一株高效降解邻苯二甲酸二丁酯的普罗威登斯菌PROVIDENCIASP．2D.pdf

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体公开了一株高效且能完全降解邻苯二甲酸二丁酯的普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D，所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057。该菌株在72h对高浓度的DBP（1000mg/L）降解效率超过80%，对低浓度的DBP（200mg/L）几乎完全降解；该菌株还能够降解DBP的中间产物邻苯二甲酸，最终将DBP完全矿化，所述菌株具有高效的DBP降解能力，极大地补充了DBP降解菌的资料库，该菌还具有生长速度快、培养方法简单、适应能力强、不易变异的特点，具有良好的应用前景。

1.  一株普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D，其特征在于，所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057。

2.   根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

3.   根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株为革兰氏阴性菌；在LB培养基上菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄。

4.   根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株能将邻苯二甲酸二丁酯完全矿化。

一株高效降解邻苯二甲酸二丁酯的普罗威登斯菌(Providencia sp.)2D
技术领域
本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，更具体地，涉及一株高效且能完全降解邻苯二甲酸二丁酯的普罗威登斯菌(Providencia sp. )2D。
背景技术
邻苯二甲酸二丁酯（di-n-butylphthalate，DBP）属于邻苯二甲酸酯类化合物（Phthalic acidester，PAEs），是塑料工业最主要的增塑剂之一，也是农药、染料去污剂的载体以及诸多化妆品、纺织品的生产原料，广泛用于食品包装材料、容器、医疗器械以及儿童玩具等领域。由于上述制品的大量应用，DBP已经成为全球性的有机污染物，广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。特别是在农业生产中，由于塑料薄膜和塑料大棚的广泛应用，残留在农业土壤中DBP极易通过食物链在人体中富集。DBP 及其代谢物能够对机体造成生殖毒性、发育毒性、神经毒性、多器官癌变等多种损伤，因此美国环保署（EPA）和中国国家环境监测中心（CNEMC）都已将它列为优先控制污染物。
研究表明，DBP的水解和光解速率都非常缓慢，生物降解是其在环境中分解的主要途径。因此，获得DBP高效降解菌是提高其生物降解效率的重要环节。利用微生物降解作用，将DBP转化为无害物质或完全矿化，是公认的去除环境中DBP污染的最佳手段。由于环境中DBP的普遍存在，DBP降解菌的出现频率也很高，目前对DBP有降解作用的微生物大多数为戈登氏菌属、农杆菌属、不动杆菌属和赤红球菌属等，但已报道的这些细菌对于DBP的生物降解不完全，会产生毒性更高的中间代谢产物，或者其降解速率还不能满足实际污染控制的要求，因此仍需筛选更加高效的专性或兼性降解菌。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一株高效且能完全降解邻苯二甲酸二丁酯的菌株。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一株普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D，所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057；保藏地址为：中国武汉武汉大学。
所述菌株Providencia sp. 2D通过富集培养法从农场动物粪堆肥样品中富集获得，该菌的最适生长条件为：温度30～40℃，pH为7.0～8.5。
所述菌株Providencia sp. 2D在牛肉膏蛋白胨培养基（LB，酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，pH= 7.0）上划线培养7天，菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄；扫描电子显微镜下该菌株呈长杆状，长约1.5～3.0 μm，宽约0.5～0.8μm。经革兰氏染色鉴定该菌为革兰氏阴性菌。
所述菌株Providencia sp. 2D的生理生化鉴定实验结果如下：甲基红试验（阳性）、V-P试验（阴性）、吲哚反应（阳性）、柠檬酸盐利用（阳性）、肌醇产酸试验（阳性）、葡萄糖产酸试验（阳性）、淀粉水解试验（阴性）、尿酶试验（阳性）、明胶液化试验（阴性）、硝酸盐还原（阳性）、氧化酶试验（阴性）和葡萄糖产气试验（阴性）。
所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示，通过NCBI官方网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST程序与其他已登录细菌菌株的16S rDNA序列进行比对，结果表明该菌株与Providencia sp.相似性最高，同源率达99%。
所述菌株Providencia sp. 2D能够利用DBP作为唯一碳源和能源生长繁殖，并将DBP完全矿化。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株普罗威登斯菌Providencia sp. 2D，该菌株活力高，在72 h对高浓度的DBP（1000 mg/L）降解效率超过80%，对低浓度的DBP（200 mg/L）几乎完全降解；该菌株还能够降解DBP的中间产物邻苯二甲酸，所述菌株具有高效的DBP降解能力，同时具有生长速度快、培养方法简单、适应能力强、不易变异的特点，极大地补充了DBP降解菌的资料库，具有良好的应用前景。                                                             
附图说明
图1为Providencia sp. 2D在LB培养基上培养7天的生长形态。
图2为Providencia sp. 2D的扫描电镜图。
图3为Providencia sp. 2D的16S rDNA的系统发育树。
图4为Providencia sp. 2D对DBP和邻苯二甲酸的降解动力学曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离与鉴定
1、培养基配方
无机盐培养液（MSM，g/L）：K₂HPO₄：5.8；KH₂PO₄：4.5；(NH₄)₂SO₄：2.0；MgCl₂：0.16；CaCl₂：0.02；Na₂MoO₄·2H₂O：0.0024；FeCl₃：0.0018；MnCl₂·2H₂O：0.0015；调节无机盐培养液的最终pH为7.5，添加DBP，使其在无机盐培养液中的浓度为50 mg/L，DBP作为唯一碳源。
牛肉膏蛋白胨培养基（LB）：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，加超纯水至1L，调节pH= 7.0。121℃灭菌20分钟。固体平板则添加1.5%（W/V）琼脂粉。
2、分离与鉴定
分离方法采用样品悬液摇瓶法：称取5 g堆肥样品（取自农场动物堆肥）于含有50 mL无菌水的150 mL三角瓶中，在30℃，140 rpm条件下培养3天后取5 mL堆肥悬液加入100 mL 含DBP（50 mg/L）的上述MSM培养基中。经30℃，140 rpm培养7天后，每次按取1 mL的接种量连续富集、转接10次，并相应提高MSM培养基中DBP含量至1000 mg/L（第二次转接，MSM培养基中DBP的含量为100mg/L，之后每转接一次，MSM培养基中DBP的含量相应提高100mg/L）。然后将转接10次的培养液稀释10³～10⁵涂布于LB固体平板上，30℃倒置培养1～3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编号为2D。然后将菌株接种于LB固体平板上30℃倒置培养7天，观察其菌落形态。LB平板培养7天的菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄（见图1）。
扫描电镜样品制备与观察：将菌种2D的单菌落接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化。吸取800 μL菌液经8000 rpm离心3～5 min，去上清液，加入500 μL PBS 洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入1 mL 2.5%（v/v）戊二醛充分混匀，4℃静置过夜。然后再次经8000 rpm离心3～5 min，去上清液，加入500 μL PBS 洗菌3次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度约浸泡15 min，然后8000 rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脱水。菌体经过CO₂干燥后制片观察。扫描电镜下可以观察到该菌呈长杆状，长约1.5～3.0 μm，宽约0.5～0.8 μm（见图2）。
菌株的生理生化鉴定指标包括12项：甲基红试验、V-P试验、吲哚反应、柠檬酸盐利用、肌醇产酸试验、葡萄糖产酸试验、淀粉水解试验、尿酶试验、明胶液化试验、硝酸盐还原、氧化酶试验和葡萄糖产气试验。具体实验结果见表1。

