牵引丝蛋白 技术领域 本发明涉及核酸、 由核酸编码的蛋白质、 导入有核酸的重组生物及由重组生物制 作的蛋白质。
背景技术 蜘蛛的丝作为因兼具强度和弹性而具有优异强韧性的天然高性能聚合物而为人 所知。蜘蛛中存在最多 7 个经特化的腺体， 这些腺体产生性质不同的多种蜘蛛丝， 其中由大 壶状腺体产生的牵引丝作为最强韧的蜘蛛丝在医疗、 航空、 衣料等各种产业领域中的新原 材料的开发中备受关注。
作为构成牵引丝的主要蛋白质， 已知被称作大壶状腺丝蛋白 (Major Ampullate Spidroin ： MaSp) 的 蛋 白 质， 目 前 编 码 黑 寡 妇 蜘 蛛 (Latrodectus hesperus)、 几何寇 蛛 (Latrodectus geometricus)、 金 丝 蜘 蛛 (Nephila clavipes) 等 各 种 蜘 蛛 的 MaSp 蛋 白质的基因序列已经清楚 ( 非专利文献 1 ： Nadia A.Ayoub et al.， Blueprint for a
High-Performance Biomaterial ： Full-Length Spider Dragline Silk Genes， 2007， Issue 6， e514 ； 非 专 利 文 献 2： William A.Gaines IV et al.， Identification and Characterization of Multiple Spidroin 1 Genes Encoding Major Ampullate Silk Proteins in Nephila clavipes， Insect Mol Biol， 2008， 17(5)， 465-474 等 )。 发明内容
但是， 在各产业领域中， 对具有优异物性的天然纤维的需求有所增加的同时， 期待 更新的原材料的开发。
因而， 本发明的目的在于提供在天然纤维中具有优异物性的新原材料。
本发明人等为了达成上述目的反复进行了深入研究， 结果发现， 编码构成人面蜘 蛛 (Nephila pillipes) 的牵引丝的 MaSp 蛋白质的基因具有与目前已知的 MaSp 基因不同 的独特结构， 进而完成了本发明。
即， 本发明涉及 (1) 下述 (a) ～ (d) 中任一种的核酸。
(a) 具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸
(b) 编码具有序列号 2 或 20 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(c) 与上述 (a) 的核酸具有 90％以上的序列同一性且编码牵引丝蛋白的核酸
(d) 在严格的条件下与上述 (a) 的核酸的互补链杂交且编码牵引丝蛋白的核酸
另外， 本发明涉及 (2) 核酸， 其含有下述 (e) ～ (h) 中任一种的核酸， 并且其与具 有序列号 1 的碱基序列的核酸具有 70％以上、 优选 80％以上的序列同一性， 并编码牵引丝 蛋白。
(e) 具有序列号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 或 17 的碱基序列的核酸
(f) 编码具有序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(g) 与上述 (e) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸(h) 在严格的条件下与上述 (e) 的核酸的互补链杂交的核酸
另外， 本发明涉及 (3) 上述 (2) 所述的核酸， 其与具有序列号 1 的碱基序列的核酸 具有 80％以上的序列同一性。
另外， 本发明涉及 (4) 核酸， 其含有下述 (i) ～ (1) 中任一种的核酸， 并且其与具 有序列号 19 的碱基序列的核酸具有 70％以上、 优选 80％以上的序列同一性， 并编码牵引丝 蛋白。
(i) 具有序列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 或 35 的碱基序列的核酸
(j) 编码具有序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(k) 与上述 (i) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸
(l) 在严格的条件下与上述 (i) 的核酸的互补链杂交的核酸
另外， 本发明涉及 (5) 上述 (4) 所述的核酸， 其与具有序列号 19 的碱基序列的核 酸具有 80％以上的序列同一性。
另外， 本发明涉及 (6) 由上述 (1) ～ (5) 中任一种的核酸编码的蛋白质。
根据上述本发明的特定核酸， 可以编码与现有 MaSp 蛋白质不同的具有优异物性 的 MaSp 蛋白质 ( 牵引丝蛋白 )、 从而提供天然纤维的新原材料。 特别是， 由本发明的核酸编 码的牵引丝蛋白 ( 本发明的蛋白质 ) 具有比现有品更为优异的弹性 ( 或弹力、 伸缩性、 伸长 率、 柔软性 )， 适合用于以医疗用品、 衣料品等为代表的各种产业领域中需要弹性的用途中。
而且， 本发明涉及 (7) 导入有上述 (1) ～ (5) 中任一种核酸的重组生物及 (9) 由 上述 (7) 的重组生物制作的蛋白质。根据本发明的重组生物， 可以生产大量的由上述核酸 编码的物性优异的牵引丝蛋白。 由上述重组生物制作的蛋白质通过含有物性优异的牵引丝 蛋白， 适合用于各种产业领域中。
特别是， 本发明涉及 (8) 导入有上述 (1) ～ (5) 中任一种核酸的重组桑蚕及 (10) 由该重组桑蚕制作的蚕丝。根据本发明的重组桑蚕， 可以生产大量的含有由上述核酸编码 的物性优异的牵引丝蛋白的蚕丝。 由上述重组桑蚕制作的蚕丝通过含有物性优异的牵引丝 蛋白， 具有比现有蚕丝更为优异的物性、 特别是更为优异的弹性。
另外， 本发明涉及 (11) 具有下述 (m) 或 (n) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(m) 序列号 2 或 20 的氨基酸序列
(n) 与上述 (m) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
另外， 本发明涉及 (12) 具有下述 (o) 或 (p) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(o) 具有下述 (o1) 或 (o2) 的氨基酸序列且与序列号 2 的氨基酸序列具有 70％以 上、 优选 80％以上的序列同一性的氨基酸序列
(o1) 序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列
(o2) 与上述 (o1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
(p) 具有下述 (p1) 或 (p2) 的氨基酸序列且与序列号 20 的氨基酸序列具有 70％ 以上、 优选 80％以上的序列同一性的氨基酸序列
(p1) 序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列
(p2) 与上述 (p1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
另外， 本发明涉及 (13) 上述 (12) 所述的牵引丝蛋白， 其中， 上述 (o) 的氨基酸序 列与序列号 2 的氨基酸序列具有 80％以上的序列同一性、 上述 (p) 的氨基酸序列与序列号20 的氨基酸序列具有 80％以上的序列同一性。
而且， 本发明涉及 (14) 具有下式 (1) 所示的氨基酸序列或与式 (1) 所示的氨基酸 序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[X1-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7-X8]n (1)
上述式 (1) 中， m 各自独立地表示 0 或 1 的整数、 n 表示 1 ～ 10 的整数、 X1 表示序 列号 37 ～ 45 中的任一种氨基酸序列、 X2 表示序列号 46 ～ 52 中的任一种氨基酸序列、 X3 表示序列号 53 ～ 59 中的任一种氨基酸序列、 X4 表示序列号 49 的氨基酸序列、 X5 表示序列 号 60 或 61 的氨基酸序列、 X6 表示序列号 62 ～ 64 中的任一种氨基酸序列、 X7 表示序列号 65 ～ 70 中的任一种氨基酸序列、 X8 表示序列号 71 ～ 81 中的任一种氨基酸序列。
上述本发明的蛋白质由于其独特的结构而具有比现有牵引丝蛋白更为优异的物 性， 因而适合用于各种产业领域中。
根据本发明的核酸， 可以提供具有优异物性的蛋白质。 另外， 根据本发明的重组生 物， 可以生产大量的具有优异物性的蛋白质。特别是， 根据本发明的重组桑蚕， 可以生产大 量的具有优异物性的蚕丝。 由本发明提供的牵引丝蛋白或蚕丝具有特别优异的弹性。 如此， 根据本发明， 可以提供弹性等物性优异的天然纤维的新原材料。 附图说明
图 1 为表示 NP- 牵引丝蛋白 A 的 cDNA 序列的图。 图 2 为表示 NP- 牵引丝蛋白 A 的氨基酸序列的图。 图 3 为表示 Northen 杂交结果的照片图。 图 4 为表示 NP- 牵引丝蛋白 B 的 cDNA 序列的图。 图 5 为表示 NP- 牵引丝蛋白 B 的氨基酸序列的图。具体实施方式
以下根据需要参照着附图详细地说明用于实施本发明的方式。 但本发明并不限定 于以下的实施方式。
本发明涉及下述 (a) ～ (d) 中任一种的核酸。
(a) 具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸
(b) 编码具有序列号 2 或 20 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(c) 与上述 (a) 的核酸具有 90％以上的序列同一性且编码牵引丝蛋白的核酸
(d) 在严格的条件下与上述 (a) 的核酸的互补链杂交且编码牵引丝蛋白的核酸
首先， 本发明涉及具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸 (a)。序列号 1 或 19 的碱 基序列均是对作为构成络新妇属人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的牵引丝的蛋白质主要成分 的被称作大壶状腺丝蛋白 (Major Ampullate Spidroin ： MaSp) 的蛋白质 ( 多肽 ) 进行编码 的基因。本说明书中， 将由具有序列号 1 的碱基序列的核酸编码的蛋白质称作 “NP- 牵引丝 蛋白 A” 、 将由具有序列号 19 的碱基序列的核酸编码的蛋白质称作 “NP- 牵引丝蛋白 B” 。这 些核酸 (a) 不需要由人面蜘蛛获取， 只要是具有序列号 1 或 19 的碱基序列， 则可以通过人 工合成或由基因组文库或 cDNA 文库获取， 还可以是用 PCR 对它们进行扩增而得到的核酸或 者用限制酶将它们进行切断而得到的核酸。本发明的核酸还可以是编码具有序列号 2 或 20 的氨基酸序列的蛋白质的核酸 (b)。序列号 2 或 20 的氨基酸序列均为人面蜘蛛的 MaSp 蛋白质所具有的氨基酸序列。具 体地说， 序列号 2 的氨基酸序列为上述 NP- 牵引丝蛋白 A 所具有的氨基酸序列、 序列号 20 的氨基酸序列为上述 NP- 牵引丝蛋白 B 所具有的氨基酸序列。
另外， 本发明的核酸只要是编码牵引丝蛋白 (MaSp)， 则还可以是与具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸 (c)。上述序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
而且， 本发明的核酸只要是编码牵引丝蛋白， 则也可以是在严格的条件下与具有 序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸的互补链进行杂交的核酸 (d)。本说明书中， 核酸的 “互 补链” 是指基于核酸的碱基间的氢键而相对应的核酸序列 ( 例如 T 与 A 相对应、 C 与 G 相对 应 )。另外， “杂交” 是指在上述互补链之间发生的互补键合或者单链核酸分子间的碱基对 相互作用的形成。
本说明书中， “严格的条件 “是指相对于目标序列具有同源性的核苷酸链的互补链 优先地与目标序列杂交、 而不具有同源性的核苷酸链的互补链实质上不发生杂交的条件。 严格的条件是序列依赖性的， 在各种状况下有所不同。越长的序列在越高的温度下特异性 地发生杂交。一般来说， 严格的条件选择比规定的离子强度和 pH 下的特定序列的热熔融 温度 (Tm) 约低 5℃。Tm 是在规定的离子强度、 pH 和核酸浓度下与目标序列互补的核苷酸 的 50％以平衡状态与目标序列发生杂交的温度。 “严格的条件” 是序列依赖性的， 随各种环 境参数的不同而不同。核酸杂交的一般性方针可在 Tijssen(Tijssen(1993)、 Laboratory Technniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第 2 章 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay” 、 Elsevier， New York) 中找到。
