 细胞在含体积分数为 10 ％灭活胎牛血清、 100U 青霉素和链霉素的 RPMI-1640 完全培养基， 于 37℃ 5％ CO2 饱和湿度孵箱内培养。
K-562 细 胞 在 含 体 积 分 数 为 10 ％ 灭 活 小 牛 血 清、 100U 青 霉 素 和 链 霉 素 的 RPMI-1640 完全培养基， 于 37℃ 5％ CO2 饱和湿度孵箱内培养。
5. 实验方法
5.1MDA-MB-231 细胞毒性试验
取对数生长期的 MDA-MB-231 细胞 ( 一次性培养瓶 )， 弃培养液。加 10mLPBS 洗一 次， 弃 PBS 后， 加入 3mL0.25％胰蛋白 -0.04％ EDTA， 37℃消化 3min 后， 向其中加入 5mL 完全 培养基中和反应， 吹打后将细胞转入 15mL 离心管中， 1000rpm 离心 3 分钟。配细胞悬液， 用 4 适量的完全培养基调整细胞浓度为 3×10 /mL。 将细胞加入 96 孔培养板中， 每孔加入细胞悬 液 180μL， 培养板放入细胞培养箱中 (37℃， 5％ CO2) 常规培养。待细胞生长至 50％ -70％ 加入各浓度药液。取 10mmol/L 葛根素及单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素储液， 用 PBS 梯度稀释 药液至 1000、 500、 100、 50、 10、 5、 1 和 0.1μmol/L， 每孔加药 20μL， 药物终浓度分别为 100、 50、 10、 5、 1、 0.5、 0.1 和 0.01μmol/L。DMSO 溶剂对照组加入 20μL PBS 中含有相应药物溶 剂， 空白组加入 20μLPBS。每个药物浓度设 6 个复孔。将培养板放回细胞培养箱， 48 小时 后加入 20μL MTT(5mg/mL) 溶液， 继续在培养箱中孵育 4 小时后， 倒扣掉上清， 吸水纸拍干， 每孔加 200μLDMSO， 摇床避光震摇 15 分钟， 使结晶物充分溶解。用全自动酶标仪在 490nm 测定吸光值， 计算平均抑制率， 抑制率 (％ ) ＝ ( 对照组 A490- 实验组 A490)/ 对照组 A490)， 实 验重复 3 次。
5.2K562 细胞毒性试验
取对数生长期的 K-562 细胞调整浓度至 1×105 个 /mL， 接种于 96 孔培养板， 每孔 加入细胞悬液 90uL， 实验组以不同终浓度 (1、 5、 10、 20、 50、 100、 150、 200μmol/L) 葛根素及 单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素处理， 每孔加药 10uL， DMSO 溶剂对照组加入 20μL PBS 中含有 相应药物溶剂， 空白组加入 20μLPBS。每个药物浓度设 6 个复孔。将培养板放回细胞培养 箱， 48 小时后加入 20μL MTT(5mg/mL) 溶液， 继续在培养箱中孵育 4 小时后， 每孔加入三联 液 100uL， 过夜待结晶充分溶解。振荡器震荡 20min 用全自动酶标仪在 490nm 处测定吸光 值， 计算平均抑制率， 抑制率 (％ ) ＝ ( 对照组 A490- 实验组 A490)/ 对照组 A490)， 实验重复 3 次。
6. 统计处理
采用 Microsoft Excel 2003 软件中的相关分析和 Student t 检验， 数据采用表示。
7. 实验结果
7.1 葛根素衍生物对人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 增殖的影响
表 6 不同浓度葛根素和单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素作用 48h 对 MDA-MB-231 细胞 增殖的影响
* ** *** 注： 与对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01， P ＜ 0.001。
MTT 法分析后统计结果说明 ( 见表 6)， 葛根素和单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素作用 48 小时后均可减少 MDA-MB-231 细胞的细胞数目。与相同时间内的对照组比较， 当单果糖 基 -β(2， 6)- 葛根素剂量达到 50μmol/L 时有差异 (P ＜ 0.05)， 剂量在 100μmol/L 时有显 著性差异 (P ＜ 0.01)， 当剂量达到 150 和 200μmol/L 时该差异具有极显著性 (P ＜ 0.001)， 对 MDA-MB-231 细胞的抑制率分别达到 44.04％和 59.42％， 说明单果糖基 -β(2， 6)- 葛根 素能明显抑制人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 的增殖， 且抑制率随剂量增加而增加。
7.2 葛根素衍生物对人慢粒白血病细胞株 K562 增殖的影响
表 7 不同浓度葛根素和单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素作用 48h 对 K562 细胞增殖的 影响
* ** *** 注： 与对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01， P ＜ 0.001。
MTT 法分析后统计结果说明 ( 见表 7)， 葛根素和单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素作用 48 小时后均可减少 K562 细胞的细胞数目。 与相同时间内的对照组比较， 当单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素在低剂量 1μmol/L 其结果就有显著性差异 (P ＜ 0.05)， 剂量在 100、 150 和 200μmol/L 时该差异具有极显著性 (P ＜ 0.001)， 对 K562 细胞的抑制率分别达到 16.41％、 29.84％和 46.41％， 说明单果糖基 -β(2， 6)- 葛根素能明显抑制人慢粒白血病细胞株 K562 的增殖， 且抑制率随剂量增加而增加。