代表性地来说， 严格的条件为盐浓度约小于 1.0M Na+、 代表性地是 pH7.0 ～ 8.3 下 + 约 0.01 ～ 1.0M 的 Na 浓度 ( 或其他的盐 )， 温度对于短核苷酸 ( 例如 10 ～ 50 个核苷酸 ) 而言至少约 30℃、 对于长核苷酸 ( 例如长于 50 个核苷酸 ) 而言至少约 60℃。 严格的条件还 可以通过添加甲酰胺等不稳定化剂来达成。作为本说明书中的严格的条件， 可举出在 50％ 的甲酰胺、 1M 的 NaCl、 1％的 SDS(37℃ ) 的缓冲溶液中的杂交、 和用 0.1×SSC 在 60℃下的 洗涤。
另外， 本发明的核酸只要是含有下述 (e) ～ (h) 中的任一种核酸且编码牵引丝蛋 白， 则也可以是与具有序列号 1 的碱基序列的核酸具有 70％以上的序列同一性的核酸。上 述序列同一性只要为 70％以上即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以上。
(e) 具有序列号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 或 17 的碱基序列的核酸
(f) 编码具有序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(g) 与上述 (e) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸
(h) 在严格的条件下与上述 (e) 的核酸的互补链杂交的核酸
上述序列号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 及 17 的碱基序列为在序列号 1 的碱基序列中在编 码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白的方面上具有重要特征的序列。 通过含有具有这种 特征序列的核酸， 即便是与具有序列号 1 的碱基序列的核酸仅有 70％以上的序列同一性的核酸， 也可与具有序列号 1 的碱基序列的核酸同样地编码本发明的具有优异物性的牵引丝 蛋白。
具有序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列的蛋白质分别为由上述序列 号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 或 17 的碱基序列编码的蛋白质。
上述核酸 (g) 中， 与核酸 (e) 的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以 上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
另外， 本发明的核酸只要是含有下述 (i) ～ (l) 中任一种的核酸且编码牵引丝蛋 白， 则也可以是与具有序列号 19 的碱基序列的核酸具有 70％以上的序列同一性的核酸。 上 述序列同一性只要为 70％以上即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以上。
(i) 具有序列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 或 35 的碱基序列的核酸
(j) 编码具有序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(k) 与上述 (i) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸
(l) 在严格的条件下与上述 (i) 的核酸的互补链杂交的核酸
上述序列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 及 35 的碱基序列是在序列号 19 的碱基序列 中在编码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白的方面上具有重要特征的序列。 通过含有具 有这种特征序列的核酸， 即便是与具有序列号 19 的碱基序列的核酸仅具有 70％以上的序 列同一性的核酸， 也可与具有序列号 19 的碱基序列的核酸同样地编码本发明的具有优异 物性的牵引丝蛋白。 具有序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列的蛋白质分别为由上述序 列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 或 35 的碱基序列编码的蛋白质。
上述核酸 (k) 中， 与核酸 (i) 的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以 上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
另外， 本发明涉及导入有上述本发明的核酸的重组生物及由该重组生物制作的蛋 白质。特别是本发明涉及导入有上述本发明的核酸的重组桑蚕及由该重组桑蚕制作的蚕 丝。
本说明书中， “重组生物” 是指利用基因重组将外来基因导入至染色体中进行了转 化的生物。 作为被转化的生物， 并无特别限定， 可以使用昆虫、 动物、 植物、 微生物等， 优选使 用昆虫。作为优选的昆虫， 可以举出桑蚕 (Bombyx mori)、 野桑蚕 (Bombyx mandarina)、 天 蚕 (Antheraea yamamai)、 柞蚕 (Antheraea pernyi) 等。 其中优选使用属于蚕蛾科的桑蚕、 野桑蚕等， 特别优选使用桑蚕。
本说明书中， “桑蚕” 是指蚕蛾属桑蚕 (Bombyx mori)。桑蚕可以是实验用的品种 也可以是经实用商品化的实用品种。另外， “重组桑蚕” 是指利用基因重组将外来基因导入 至桑蚕染色体中进行了转化的桑蚕。基因重组例如通过使用转座子的方法来进行， 但只要 是能够将外来基因导入至桑蚕中的方法则没有限定， 还可以通过电穿孔法等其他的方法来 进行基因重组。
本说明书中， “蚕丝” 是指由桑蚕 (Bombyx mori) 吐出的纤维， 其构成茧， 以丝蛋白 为主成分。丝蛋白由大小 2 个亚单元 (H 链及 L 链 ) 构成。
本说明书中， “人面蜘蛛” 是指络新妇属人面蜘蛛 (Nephila pilipes)， 对人面蜘蛛
的产地并无特别限定。
另外， 本发明涉及具有下述 (m) 或 (n) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(m) 序列号 2 或 20 的氨基酸序列
(n) 与上述 (m) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
上述氨基酸序列 (n) 中， 与上述 (m) 的氨基酸序列的序列同一性只要为 90％以上 即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
另外， 本发明涉及具有下述 (o) 或 (p) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(o) 具有下述 (o1) 或 (o2) 的氨基酸序列且与序列号 2 的氨基酸序列具有 70％以 上的序列同一性的氨基酸序列
(o1) 序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列
(o2) 与上述 (o1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
(p) 具有下述 (p1) 或 (p2) 的氨基酸序列且与序列号 20 的氨基酸序列具有 70％ 以上的序列同一性的氨基酸序列
(p1) 序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列
(p2) 与上述 (p1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
上述氨基酸序列 (o) 中， 与序列号 2 的氨基酸序列的序列同一性只要为 70％以上 即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以 上。
同样地， 上述氨基酸序列 (p) 中， 与序列号 20 的氨基酸序列的序列同一性只要为 70％以上即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以上。
另外， 上述氨基酸序列 (o2) 中， 与上述 (o1) 的氨基酸序列的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
同样地， 上述氨基酸序列 (p2) 中， 与上述 (p1) 的氨基酸序列的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
进而， 本发明涉及具有以下式 (1) 所示的氨基酸序列的蛋白质。
[X1-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7-X8]n (1)
上述式 (1) 所示的氨基酸序列具有 n 个由 [X1-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7-X8] 所示的重复单元。对重复单元的数量 (n) 并无特别限定， 优选为 1 ～ 10、 更优选为 2 ～ 9、 进一步优选为 3 ～ 8、 特别优选 n ＝ 8。
式 (1) 中， m 各自独立地表示 0 或 1 的整数。即， 每个重复单元中， 既有具有 X4、 X5 或 X6 所示的氨基酸序列的情况， 也有不具有 X4、 X5 或 X6 所示的氨基酸序列的情况。
式 (1) 中， X1 表示序列号 37 ～ 45 中的任一种氨基酸序列、 X2 表示序列号 46 ～ 52 中的任一种氨基酸序列、 X3 表示序列号 53 ～ 59 中的任一种氨基酸序列、 X4 表示序列号 49 的氨基酸序列、 X5 表示序列号 60 或 61 的氨基酸序列、 X6 表示序列号 62 ～ 64 中的任一 种氨基酸序列、 X7 表示序列号 65 ～ 70 中的任一种氨基酸序列、 X8 表示序列号 71 ～ 81 中 的任一种氨基酸序列。
另外， 本发明的蛋白质还可以是具有与上述式 (1) 所示的氨基酸序列具有 90％以 上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。上述序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
图 1 是表示作为人面蜘蛛的 MaSp 蛋白质中的 1 种的 NP- 牵引丝蛋白 A 的 cDNA 序 列的图。图 1 所示的基因序列与序列号 1 的碱基序列相同。
图 2 是表示由具有图 1 所示基因序列 ( 序列号 1 的碱基序列 ) 的核酸编码的 NP- 牵 引丝蛋白 A 的氨基酸序列的图。图 2 所示的氨基酸序列与序列号的碱基序列相同。
另外， 图 4 是表示作为人面蜘蛛的 MaSp 蛋白质中的另 1 种的 NP- 牵引丝蛋白 B 的 cDNA 序列的图。图 4 所示的基因序列与序列号 19 的碱基序列相同。
图 5 是表示由具有图 4 所示基因序列 ( 序列号 19 的碱基序列 ) 的核酸编码的 NP- 牵引丝蛋白 B 的氨基酸序列的图。图 5 所示的氨基酸序列与序列号 20 的碱基序列相 同。
如图 2 或图 5 所示， 由具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸编码的牵引丝蛋白是 由下述式 (2) 所示的氨基酸序列构成的。
[(α)(V)(β)]q (2)
上述式 (2) 所示的氨基酸序列具有 q 个 [(α)(V)(β)] 所示的重复单元。对重复 单元的数量 (q) 并无特别限定， 只要为 1 ～ 100 即可， 优选为 1 ～ 10、 更优选为 2 ～ 9、 进一 步优选为 3 ～ 8、 特别优选 q ＝ 8。 上述式 (2) 中， (α) 是由连续具有 2 ～ 4 个 GGX 的富含甘氨酸的序列构成， 表示 形成非结晶性 α- 螺旋结构的无定形区域。(V) 表示 GX 含有率高的伪结晶区域、 (β) 表示 富含丙氨酸或苏氨酸的形成 β 折叠的结晶区域。
上述 (α) 及 (V) 所含的 X 多为谷氨酰胺、 丙氨酸、 丝氨酸、 亮氨酸、 脯氨酸、 酪氨酸 等， 但并不限定于这些， 还可以是其他的氨基酸。另外， X 并不必须是相同的氨基酸。
以下， 对图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白所具有的独特的分子结构以及由此获得的 牵引丝蛋白的物性进行说明。
首先， 在图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白的 (α) 区域 ( 非结晶性无定形区域 ) 中， 4 个 GGX 连续地排列。通过这种排列， 牵引丝形成 α- 螺旋结构。α- 螺旋结构通常在纤维 中以弯曲的状态存在， 通过拉伸而沿着纤维轴变成直链状结构。 这样， 相对于来自外部的应 力， α- 螺旋结构大幅度伸展， 从而赋予纤维以弹性。另一方面， 以往公知的蜘蛛牵引丝蛋 白 (MaSp) 中未见 4 个 GGX 连续排列的结构 ( 参照非专利文献 1、 2 等 )。由以上可知， 通过 在 (α) 区域中形成 4 个 GGX 连续排列的独立结构， 由本发明获得的牵引丝蛋白的弹性 ( 或 弹力、 伸缩性、 伸长率、 柔软性 ) 变得优异。
此外， 以下文献也记载了 GGX 重复基序赋予丝以弹性。
·Cheryl Y.Hayashi et al.， Evidence from Flagelliform Silk cDNA for the Structural Basis of Elasticity and Modular Nature of Spider Silks， 1998， p.779
·Thomas Scheibel ， Spider silks ： recombinant synthesis ， assembly ， spinning， and engineering of synthetic proteins， 2004， p.2
另外， 图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白的 (V) 区域 ( 伪结晶区域 ) 中富含亲水性氨基 酸。 如表 1 所示， 图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白与目前公知的金丝蜘蛛 (Nephila clavipes) 或日本产横带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 的牵引丝蛋白相比， 含有更多的亲水性氨基酸。 由此认为， 由本发明获得的牵引丝蛋白的吸湿性变高。 另外认为， 牵引丝蛋白的结晶化度低
也成为使吸湿性增加的要因。
而且， 在图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白的 (β) 区域 ( 结晶区域 ) 中， 在聚丙氨酸 的间隔间含有苏氨酸、 天冬酰胺等极性氨基酸。认为由本发明获得的牵引丝蛋白通过如此 具有极性氨基酸丰富的聚丙氨酸 (Poly(A)) 基序， 变得具有优异的强韧性。
此外， 以下的文献也记载了极性氨基酸丰富的聚丙氨酸 (Poly(A)) 基序赋予丝以 强韧性。
·Glareh Askarieh et al.， Self-assembly of spider silk proteins is controlled by a pH-sensitive relay， 2010， vol.465， p.1
· J.M.GOSLINE， et al.， THE MECHANICAL DESIGN OF SPIDER SILKS ： FROM FIBROIN SEQUENCE TO MECHANICAL FUNCTION， 1999， p.3299
另外， 如表 1 所示， 图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白相对于以往公知的金丝蜘蛛 (Nephila clavipes) 或日本产横带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 含有约 2 倍的极性氨基 酸。 这样大量存在于分子内的极性氨基酸残基通过相对于来自外部的应力沿着应力的方向 规则地排列分子、 增大分子间的作用力， 从而使牵引丝具有优异的强度。 特别是认为分子间 的氢键有助于丝纤维的强度增加。 表 1 示出人面蜘蛛 (Nephila pilipes)、 金丝蜘蛛 (Nephila clavipes)、 日本产横 带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 的 MaSp 蛋白质中的极性氨基酸及亲水性氨基酸的含有率 (％ )。此外， 极性氨基酸的含有率表示 N(Asn)、 C(Cys)、 Q(Gln)、 S(Ser)、 T(Thr) 及 Y(Tyr) 的含有率， 亲水性氨基酸的含有率表示 R(Arg)、 N(Asn)、 D(Asp)、 Q(Gln)、 E(Glu)、 H(His)、 K(Lys)、 S(Ser) 及 T(Thr) 的含有率。
表1
极性氨基酸 (％ ) 人面蜘蛛 金丝蜘蛛 日本产横带人面蜘蛛
31.05 15.71 15.15 亲水性氨基酸 (％ ) 29.41 14.85 11.01实施例
以下举出实施例更加具体地说明本发明。但本发明并不限定于以下的实施例。
作为受试动物， 使用 7 月采集的人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的雌成虫。
(RNA 抽提 )
总 RNA 由人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的大壶状腺体准备。在生理盐水 (NaCl 0.75％ ) 中解剖蜘蛛的大壶状腺体， 添加 1ml 的 TRIZOL 并充分粉碎。悬浮液用 200μl 的 氯仿进行分离除去。将水层移至其他的管中， 添加等量的异丙醇， 使 RNA 沉淀。用 75％乙醇 淋洗沉淀物， 在 -80℃下进行保存。之后， 在 7500rpm、 4℃下离心分离 5 分钟， 真空干燥 8 分 钟后， 溶解于无 RNase 水中。在 55℃下将 RNA 溶解 10 分钟后， 作为样品使用。确认了通过 对样品进行琼脂糖电泳， 可以抽提出 RNA。
(cDNA 文库的构建 )利用 G- 封端 (G-Capping) 法来合成和构建大壶状腺体的 cDNA 文库委托给了 Takara-bio 株式会社。文库载体 (pDNR-LIB) 溶解于约 50μl 的 TE 中。
( 克隆和测序 )
为了以高概率进行转化， 使用了电穿孔法。作为 DNA 溶液， 使用准备好的 cDNA 文 TM 库溶液 ； 作为感受态细胞， 使用 Invitrogen 公司制 “Electro MAX DH12STM Cells” (Cat. No.18312-017)， 使用 0.1cm 尺寸的样品池。
首先， 预先在冰上冷却样品池， 在冰上溶解放入在管中的感受态细胞 ( ＞ 1010cfu/ μg)50μl 后， 将 1μl 的 cDNA 文库溶液添加于管中。将该混合液均一地移至样品池中。电 穿孔的条件是 ： 电压为 2.5kV、 脉冲控制器 (R2-7) 为 200Ω、 电容为 25μF。 施加一次脉冲， 尽 快在样品池内添加 1ml 的 SOC 培养基 (2％胰蛋白胨、 0.5％酵母提取物、 10mM NaCl、 2.5mM KCl、 10mM MgCl2、 10mM MgSO4、 20mM 葡萄糖 )， 将溶液悬浮。将悬浮液移至培养管中培养 1 小 时～ 1 个半小时后， 接种于含抗生素 ( 氨苄青霉素 )、 IPTG 及 X-Gal 的 LB 板 (1％胰蛋白胨、 0.5％酵母提取物、 0.5％ NaCl) 中。将在板上形成的白色菌落植菌至 LB(+ 氨苄青霉素 ) 培 养基中， 随机选择 588 个重组质粒， 使用 FlexiPrepTMKit(Amersham 公司制 ) 进行纯化。
( 测序与序列的比较解析 ) 插入的序列使用 “ABI Prism genetic analyzer 3100” (Life technologies Japan 株式会社制 ) 和 T7 引物进行分析。DNA 和氨基酸序列的计算机分析使用 “Genetyx package” ( 株式会社 Genetec 制 ) 和 “Sequencher 4.14” (Demo Version)(Gene Codes 公 司制 ) 进行。 序列的比较通过对蛋白质的数据库利用 ExPASy Proteomics server(http:// www.expasy.org) 的 SIB BLAST Network 进行同源性分析。
( 证明丝腺特异性表达的实验 )
MaSp(major ampullate spidroin) 如名称所示， 是在大壶状腺体进行表达。为了 证明本发明的基因在大壶状腺体内起作用， 进行使用 cDNA 序列的 3’ 末端 ( 氨基酸序列的 C 末端 ) 序列制作的探针与由蜘蛛的四种丝腺 ( 鞭状腺、 管状腺、 大壶状腺体、 小壶状腺体 ) 抽提出的 RNA 的 Northern 杂交实验。图 3 为表示 Northern 杂交的结果的图。图 3 的条带 1 ～ 4 依次流过由鞭状腺、 管状腺、 大壶状腺体、 小壶状腺体抽提出的 RNA。由此结果可知， 本发明的基因 ( 核酸 ) 在人面蜘蛛的大壶状腺体内特异性地表达。另外， 推测转印物质的 分子量约为 3 ～ 4kb。
( 牵引丝的物性评价 )
为了比较人面蜘蛛的牵引丝和目前公知的蜘蛛的牵引丝的物性， 测定各自的伸长 率 ( 弹性模量 )。伸长率的测定如下进行 ： 将在从测定前一天开始在 20℃、 RH65％下放置 24 小时而调整了吸湿量的 20mm 的各牵引丝为样品， 在 20℃、 RH65％下、 在拉伸速度为 20mm/ min 的条件下进行使用了拉伸试验机 “Tensilon UTM-III-100” (Toyo Baldwin 公司制 ) 的 伸长率试验。作为目前公知的蜘蛛， 使用日本产横带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 及横纹 金蛛 (Argiope bruennichi)。将结果示于表 2。
表2
12102399786 A CN 102399785说明书伸长率10/10 页横纹金蛛 日本产横带人面蜘蛛 人面蜘蛛
26.1 22.3 29.4由表 2 所示可知， 人面蜘蛛的牵引丝与目前公知的蜘蛛的牵引丝相比， 具有更为 优异的弹性。即， 本发明的核酸编码具有优异弹性的牵引丝蛋白。
背景技术 蜘蛛的丝作为因兼具强度和弹性而具有优异强韧性的天然高性能聚合物而为人 所知。蜘蛛中存在最多 7 个经特化的腺体， 这些腺体产生性质不同的多种蜘蛛丝， 其中由大 壶状腺体产生的牵引丝作为最强韧的蜘蛛丝在医疗、 航空、 衣料等各种产业领域中的新原 材料的开发中备受关注。
作为构成牵引丝的主要蛋白质， 已知被称作大壶状腺丝蛋白 (Major Ampullate Spidroin ： MaSp) 的 蛋 白 质， 目 前 编 码 黑 寡 妇 蜘 蛛 (Latrodectus hesperus)、 几何寇 蛛 (Latrodectus geometricus)、 金 丝 蜘 蛛 (Nephila clavipes) 等 各 种 蜘 蛛 的 MaSp 蛋 白质的基因序列已经清楚 ( 非专利文献 1 ： Nadia A.Ayoub et al.， Blueprint for a
作为构成牵引丝的主要蛋白质， 已知被称作大壶状腺丝蛋白 (Major Ampullate Spidroin ： MaSp) 的 蛋 白 质， 目 前 编 码 黑 寡 妇 蜘 蛛 (Latrodectus hesperus)、 几何寇 蛛 (Latrodectus geometricus)、 金 丝 蜘 蛛 (Nephila clavipes) 等 各 种 蜘 蛛 的 MaSp 蛋 白质的基因序列已经清楚 ( 非专利文献 1 ： Nadia A.Ayoub et al.， Blueprint for a
High-Performance Biomaterial ： Full-Length Spider Dragline Silk Genes， 2007， Issue 6， e514 ； 非 专 利 文 献 2： William A.Gaines IV et al.， Identification and Characterization of Multiple Spidroin 1 Genes Encoding Major Ampullate Silk Proteins in Nephila clavipes， Insect Mol Biol， 2008， 17(5)， 465-474 等 )。 发明内容
但是， 在各产业领域中， 对具有优异物性的天然纤维的需求有所增加的同时， 期待 更新的原材料的开发。
因而， 本发明的目的在于提供在天然纤维中具有优异物性的新原材料。
本发明人等为了达成上述目的反复进行了深入研究， 结果发现， 编码构成人面蜘 蛛 (Nephila pillipes) 的牵引丝的 MaSp 蛋白质的基因具有与目前已知的 MaSp 基因不同 的独特结构， 进而完成了本发明。
即， 本发明涉及 (1) 下述 (a) ～ (d) 中任一种的核酸。
(a) 具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸
(b) 编码具有序列号 2 或 20 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(c) 与上述 (a) 的核酸具有 90％以上的序列同一性且编码牵引丝蛋白的核酸
(d) 在严格的条件下与上述 (a) 的核酸的互补链杂交且编码牵引丝蛋白的核酸
另外， 本发明涉及 (2) 核酸， 其含有下述 (e) ～ (h) 中任一种的核酸， 并且其与具 有序列号 1 的碱基序列的核酸具有 70％以上、 优选 80％以上的序列同一性， 并编码牵引丝 蛋白。
(e) 具有序列号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 或 17 的碱基序列的核酸
(f) 编码具有序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(g) 与上述 (e) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸(h) 在严格的条件下与上述 (e) 的核酸的互补链杂交的核酸
另外， 本发明涉及 (3) 上述 (2) 所述的核酸， 其与具有序列号 1 的碱基序列的核酸 具有 80％以上的序列同一性。
另外， 本发明涉及 (4) 核酸， 其含有下述 (i) ～ (1) 中任一种的核酸， 并且其与具 有序列号 19 的碱基序列的核酸具有 70％以上、 优选 80％以上的序列同一性， 并编码牵引丝 蛋白。
(i) 具有序列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 或 35 的碱基序列的核酸
(j) 编码具有序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(k) 与上述 (i) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸
(l) 在严格的条件下与上述 (i) 的核酸的互补链杂交的核酸
另外， 本发明涉及 (5) 上述 (4) 所述的核酸， 其与具有序列号 19 的碱基序列的核 酸具有 80％以上的序列同一性。
另外， 本发明涉及 (6) 由上述 (1) ～ (5) 中任一种的核酸编码的蛋白质。
根据上述本发明的特定核酸， 可以编码与现有 MaSp 蛋白质不同的具有优异物性 的 MaSp 蛋白质 ( 牵引丝蛋白 )、 从而提供天然纤维的新原材料。 特别是， 由本发明的核酸编 码的牵引丝蛋白 ( 本发明的蛋白质 ) 具有比现有品更为优异的弹性 ( 或弹力、 伸缩性、 伸长 率、 柔软性 )， 适合用于以医疗用品、 衣料品等为代表的各种产业领域中需要弹性的用途中。
而且， 本发明涉及 (7) 导入有上述 (1) ～ (5) 中任一种核酸的重组生物及 (9) 由 上述 (7) 的重组生物制作的蛋白质。根据本发明的重组生物， 可以生产大量的由上述核酸 编码的物性优异的牵引丝蛋白。 由上述重组生物制作的蛋白质通过含有物性优异的牵引丝 蛋白， 适合用于各种产业领域中。
特别是， 本发明涉及 (8) 导入有上述 (1) ～ (5) 中任一种核酸的重组桑蚕及 (10) 由该重组桑蚕制作的蚕丝。根据本发明的重组桑蚕， 可以生产大量的含有由上述核酸编码 的物性优异的牵引丝蛋白的蚕丝。 由上述重组桑蚕制作的蚕丝通过含有物性优异的牵引丝 蛋白， 具有比现有蚕丝更为优异的物性、 特别是更为优异的弹性。
另外， 本发明涉及 (11) 具有下述 (m) 或 (n) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(m) 序列号 2 或 20 的氨基酸序列
(n) 与上述 (m) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
另外， 本发明涉及 (12) 具有下述 (o) 或 (p) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(o) 具有下述 (o1) 或 (o2) 的氨基酸序列且与序列号 2 的氨基酸序列具有 70％以 上、 优选 80％以上的序列同一性的氨基酸序列
(o1) 序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列
(o2) 与上述 (o1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
(p) 具有下述 (p1) 或 (p2) 的氨基酸序列且与序列号 20 的氨基酸序列具有 70％ 以上、 优选 80％以上的序列同一性的氨基酸序列
(p1) 序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列
(p2) 与上述 (p1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
另外， 本发明涉及 (13) 上述 (12) 所述的牵引丝蛋白， 其中， 上述 (o) 的氨基酸序 列与序列号 2 的氨基酸序列具有 80％以上的序列同一性、 上述 (p) 的氨基酸序列与序列号20 的氨基酸序列具有 80％以上的序列同一性。
而且， 本发明涉及 (14) 具有下式 (1) 所示的氨基酸序列或与式 (1) 所示的氨基酸 序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[X1-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7-X8]n (1)
上述式 (1) 中， m 各自独立地表示 0 或 1 的整数、 n 表示 1 ～ 10 的整数、 X1 表示序 列号 37 ～ 45 中的任一种氨基酸序列、 X2 表示序列号 46 ～ 52 中的任一种氨基酸序列、 X3 表示序列号 53 ～ 59 中的任一种氨基酸序列、 X4 表示序列号 49 的氨基酸序列、 X5 表示序列 号 60 或 61 的氨基酸序列、 X6 表示序列号 62 ～ 64 中的任一种氨基酸序列、 X7 表示序列号 65 ～ 70 中的任一种氨基酸序列、 X8 表示序列号 71 ～ 81 中的任一种氨基酸序列。
上述本发明的蛋白质由于其独特的结构而具有比现有牵引丝蛋白更为优异的物 性， 因而适合用于各种产业领域中。
根据本发明的核酸， 可以提供具有优异物性的蛋白质。 另外， 根据本发明的重组生 物， 可以生产大量的具有优异物性的蛋白质。特别是， 根据本发明的重组桑蚕， 可以生产大 量的具有优异物性的蚕丝。 由本发明提供的牵引丝蛋白或蚕丝具有特别优异的弹性。 如此， 根据本发明， 可以提供弹性等物性优异的天然纤维的新原材料。 附图说明
图 1 为表示 NP- 牵引丝蛋白 A 的 cDNA 序列的图。 图 2 为表示 NP- 牵引丝蛋白 A 的氨基酸序列的图。 图 3 为表示 Northen 杂交结果的照片图。 图 4 为表示 NP- 牵引丝蛋白 B 的 cDNA 序列的图。 图 5 为表示 NP- 牵引丝蛋白 B 的氨基酸序列的图。具体实施方式
以下根据需要参照着附图详细地说明用于实施本发明的方式。 但本发明并不限定 于以下的实施方式。
本发明涉及下述 (a) ～ (d) 中任一种的核酸。
(a) 具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸
(b) 编码具有序列号 2 或 20 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(c) 与上述 (a) 的核酸具有 90％以上的序列同一性且编码牵引丝蛋白的核酸
(d) 在严格的条件下与上述 (a) 的核酸的互补链杂交且编码牵引丝蛋白的核酸
首先， 本发明涉及具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸 (a)。序列号 1 或 19 的碱 基序列均是对作为构成络新妇属人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的牵引丝的蛋白质主要成分 的被称作大壶状腺丝蛋白 (Major Ampullate Spidroin ： MaSp) 的蛋白质 ( 多肽 ) 进行编码 的基因。本说明书中， 将由具有序列号 1 的碱基序列的核酸编码的蛋白质称作 “NP- 牵引丝 蛋白 A” 、 将由具有序列号 19 的碱基序列的核酸编码的蛋白质称作 “NP- 牵引丝蛋白 B” 。这 些核酸 (a) 不需要由人面蜘蛛获取， 只要是具有序列号 1 或 19 的碱基序列， 则可以通过人 工合成或由基因组文库或 cDNA 文库获取， 还可以是用 PCR 对它们进行扩增而得到的核酸或 者用限制酶将它们进行切断而得到的核酸。本发明的核酸还可以是编码具有序列号 2 或 20 的氨基酸序列的蛋白质的核酸 (b)。序列号 2 或 20 的氨基酸序列均为人面蜘蛛的 MaSp 蛋白质所具有的氨基酸序列。具 体地说， 序列号 2 的氨基酸序列为上述 NP- 牵引丝蛋白 A 所具有的氨基酸序列、 序列号 20 的氨基酸序列为上述 NP- 牵引丝蛋白 B 所具有的氨基酸序列。
另外， 本发明的核酸只要是编码牵引丝蛋白 (MaSp)， 则还可以是与具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸 (c)。上述序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
而且， 本发明的核酸只要是编码牵引丝蛋白， 则也可以是在严格的条件下与具有 序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸的互补链进行杂交的核酸 (d)。本说明书中， 核酸的 “互 补链” 是指基于核酸的碱基间的氢键而相对应的核酸序列 ( 例如 T 与 A 相对应、 C 与 G 相对 应 )。另外， “杂交” 是指在上述互补链之间发生的互补键合或者单链核酸分子间的碱基对 相互作用的形成。
本说明书中， “严格的条件 “是指相对于目标序列具有同源性的核苷酸链的互补链 优先地与目标序列杂交、 而不具有同源性的核苷酸链的互补链实质上不发生杂交的条件。 严格的条件是序列依赖性的， 在各种状况下有所不同。越长的序列在越高的温度下特异性 地发生杂交。一般来说， 严格的条件选择比规定的离子强度和 pH 下的特定序列的热熔融 温度 (Tm) 约低 5℃。Tm 是在规定的离子强度、 pH 和核酸浓度下与目标序列互补的核苷酸 的 50％以平衡状态与目标序列发生杂交的温度。 “严格的条件” 是序列依赖性的， 随各种环 境参数的不同而不同。核酸杂交的一般性方针可在 Tijssen(Tijssen(1993)、 Laboratory Technniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第 2 章 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay” 、 Elsevier， New York) 中找到。
代表性地来说， 严格的条件为盐浓度约小于 1.0M Na+、 代表性地是 pH7.0 ～ 8.3 下 + 约 0.01 ～ 1.0M 的 Na 浓度 ( 或其他的盐 )， 温度对于短核苷酸 ( 例如 10 ～ 50 个核苷酸 ) 而言至少约 30℃、 对于长核苷酸 ( 例如长于 50 个核苷酸 ) 而言至少约 60℃。 严格的条件还 可以通过添加甲酰胺等不稳定化剂来达成。作为本说明书中的严格的条件， 可举出在 50％ 的甲酰胺、 1M 的 NaCl、 1％的 SDS(37℃ ) 的缓冲溶液中的杂交、 和用 0.1×SSC 在 60℃下的 洗涤。
另外， 本发明的核酸只要是含有下述 (e) ～ (h) 中的任一种核酸且编码牵引丝蛋 白， 则也可以是与具有序列号 1 的碱基序列的核酸具有 70％以上的序列同一性的核酸。上 述序列同一性只要为 70％以上即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以上。
(e) 具有序列号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 或 17 的碱基序列的核酸
(f) 编码具有序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(g) 与上述 (e) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸
(h) 在严格的条件下与上述 (e) 的核酸的互补链杂交的核酸
上述序列号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 及 17 的碱基序列为在序列号 1 的碱基序列中在编 码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白的方面上具有重要特征的序列。 通过含有具有这种 特征序列的核酸， 即便是与具有序列号 1 的碱基序列的核酸仅有 70％以上的序列同一性的核酸， 也可与具有序列号 1 的碱基序列的核酸同样地编码本发明的具有优异物性的牵引丝 蛋白。
具有序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列的蛋白质分别为由上述序列 号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 或 17 的碱基序列编码的蛋白质。
上述核酸 (g) 中， 与核酸 (e) 的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以 上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
另外， 本发明的核酸只要是含有下述 (i) ～ (l) 中任一种的核酸且编码牵引丝蛋 白， 则也可以是与具有序列号 19 的碱基序列的核酸具有 70％以上的序列同一性的核酸。 上 述序列同一性只要为 70％以上即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以上。
(i) 具有序列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 或 35 的碱基序列的核酸
(j) 编码具有序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(k) 与上述 (i) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸
(l) 在严格的条件下与上述 (i) 的核酸的互补链杂交的核酸
上述序列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 及 35 的碱基序列是在序列号 19 的碱基序列 中在编码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白的方面上具有重要特征的序列。 通过含有具 有这种特征序列的核酸， 即便是与具有序列号 19 的碱基序列的核酸仅具有 70％以上的序 列同一性的核酸， 也可与具有序列号 19 的碱基序列的核酸同样地编码本发明的具有优异 物性的牵引丝蛋白。 具有序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列的蛋白质分别为由上述序 列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 或 35 的碱基序列编码的蛋白质。
上述核酸 (k) 中， 与核酸 (i) 的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以 上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
另外， 本发明涉及导入有上述本发明的核酸的重组生物及由该重组生物制作的蛋 白质。特别是本发明涉及导入有上述本发明的核酸的重组桑蚕及由该重组桑蚕制作的蚕 丝。
本说明书中， “重组生物” 是指利用基因重组将外来基因导入至染色体中进行了转 化的生物。 作为被转化的生物， 并无特别限定， 可以使用昆虫、 动物、 植物、 微生物等， 优选使 用昆虫。作为优选的昆虫， 可以举出桑蚕 (Bombyx mori)、 野桑蚕 (Bombyx mandarina)、 天 蚕 (Antheraea yamamai)、 柞蚕 (Antheraea pernyi) 等。 其中优选使用属于蚕蛾科的桑蚕、 野桑蚕等， 特别优选使用桑蚕。
本说明书中， “桑蚕” 是指蚕蛾属桑蚕 (Bombyx mori)。桑蚕可以是实验用的品种 也可以是经实用商品化的实用品种。另外， “重组桑蚕” 是指利用基因重组将外来基因导入 至桑蚕染色体中进行了转化的桑蚕。基因重组例如通过使用转座子的方法来进行， 但只要 是能够将外来基因导入至桑蚕中的方法则没有限定， 还可以通过电穿孔法等其他的方法来 进行基因重组。
本说明书中， “蚕丝” 是指由桑蚕 (Bombyx mori) 吐出的纤维， 其构成茧， 以丝蛋白 为主成分。丝蛋白由大小 2 个亚单元 (H 链及 L 链 ) 构成。
本说明书中， “人面蜘蛛” 是指络新妇属人面蜘蛛 (Nephila pilipes)， 对人面蜘蛛
的产地并无特别限定。
另外， 本发明涉及具有下述 (m) 或 (n) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(m) 序列号 2 或 20 的氨基酸序列
(n) 与上述 (m) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
上述氨基酸序列 (n) 中， 与上述 (m) 的氨基酸序列的序列同一性只要为 90％以上 即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
另外， 本发明涉及具有下述 (o) 或 (p) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(o) 具有下述 (o1) 或 (o2) 的氨基酸序列且与序列号 2 的氨基酸序列具有 70％以 上的序列同一性的氨基酸序列
(o1) 序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列
(o2) 与上述 (o1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
(p) 具有下述 (p1) 或 (p2) 的氨基酸序列且与序列号 20 的氨基酸序列具有 70％ 以上的序列同一性的氨基酸序列
(p1) 序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列
(p2) 与上述 (p1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
上述氨基酸序列 (o) 中， 与序列号 2 的氨基酸序列的序列同一性只要为 70％以上 即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以 上。
同样地， 上述氨基酸序列 (p) 中， 与序列号 20 的氨基酸序列的序列同一性只要为 70％以上即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以上。
另外， 上述氨基酸序列 (o2) 中， 与上述 (o1) 的氨基酸序列的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
同样地， 上述氨基酸序列 (p2) 中， 与上述 (p1) 的氨基酸序列的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
进而， 本发明涉及具有以下式 (1) 所示的氨基酸序列的蛋白质。
[X1-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7-X8]n (1)
上述式 (1) 所示的氨基酸序列具有 n 个由 [X1-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7-X8] 所示的重复单元。对重复单元的数量 (n) 并无特别限定， 优选为 1 ～ 10、 更优选为 2 ～ 9、 进一步优选为 3 ～ 8、 特别优选 n ＝ 8。
式 (1) 中， m 各自独立地表示 0 或 1 的整数。即， 每个重复单元中， 既有具有 X4、 X5 或 X6 所示的氨基酸序列的情况， 也有不具有 X4、 X5 或 X6 所示的氨基酸序列的情况。
式 (1) 中， X1 表示序列号 37 ～ 45 中的任一种氨基酸序列、 X2 表示序列号 46 ～ 52 中的任一种氨基酸序列、 X3 表示序列号 53 ～ 59 中的任一种氨基酸序列、 X4 表示序列号 49 的氨基酸序列、 X5 表示序列号 60 或 61 的氨基酸序列、 X6 表示序列号 62 ～ 64 中的任一 种氨基酸序列、 X7 表示序列号 65 ～ 70 中的任一种氨基酸序列、 X8 表示序列号 71 ～ 81 中 的任一种氨基酸序列。
另外， 本发明的蛋白质还可以是具有与上述式 (1) 所示的氨基酸序列具有 90％以 上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。上述序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
图 1 是表示作为人面蜘蛛的 MaSp 蛋白质中的 1 种的 NP- 牵引丝蛋白 A 的 cDNA 序 列的图。图 1 所示的基因序列与序列号 1 的碱基序列相同。
图 2 是表示由具有图 1 所示基因序列 ( 序列号 1 的碱基序列 ) 的核酸编码的 NP- 牵 引丝蛋白 A 的氨基酸序列的图。图 2 所示的氨基酸序列与序列号的碱基序列相同。
另外， 图 4 是表示作为人面蜘蛛的 MaSp 蛋白质中的另 1 种的 NP- 牵引丝蛋白 B 的 cDNA 序列的图。图 4 所示的基因序列与序列号 19 的碱基序列相同。
图 5 是表示由具有图 4 所示基因序列 ( 序列号 19 的碱基序列 ) 的核酸编码的 NP- 牵引丝蛋白 B 的氨基酸序列的图。图 5 所示的氨基酸序列与序列号 20 的碱基序列相 同。
如图 2 或图 5 所示， 由具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸编码的牵引丝蛋白是 由下述式 (2) 所示的氨基酸序列构成的。
[(α)(V)(β)]q (2)
上述式 (2) 所示的氨基酸序列具有 q 个 [(α)(V)(β)] 所示的重复单元。对重复 单元的数量 (q) 并无特别限定， 只要为 1 ～ 100 即可， 优选为 1 ～ 10、 更优选为 2 ～ 9、 进一 步优选为 3 ～ 8、 特别优选 q ＝ 8。 上述式 (2) 中， (α) 是由连续具有 2 ～ 4 个 GGX 的富含甘氨酸的序列构成， 表示 形成非结晶性 α- 螺旋结构的无定形区域。(V) 表示 GX 含有率高的伪结晶区域、 (β) 表示 富含丙氨酸或苏氨酸的形成 β 折叠的结晶区域。
上述 (α) 及 (V) 所含的 X 多为谷氨酰胺、 丙氨酸、 丝氨酸、 亮氨酸、 脯氨酸、 酪氨酸 等， 但并不限定于这些， 还可以是其他的氨基酸。另外， X 并不必须是相同的氨基酸。
以下， 对图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白所具有的独特的分子结构以及由此获得的 牵引丝蛋白的物性进行说明。
首先， 在图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白的 (α) 区域 ( 非结晶性无定形区域 ) 中， 4 个 GGX 连续地排列。通过这种排列， 牵引丝形成 α- 螺旋结构。α- 螺旋结构通常在纤维 中以弯曲的状态存在， 通过拉伸而沿着纤维轴变成直链状结构。 这样， 相对于来自外部的应 力， α- 螺旋结构大幅度伸展， 从而赋予纤维以弹性。另一方面， 以往公知的蜘蛛牵引丝蛋 白 (MaSp) 中未见 4 个 GGX 连续排列的结构 ( 参照非专利文献 1、 2 等 )。由以上可知， 通过 在 (α) 区域中形成 4 个 GGX 连续排列的独立结构， 由本发明获得的牵引丝蛋白的弹性 ( 或 弹力、 伸缩性、 伸长率、 柔软性 ) 变得优异。
此外， 以下文献也记载了 GGX 重复基序赋予丝以弹性。
·Cheryl Y.Hayashi et al.， Evidence from Flagelliform Silk cDNA for the Structural Basis of Elasticity and Modular Nature of Spider Silks， 1998， p.779
·Thomas Scheibel ， Spider silks ： recombinant synthesis ， assembly ， spinning， and engineering of synthetic proteins， 2004， p.2
另外， 图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白的 (V) 区域 ( 伪结晶区域 ) 中富含亲水性氨基 酸。 如表 1 所示， 图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白与目前公知的金丝蜘蛛 (Nephila clavipes) 或日本产横带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 的牵引丝蛋白相比， 含有更多的亲水性氨基酸。 由此认为， 由本发明获得的牵引丝蛋白的吸湿性变高。 另外认为， 牵引丝蛋白的结晶化度低
也成为使吸湿性增加的要因。
而且， 在图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白的 (β) 区域 ( 结晶区域 ) 中， 在聚丙氨酸 的间隔间含有苏氨酸、 天冬酰胺等极性氨基酸。认为由本发明获得的牵引丝蛋白通过如此 具有极性氨基酸丰富的聚丙氨酸 (Poly(A)) 基序， 变得具有优异的强韧性。
此外， 以下的文献也记载了极性氨基酸丰富的聚丙氨酸 (Poly(A)) 基序赋予丝以 强韧性。
·Glareh Askarieh et al.， Self-assembly of spider silk proteins is controlled by a pH-sensitive relay， 2010， vol.465， p.1
· J.M.GOSLINE， et al.， THE MECHANICAL DESIGN OF SPIDER SILKS ： FROM FIBROIN SEQUENCE TO MECHANICAL FUNCTION， 1999， p.3299
另外， 如表 1 所示， 图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白相对于以往公知的金丝蜘蛛 (Nephila clavipes) 或日本产横带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 含有约 2 倍的极性氨基 酸。 这样大量存在于分子内的极性氨基酸残基通过相对于来自外部的应力沿着应力的方向 规则地排列分子、 增大分子间的作用力， 从而使牵引丝具有优异的强度。 特别是认为分子间 的氢键有助于丝纤维的强度增加。 表 1 示出人面蜘蛛 (Nephila pilipes)、 金丝蜘蛛 (Nephila clavipes)、 日本产横 带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 的 MaSp 蛋白质中的极性氨基酸及亲水性氨基酸的含有率 (％ )。此外， 极性氨基酸的含有率表示 N(Asn)、 C(Cys)、 Q(Gln)、 S(Ser)、 T(Thr) 及 Y(Tyr) 的含有率， 亲水性氨基酸的含有率表示 R(Arg)、 N(Asn)、 D(Asp)、 Q(Gln)、 E(Glu)、 H(His)、 K(Lys)、 S(Ser) 及 T(Thr) 的含有率。
表1
极性氨基酸 (％ ) 人面蜘蛛 金丝蜘蛛 日本产横带人面蜘蛛
31.05 15.71 15.15 亲水性氨基酸 (％ ) 29.41 14.85 11.01实施例
以下举出实施例更加具体地说明本发明。但本发明并不限定于以下的实施例。
作为受试动物， 使用 7 月采集的人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的雌成虫。
(RNA 抽提 )
总 RNA 由人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的大壶状腺体准备。在生理盐水 (NaCl 0.75％ ) 中解剖蜘蛛的大壶状腺体， 添加 1ml 的 TRIZOL 并充分粉碎。悬浮液用 200μl 的 氯仿进行分离除去。将水层移至其他的管中， 添加等量的异丙醇， 使 RNA 沉淀。用 75％乙醇 淋洗沉淀物， 在 -80℃下进行保存。之后， 在 7500rpm、 4℃下离心分离 5 分钟， 真空干燥 8 分 钟后， 溶解于无 RNase 水中。在 55℃下将 RNA 溶解 10 分钟后， 作为样品使用。确认了通过 对样品进行琼脂糖电泳， 可以抽提出 RNA。
(cDNA 文库的构建 )利用 G- 封端 (G-Capping) 法来合成和构建大壶状腺体的 cDNA 文库委托给了 Takara-bio 株式会社。文库载体 (pDNR-LIB) 溶解于约 50μl 的 TE 中。
( 克隆和测序 )
为了以高概率进行转化， 使用了电穿孔法。作为 DNA 溶液， 使用准备好的 cDNA 文 TM 库溶液 ； 作为感受态细胞， 使用 Invitrogen 公司制 “Electro MAX DH12STM Cells” (Cat. No.18312-017)， 使用 0.1cm 尺寸的样品池。
首先， 预先在冰上冷却样品池， 在冰上溶解放入在管中的感受态细胞 ( ＞ 1010cfu/ μg)50μl 后， 将 1μl 的 cDNA 文库溶液添加于管中。将该混合液均一地移至样品池中。电 穿孔的条件是 ： 电压为 2.5kV、 脉冲控制器 (R2-7) 为 200Ω、 电容为 25μF。 施加一次脉冲， 尽 快在样品池内添加 1ml 的 SOC 培养基 (2％胰蛋白胨、 0.5％酵母提取物、 10mM NaCl、 2.5mM KCl、 10mM MgCl2、 10mM MgSO4、 20mM 葡萄糖 )， 将溶液悬浮。将悬浮液移至培养管中培养 1 小 时～ 1 个半小时后， 接种于含抗生素 ( 氨苄青霉素 )、 IPTG 及 X-Gal 的 LB 板 (1％胰蛋白胨、 0.5％酵母提取物、 0.5％ NaCl) 中。将在板上形成的白色菌落植菌至 LB(+ 氨苄青霉素 ) 培 养基中， 随机选择 588 个重组质粒， 使用 FlexiPrepTMKit(Amersham 公司制 ) 进行纯化。
( 测序与序列的比较解析 ) 插入的序列使用 “ABI Prism genetic analyzer 3100” (Life technologies Japan 株式会社制 ) 和 T7 引物进行分析。DNA 和氨基酸序列的计算机分析使用 “Genetyx package” ( 株式会社 Genetec 制 ) 和 “Sequencher 4.14” (Demo Version)(Gene Codes 公 司制 ) 进行。 序列的比较通过对蛋白质的数据库利用 ExPASy Proteomics server(http:// www.expasy.org) 的 SIB BLAST Network 进行同源性分析。
( 证明丝腺特异性表达的实验 )
MaSp(major ampullate spidroin) 如名称所示， 是在大壶状腺体进行表达。为了 证明本发明的基因在大壶状腺体内起作用， 进行使用 cDNA 序列的 3’ 末端 ( 氨基酸序列的 C 末端 ) 序列制作的探针与由蜘蛛的四种丝腺 ( 鞭状腺、 管状腺、 大壶状腺体、 小壶状腺体 ) 抽提出的 RNA 的 Northern 杂交实验。图 3 为表示 Northern 杂交的结果的图。图 3 的条带 1 ～ 4 依次流过由鞭状腺、 管状腺、 大壶状腺体、 小壶状腺体抽提出的 RNA。由此结果可知， 本发明的基因 ( 核酸 ) 在人面蜘蛛的大壶状腺体内特异性地表达。另外， 推测转印物质的 分子量约为 3 ～ 4kb。
( 牵引丝的物性评价 )
为了比较人面蜘蛛的牵引丝和目前公知的蜘蛛的牵引丝的物性， 测定各自的伸长 率 ( 弹性模量 )。伸长率的测定如下进行 ： 将在从测定前一天开始在 20℃、 RH65％下放置 24 小时而调整了吸湿量的 20mm 的各牵引丝为样品， 在 20℃、 RH65％下、 在拉伸速度为 20mm/ min 的条件下进行使用了拉伸试验机 “Tensilon UTM-III-100” (Toyo Baldwin 公司制 ) 的 伸长率试验。作为目前公知的蜘蛛， 使用日本产横带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 及横纹 金蛛 (Argiope bruennichi)。将结果示于表 2。
表2
12102399786 A CN 102399785说明书伸长率10/10 页横纹金蛛 日本产横带人面蜘蛛 人面蜘蛛
26.1 22.3 29.4由表 2 所示可知， 人面蜘蛛的牵引丝与目前公知的蜘蛛的牵引丝相比， 具有更为 优异的弹性。即， 本发明的核酸编码具有优异弹性的牵引丝蛋白。
由本发明提供的牵引丝蛋白是弹性等物性优异的天然纤维， 因而优选作为医疗、 航空、 衣料等各种产业领域中的新原材料使用。13102399786 A CN 102399785
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另外， 本发明涉及 (3) 上述 (2) 所述的核酸， 其与具有序列号 1 的碱基序列的核酸 具有 80％以上的序列同一性。
另外， 本发明涉及 (4) 核酸， 其含有下述 (i) ～ (1) 中任一种的核酸， 并且其与具 有序列号 19 的碱基序列的核酸具有 70％以上、 优选 80％以上的序列同一性， 并编码牵引丝 蛋白。
(i) 具有序列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 或 35 的碱基序列的核酸
(j) 编码具有序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(k) 与上述 (i) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸
(l) 在严格的条件下与上述 (i) 的核酸的互补链杂交的核酸
另外， 本发明涉及 (5) 上述 (4) 所述的核酸， 其与具有序列号 19 的碱基序列的核 酸具有 80％以上的序列同一性。
另外， 本发明涉及 (6) 由上述 (1) ～ (5) 中任一种的核酸编码的蛋白质。
根据上述本发明的特定核酸， 可以编码与现有 MaSp 蛋白质不同的具有优异物性 的 MaSp 蛋白质 ( 牵引丝蛋白 )、 从而提供天然纤维的新原材料。 特别是， 由本发明的核酸编 码的牵引丝蛋白 ( 本发明的蛋白质 ) 具有比现有品更为优异的弹性 ( 或弹力、 伸缩性、 伸长 率、 柔软性 )， 适合用于以医疗用品、 衣料品等为代表的各种产业领域中需要弹性的用途中。
而且， 本发明涉及 (7) 导入有上述 (1) ～ (5) 中任一种核酸的重组生物及 (9) 由 上述 (7) 的重组生物制作的蛋白质。根据本发明的重组生物， 可以生产大量的由上述核酸 编码的物性优异的牵引丝蛋白。 由上述重组生物制作的蛋白质通过含有物性优异的牵引丝 蛋白， 适合用于各种产业领域中。
特别是， 本发明涉及 (8) 导入有上述 (1) ～ (5) 中任一种核酸的重组桑蚕及 (10) 由该重组桑蚕制作的蚕丝。根据本发明的重组桑蚕， 可以生产大量的含有由上述核酸编码 的物性优异的牵引丝蛋白的蚕丝。 由上述重组桑蚕制作的蚕丝通过含有物性优异的牵引丝 蛋白， 具有比现有蚕丝更为优异的物性、 特别是更为优异的弹性。
另外， 本发明涉及 (11) 具有下述 (m) 或 (n) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(m) 序列号 2 或 20 的氨基酸序列
(n) 与上述 (m) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
另外， 本发明涉及 (12) 具有下述 (o) 或 (p) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(o) 具有下述 (o1) 或 (o2) 的氨基酸序列且与序列号 2 的氨基酸序列具有 70％以 上、 优选 80％以上的序列同一性的氨基酸序列
(o1) 序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列
(o2) 与上述 (o1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
(p) 具有下述 (p1) 或 (p2) 的氨基酸序列且与序列号 20 的氨基酸序列具有 70％ 以上、 优选 80％以上的序列同一性的氨基酸序列
(p1) 序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列
(p2) 与上述 (p1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
另外， 本发明涉及 (13) 上述 (12) 所述的牵引丝蛋白， 其中， 上述 (o) 的氨基酸序 列与序列号 2 的氨基酸序列具有 80％以上的序列同一性、 上述 (p) 的氨基酸序列与序列号20 的氨基酸序列具有 80％以上的序列同一性。
而且， 本发明涉及 (14) 具有下式 (1) 所示的氨基酸序列或与式 (1) 所示的氨基酸 序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[X1-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7-X8]n (1)
上述式 (1) 中， m 各自独立地表示 0 或 1 的整数、 n 表示 1 ～ 10 的整数、 X1 表示序 列号 37 ～ 45 中的任一种氨基酸序列、 X2 表示序列号 46 ～ 52 中的任一种氨基酸序列、 X3 表示序列号 53 ～ 59 中的任一种氨基酸序列、 X4 表示序列号 49 的氨基酸序列、 X5 表示序列 号 60 或 61 的氨基酸序列、 X6 表示序列号 62 ～ 64 中的任一种氨基酸序列、 X7 表示序列号 65 ～ 70 中的任一种氨基酸序列、 X8 表示序列号 71 ～ 81 中的任一种氨基酸序列。
上述本发明的蛋白质由于其独特的结构而具有比现有牵引丝蛋白更为优异的物 性， 因而适合用于各种产业领域中。
根据本发明的核酸， 可以提供具有优异物性的蛋白质。 另外， 根据本发明的重组生 物， 可以生产大量的具有优异物性的蛋白质。特别是， 根据本发明的重组桑蚕， 可以生产大 量的具有优异物性的蚕丝。 由本发明提供的牵引丝蛋白或蚕丝具有特别优异的弹性。 如此， 根据本发明， 可以提供弹性等物性优异的天然纤维的新原材料。 附图说明
图 1 为表示 NP- 牵引丝蛋白 A 的 cDNA 序列的图。 图 2 为表示 NP- 牵引丝蛋白 A 的氨基酸序列的图。 图 3 为表示 Northen 杂交结果的照片图。 图 4 为表示 NP- 牵引丝蛋白 B 的 cDNA 序列的图。 图 5 为表示 NP- 牵引丝蛋白 B 的氨基酸序列的图。具体实施方式
以下根据需要参照着附图详细地说明用于实施本发明的方式。 但本发明并不限定 于以下的实施方式。
本发明涉及下述 (a) ～ (d) 中任一种的核酸。
(a) 具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸
(b) 编码具有序列号 2 或 20 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(c) 与上述 (a) 的核酸具有 90％以上的序列同一性且编码牵引丝蛋白的核酸
(d) 在严格的条件下与上述 (a) 的核酸的互补链杂交且编码牵引丝蛋白的核酸
首先， 本发明涉及具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸 (a)。序列号 1 或 19 的碱 基序列均是对作为构成络新妇属人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的牵引丝的蛋白质主要成分 的被称作大壶状腺丝蛋白 (Major Ampullate Spidroin ： MaSp) 的蛋白质 ( 多肽 ) 进行编码 的基因。本说明书中， 将由具有序列号 1 的碱基序列的核酸编码的蛋白质称作 “NP- 牵引丝 蛋白 A” 、 将由具有序列号 19 的碱基序列的核酸编码的蛋白质称作 “NP- 牵引丝蛋白 B” 。这 些核酸 (a) 不需要由人面蜘蛛获取， 只要是具有序列号 1 或 19 的碱基序列， 则可以通过人 工合成或由基因组文库或 cDNA 文库获取， 还可以是用 PCR 对它们进行扩增而得到的核酸或 者用限制酶将它们进行切断而得到的核酸。本发明的核酸还可以是编码具有序列号 2 或 20 的氨基酸序列的蛋白质的核酸 (b)。序列号 2 或 20 的氨基酸序列均为人面蜘蛛的 MaSp 蛋白质所具有的氨基酸序列。具 体地说， 序列号 2 的氨基酸序列为上述 NP- 牵引丝蛋白 A 所具有的氨基酸序列、 序列号 20 的氨基酸序列为上述 NP- 牵引丝蛋白 B 所具有的氨基酸序列。
另外， 本发明的核酸只要是编码牵引丝蛋白 (MaSp)， 则还可以是与具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸 (c)。上述序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
而且， 本发明的核酸只要是编码牵引丝蛋白， 则也可以是在严格的条件下与具有 序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸的互补链进行杂交的核酸 (d)。本说明书中， 核酸的 “互 补链” 是指基于核酸的碱基间的氢键而相对应的核酸序列 ( 例如 T 与 A 相对应、 C 与 G 相对 应 )。另外， “杂交” 是指在上述互补链之间发生的互补键合或者单链核酸分子间的碱基对 相互作用的形成。
本说明书中， “严格的条件 “是指相对于目标序列具有同源性的核苷酸链的互补链 优先地与目标序列杂交、 而不具有同源性的核苷酸链的互补链实质上不发生杂交的条件。 严格的条件是序列依赖性的， 在各种状况下有所不同。越长的序列在越高的温度下特异性 地发生杂交。一般来说， 严格的条件选择比规定的离子强度和 pH 下的特定序列的热熔融 温度 (Tm) 约低 5℃。Tm 是在规定的离子强度、 pH 和核酸浓度下与目标序列互补的核苷酸 的 50％以平衡状态与目标序列发生杂交的温度。 “严格的条件” 是序列依赖性的， 随各种环 境参数的不同而不同。核酸杂交的一般性方针可在 Tijssen(Tijssen(1993)、 Laboratory Technniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第 2 章 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay” 、 Elsevier， New York) 中找到。
代表性地来说， 严格的条件为盐浓度约小于 1.0M Na+、 代表性地是 pH7.0 ～ 8.3 下 + 约 0.01 ～ 1.0M 的 Na 浓度 ( 或其他的盐 )， 温度对于短核苷酸 ( 例如 10 ～ 50 个核苷酸 ) 而言至少约 30℃、 对于长核苷酸 ( 例如长于 50 个核苷酸 ) 而言至少约 60℃。 严格的条件还 可以通过添加甲酰胺等不稳定化剂来达成。作为本说明书中的严格的条件， 可举出在 50％ 的甲酰胺、 1M 的 NaCl、 1％的 SDS(37℃ ) 的缓冲溶液中的杂交、 和用 0.1×SSC 在 60℃下的 洗涤。
另外， 本发明的核酸只要是含有下述 (e) ～ (h) 中的任一种核酸且编码牵引丝蛋 白， 则也可以是与具有序列号 1 的碱基序列的核酸具有 70％以上的序列同一性的核酸。上 述序列同一性只要为 70％以上即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以上。
(e) 具有序列号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 或 17 的碱基序列的核酸
(f) 编码具有序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(g) 与上述 (e) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸
(h) 在严格的条件下与上述 (e) 的核酸的互补链杂交的核酸
上述序列号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 及 17 的碱基序列为在序列号 1 的碱基序列中在编 码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白的方面上具有重要特征的序列。 通过含有具有这种 特征序列的核酸， 即便是与具有序列号 1 的碱基序列的核酸仅有 70％以上的序列同一性的核酸， 也可与具有序列号 1 的碱基序列的核酸同样地编码本发明的具有优异物性的牵引丝 蛋白。
具有序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列的蛋白质分别为由上述序列 号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15 或 17 的碱基序列编码的蛋白质。
上述核酸 (g) 中， 与核酸 (e) 的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以 上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
另外， 本发明的核酸只要是含有下述 (i) ～ (l) 中任一种的核酸且编码牵引丝蛋 白， 则也可以是与具有序列号 19 的碱基序列的核酸具有 70％以上的序列同一性的核酸。 上 述序列同一性只要为 70％以上即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以上。
(i) 具有序列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 或 35 的碱基序列的核酸
(j) 编码具有序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列的蛋白质的核酸
(k) 与上述 (i) 的核酸具有 90％以上的序列同一性的核酸
(l) 在严格的条件下与上述 (i) 的核酸的互补链杂交的核酸
上述序列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 及 35 的碱基序列是在序列号 19 的碱基序列 中在编码本发明的具有优异物性的牵引丝蛋白的方面上具有重要特征的序列。 通过含有具 有这种特征序列的核酸， 即便是与具有序列号 19 的碱基序列的核酸仅具有 70％以上的序 列同一性的核酸， 也可与具有序列号 19 的碱基序列的核酸同样地编码本发明的具有优异 物性的牵引丝蛋白。 具有序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列的蛋白质分别为由上述序 列号 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33 或 35 的碱基序列编码的蛋白质。
上述核酸 (k) 中， 与核酸 (i) 的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以 上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
另外， 本发明涉及导入有上述本发明的核酸的重组生物及由该重组生物制作的蛋 白质。特别是本发明涉及导入有上述本发明的核酸的重组桑蚕及由该重组桑蚕制作的蚕 丝。
本说明书中， “重组生物” 是指利用基因重组将外来基因导入至染色体中进行了转 化的生物。 作为被转化的生物， 并无特别限定， 可以使用昆虫、 动物、 植物、 微生物等， 优选使 用昆虫。作为优选的昆虫， 可以举出桑蚕 (Bombyx mori)、 野桑蚕 (Bombyx mandarina)、 天 蚕 (Antheraea yamamai)、 柞蚕 (Antheraea pernyi) 等。 其中优选使用属于蚕蛾科的桑蚕、 野桑蚕等， 特别优选使用桑蚕。
本说明书中， “桑蚕” 是指蚕蛾属桑蚕 (Bombyx mori)。桑蚕可以是实验用的品种 也可以是经实用商品化的实用品种。另外， “重组桑蚕” 是指利用基因重组将外来基因导入 至桑蚕染色体中进行了转化的桑蚕。基因重组例如通过使用转座子的方法来进行， 但只要 是能够将外来基因导入至桑蚕中的方法则没有限定， 还可以通过电穿孔法等其他的方法来 进行基因重组。
本说明书中， “蚕丝” 是指由桑蚕 (Bombyx mori) 吐出的纤维， 其构成茧， 以丝蛋白 为主成分。丝蛋白由大小 2 个亚单元 (H 链及 L 链 ) 构成。
本说明书中， “人面蜘蛛” 是指络新妇属人面蜘蛛 (Nephila pilipes)， 对人面蜘蛛
的产地并无特别限定。
另外， 本发明涉及具有下述 (m) 或 (n) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(m) 序列号 2 或 20 的氨基酸序列
(n) 与上述 (m) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
上述氨基酸序列 (n) 中， 与上述 (m) 的氨基酸序列的序列同一性只要为 90％以上 即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
另外， 本发明涉及具有下述 (o) 或 (p) 的氨基酸序列的牵引丝蛋白。
(o) 具有下述 (o1) 或 (o2) 的氨基酸序列且与序列号 2 的氨基酸序列具有 70％以 上的序列同一性的氨基酸序列
(o1) 序列号 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16 或 18 的氨基酸序列
(o2) 与上述 (o1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
(p) 具有下述 (p1) 或 (p2) 的氨基酸序列且与序列号 20 的氨基酸序列具有 70％ 以上的序列同一性的氨基酸序列
(p1) 序列号 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34 或 36 的氨基酸序列
(p2) 与上述 (p1) 的氨基酸序列具有 90％以上的序列同一性的氨基酸序列
上述氨基酸序列 (o) 中， 与序列号 2 的氨基酸序列的序列同一性只要为 70％以上 即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以 上。
同样地， 上述氨基酸序列 (p) 中， 与序列号 20 的氨基酸序列的序列同一性只要为 70％以上即可， 优选为 75％以上、 更优选为 80％以上、 进一步优选为 85％以上、 特别优选为 88％以上。
另外， 上述氨基酸序列 (o2) 中， 与上述 (o1) 的氨基酸序列的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
同样地， 上述氨基酸序列 (p2) 中， 与上述 (p1) 的氨基酸序列的序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为 93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
进而， 本发明涉及具有以下式 (1) 所示的氨基酸序列的蛋白质。
[X1-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7-X8]n (1)
上述式 (1) 所示的氨基酸序列具有 n 个由 [X1-X2-X3-(X4)m-(X5)m-(X6)m-X7-X8] 所示的重复单元。对重复单元的数量 (n) 并无特别限定， 优选为 1 ～ 10、 更优选为 2 ～ 9、 进一步优选为 3 ～ 8、 特别优选 n ＝ 8。
式 (1) 中， m 各自独立地表示 0 或 1 的整数。即， 每个重复单元中， 既有具有 X4、 X5 或 X6 所示的氨基酸序列的情况， 也有不具有 X4、 X5 或 X6 所示的氨基酸序列的情况。
式 (1) 中， X1 表示序列号 37 ～ 45 中的任一种氨基酸序列、 X2 表示序列号 46 ～ 52 中的任一种氨基酸序列、 X3 表示序列号 53 ～ 59 中的任一种氨基酸序列、 X4 表示序列号 49 的氨基酸序列、 X5 表示序列号 60 或 61 的氨基酸序列、 X6 表示序列号 62 ～ 64 中的任一 种氨基酸序列、 X7 表示序列号 65 ～ 70 中的任一种氨基酸序列、 X8 表示序列号 71 ～ 81 中 的任一种氨基酸序列。
另外， 本发明的蛋白质还可以是具有与上述式 (1) 所示的氨基酸序列具有 90％以 上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。上述序列同一性只要为 90％以上即可， 优选为93％以上、 更优选为 95％以上、 进一步优选为 98％以上。
图 1 是表示作为人面蜘蛛的 MaSp 蛋白质中的 1 种的 NP- 牵引丝蛋白 A 的 cDNA 序 列的图。图 1 所示的基因序列与序列号 1 的碱基序列相同。
图 2 是表示由具有图 1 所示基因序列 ( 序列号 1 的碱基序列 ) 的核酸编码的 NP- 牵 引丝蛋白 A 的氨基酸序列的图。图 2 所示的氨基酸序列与序列号的碱基序列相同。
另外， 图 4 是表示作为人面蜘蛛的 MaSp 蛋白质中的另 1 种的 NP- 牵引丝蛋白 B 的 cDNA 序列的图。图 4 所示的基因序列与序列号 19 的碱基序列相同。
图 5 是表示由具有图 4 所示基因序列 ( 序列号 19 的碱基序列 ) 的核酸编码的 NP- 牵引丝蛋白 B 的氨基酸序列的图。图 5 所示的氨基酸序列与序列号 20 的碱基序列相 同。
如图 2 或图 5 所示， 由具有序列号 1 或 19 的碱基序列的核酸编码的牵引丝蛋白是 由下述式 (2) 所示的氨基酸序列构成的。
[(α)(V)(β)]q (2)
上述式 (2) 所示的氨基酸序列具有 q 个 [(α)(V)(β)] 所示的重复单元。对重复 单元的数量 (q) 并无特别限定， 只要为 1 ～ 100 即可， 优选为 1 ～ 10、 更优选为 2 ～ 9、 进一 步优选为 3 ～ 8、 特别优选 q ＝ 8。 上述式 (2) 中， (α) 是由连续具有 2 ～ 4 个 GGX 的富含甘氨酸的序列构成， 表示 形成非结晶性 α- 螺旋结构的无定形区域。(V) 表示 GX 含有率高的伪结晶区域、 (β) 表示 富含丙氨酸或苏氨酸的形成 β 折叠的结晶区域。
上述 (α) 及 (V) 所含的 X 多为谷氨酰胺、 丙氨酸、 丝氨酸、 亮氨酸、 脯氨酸、 酪氨酸 等， 但并不限定于这些， 还可以是其他的氨基酸。另外， X 并不必须是相同的氨基酸。
以下， 对图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白所具有的独特的分子结构以及由此获得的 牵引丝蛋白的物性进行说明。
首先， 在图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白的 (α) 区域 ( 非结晶性无定形区域 ) 中， 4 个 GGX 连续地排列。通过这种排列， 牵引丝形成 α- 螺旋结构。α- 螺旋结构通常在纤维 中以弯曲的状态存在， 通过拉伸而沿着纤维轴变成直链状结构。 这样， 相对于来自外部的应 力， α- 螺旋结构大幅度伸展， 从而赋予纤维以弹性。另一方面， 以往公知的蜘蛛牵引丝蛋 白 (MaSp) 中未见 4 个 GGX 连续排列的结构 ( 参照非专利文献 1、 2 等 )。由以上可知， 通过 在 (α) 区域中形成 4 个 GGX 连续排列的独立结构， 由本发明获得的牵引丝蛋白的弹性 ( 或 弹力、 伸缩性、 伸长率、 柔软性 ) 变得优异。
此外， 以下文献也记载了 GGX 重复基序赋予丝以弹性。
·Cheryl Y.Hayashi et al.， Evidence from Flagelliform Silk cDNA for the Structural Basis of Elasticity and Modular Nature of Spider Silks， 1998， p.779
·Thomas Scheibel ， Spider silks ： recombinant synthesis ， assembly ， spinning， and engineering of synthetic proteins， 2004， p.2
另外， 图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白的 (V) 区域 ( 伪结晶区域 ) 中富含亲水性氨基 酸。 如表 1 所示， 图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白与目前公知的金丝蜘蛛 (Nephila clavipes) 或日本产横带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 的牵引丝蛋白相比， 含有更多的亲水性氨基酸。 由此认为， 由本发明获得的牵引丝蛋白的吸湿性变高。 另外认为， 牵引丝蛋白的结晶化度低
也成为使吸湿性增加的要因。
而且， 在图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白的 (β) 区域 ( 结晶区域 ) 中， 在聚丙氨酸 的间隔间含有苏氨酸、 天冬酰胺等极性氨基酸。认为由本发明获得的牵引丝蛋白通过如此 具有极性氨基酸丰富的聚丙氨酸 (Poly(A)) 基序， 变得具有优异的强韧性。
此外， 以下的文献也记载了极性氨基酸丰富的聚丙氨酸 (Poly(A)) 基序赋予丝以 强韧性。
·Glareh Askarieh et al.， Self-assembly of spider silk proteins is controlled by a pH-sensitive relay， 2010， vol.465， p.1
· J.M.GOSLINE， et al.， THE MECHANICAL DESIGN OF SPIDER SILKS ： FROM FIBROIN SEQUENCE TO MECHANICAL FUNCTION， 1999， p.3299
另外， 如表 1 所示， 图 2 或图 5 所示的牵引丝蛋白相对于以往公知的金丝蜘蛛 (Nephila clavipes) 或日本产横带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 含有约 2 倍的极性氨基 酸。 这样大量存在于分子内的极性氨基酸残基通过相对于来自外部的应力沿着应力的方向 规则地排列分子、 增大分子间的作用力， 从而使牵引丝具有优异的强度。 特别是认为分子间 的氢键有助于丝纤维的强度增加。 表 1 示出人面蜘蛛 (Nephila pilipes)、 金丝蜘蛛 (Nephila clavipes)、 日本产横 带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 的 MaSp 蛋白质中的极性氨基酸及亲水性氨基酸的含有率 (％ )。此外， 极性氨基酸的含有率表示 N(Asn)、 C(Cys)、 Q(Gln)、 S(Ser)、 T(Thr) 及 Y(Tyr) 的含有率， 亲水性氨基酸的含有率表示 R(Arg)、 N(Asn)、 D(Asp)、 Q(Gln)、 E(Glu)、 H(His)、 K(Lys)、 S(Ser) 及 T(Thr) 的含有率。
表1
极性氨基酸 (％ ) 人面蜘蛛 金丝蜘蛛 日本产横带人面蜘蛛
31.05 15.71 15.15 亲水性氨基酸 (％ ) 29.41 14.85 11.01实施例
以下举出实施例更加具体地说明本发明。但本发明并不限定于以下的实施例。
作为受试动物， 使用 7 月采集的人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的雌成虫。
(RNA 抽提 )
总 RNA 由人面蜘蛛 (Nephila pilipes) 的大壶状腺体准备。在生理盐水 (NaCl 0.75％ ) 中解剖蜘蛛的大壶状腺体， 添加 1ml 的 TRIZOL 并充分粉碎。悬浮液用 200μl 的 氯仿进行分离除去。将水层移至其他的管中， 添加等量的异丙醇， 使 RNA 沉淀。用 75％乙醇 淋洗沉淀物， 在 -80℃下进行保存。之后， 在 7500rpm、 4℃下离心分离 5 分钟， 真空干燥 8 分 钟后， 溶解于无 RNase 水中。在 55℃下将 RNA 溶解 10 分钟后， 作为样品使用。确认了通过 对样品进行琼脂糖电泳， 可以抽提出 RNA。
(cDNA 文库的构建 )利用 G- 封端 (G-Capping) 法来合成和构建大壶状腺体的 cDNA 文库委托给了 Takara-bio 株式会社。文库载体 (pDNR-LIB) 溶解于约 50μl 的 TE 中。
( 克隆和测序 )
为了以高概率进行转化， 使用了电穿孔法。作为 DNA 溶液， 使用准备好的 cDNA 文 TM 库溶液 ； 作为感受态细胞， 使用 Invitrogen 公司制 “Electro MAX DH12STM Cells” (Cat. No.18312-017)， 使用 0.1cm 尺寸的样品池。
首先， 预先在冰上冷却样品池， 在冰上溶解放入在管中的感受态细胞 ( ＞ 1010cfu/ μg)50μl 后， 将 1μl 的 cDNA 文库溶液添加于管中。将该混合液均一地移至样品池中。电 穿孔的条件是 ： 电压为 2.5kV、 脉冲控制器 (R2-7) 为 200Ω、 电容为 25μF。 施加一次脉冲， 尽 快在样品池内添加 1ml 的 SOC 培养基 (2％胰蛋白胨、 0.5％酵母提取物、 10mM NaCl、 2.5mM KCl、 10mM MgCl2、 10mM MgSO4、 20mM 葡萄糖 )， 将溶液悬浮。将悬浮液移至培养管中培养 1 小 时～ 1 个半小时后， 接种于含抗生素 ( 氨苄青霉素 )、 IPTG 及 X-Gal 的 LB 板 (1％胰蛋白胨、 0.5％酵母提取物、 0.5％ NaCl) 中。将在板上形成的白色菌落植菌至 LB(+ 氨苄青霉素 ) 培 养基中， 随机选择 588 个重组质粒， 使用 FlexiPrepTMKit(Amersham 公司制 ) 进行纯化。
( 测序与序列的比较解析 ) 插入的序列使用 “ABI Prism genetic analyzer 3100” (Life technologies Japan 株式会社制 ) 和 T7 引物进行分析。DNA 和氨基酸序列的计算机分析使用 “Genetyx package” ( 株式会社 Genetec 制 ) 和 “Sequencher 4.14” (Demo Version)(Gene Codes 公 司制 ) 进行。 序列的比较通过对蛋白质的数据库利用 ExPASy Proteomics server(http:// www.expasy.org) 的 SIB BLAST Network 进行同源性分析。
( 证明丝腺特异性表达的实验 )
MaSp(major ampullate spidroin) 如名称所示， 是在大壶状腺体进行表达。为了 证明本发明的基因在大壶状腺体内起作用， 进行使用 cDNA 序列的 3’ 末端 ( 氨基酸序列的 C 末端 ) 序列制作的探针与由蜘蛛的四种丝腺 ( 鞭状腺、 管状腺、 大壶状腺体、 小壶状腺体 ) 抽提出的 RNA 的 Northern 杂交实验。图 3 为表示 Northern 杂交的结果的图。图 3 的条带 1 ～ 4 依次流过由鞭状腺、 管状腺、 大壶状腺体、 小壶状腺体抽提出的 RNA。由此结果可知， 本发明的基因 ( 核酸 ) 在人面蜘蛛的大壶状腺体内特异性地表达。另外， 推测转印物质的 分子量约为 3 ～ 4kb。
( 牵引丝的物性评价 )
为了比较人面蜘蛛的牵引丝和目前公知的蜘蛛的牵引丝的物性， 测定各自的伸长 率 ( 弹性模量 )。伸长率的测定如下进行 ： 将在从测定前一天开始在 20℃、 RH65％下放置 24 小时而调整了吸湿量的 20mm 的各牵引丝为样品， 在 20℃、 RH65％下、 在拉伸速度为 20mm/ min 的条件下进行使用了拉伸试验机 “Tensilon UTM-III-100” (Toyo Baldwin 公司制 ) 的 伸长率试验。作为目前公知的蜘蛛， 使用日本产横带人面蜘蛛 (Nephila clavata) 及横纹 金蛛 (Argiope bruennichi)。将结果示于表 2。
表2
12102399786 A CN 102399785说明书伸长率10/10 页横纹金蛛 日本产横带人面蜘蛛 人面蜘蛛
26.1 22.3 29.4由表 2 所示可知， 人面蜘蛛的牵引丝与目前公知的蜘蛛的牵引丝相比， 具有更为 优异的弹性。即， 本发明的核酸编码具有优异弹性的牵引丝蛋白。
由本发明提供的牵引丝蛋白是弹性等物性优异的天然纤维， 因而优选作为医疗、 航空、 衣料等各种产业领域中的新原材料使用。13102399786 A CN 102399785
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