菌株的16S rDNA鉴定：提取细菌总DNA，用细菌16S rDNA通用引物对该菌基因组进行PCR扩增。PCR产物经测序（由上海生工完成）后，将测序结果与GenBank中已报道的16S rDNA序列进行同源性比对，并选取若干菌种做进化树分析。如图3所示，本发明分离纯化得到的菌株2D的16S rDNA序列与普罗威登斯菌（Providencia stuartii，菌种保藏号为NBRC 12930）同源率达99%，进化距离最近。与该菌属其他菌种也有较高同源性。因此，本发明筛选获得的菌株鉴定为普罗威登斯菌属，命名为Providenciasp. 2D。
实施例2Providenciasp. 2D对DBP及其中间产物邻苯二甲酸的降解实验
1、菌悬液制备
将纯化后的菌种Providenciasp. 2D接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，经5000 rpm离心10 min收集菌体，用PBS洗菌3次后重悬，调节OD_600 nm = 0.8作为菌种悬液。
2、降解能力测定
分别向100mL含有不同浓度DBP（50、100、200、500、1000 mg/L）和邻苯二甲酸（25、50、100、200、500 mg/L）的MSM培养液中接菌1 mL，以不接菌作为对照，并调节pH为8.0，每组三个重复。在30℃，140 rpm恒温摇床培养6天，定期取样，经GC/MS测定DBP及邻苯二甲酸的降解情况。
色谱条件：采用岛津公司QP2010 Plus型GC/MS串联质谱仪。色谱柱为安捷伦HP-5 柱子(0.25 μm × 0.25 mm × 30 m)，进样温度为250℃，离子源（EI）温度为220℃，采用不分流进样 1 μL，载气为高纯氦气。升温程序为：初始温度为100℃，保持2 min，15℃/min梯度上升至129℃，然后以40℃/min升温至280℃，保持5min。
质量控制：采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。6种PAEs混标的基质加标平均回收率为92.5～110.2%，相对偏差低于10.5%，仪器检测限为0.12～0.45 ug/g。该方法满足痕量有机物定量分析要求。
结果如图4所示： Providenciasp. 2D菌在72 h对高浓度的DBP（1000 mg/L）降解效率超过80%，在DBP浓度低于200 mg/L时，72 h内DBP几乎完全降解，表明该菌对DBP具有高效的降解能力。对DBP中间产物的降解能力分析，可以看出该菌的对高浓度邻苯二甲酸的降解能力显著低于DBP，但对低浓度邻苯二甲酸（≤100 mg/L）降解能力较强，在144 h几乎完全降解之；邻苯二甲酸浓度为200 mg/L时，在144 h的降解率超过90%。说明该菌对DBP的主要代谢产物邻苯二甲酸也有较强的降解能力，最终将DBP完全矿化。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  暨南大学
 
<120>  一株高效降解邻苯二甲酸二丁酯的普罗威登斯菌(Providencia sp．)2D
 
<130> 
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  1445
<212>  DNA
<213>  16S rDNA序列
 
<400>  1
gagcatggcg gcagctacac atgcaagtcg agcggtaaca ggagaagctt gcttctcgct     60
 
gacgagcggc ggacgggtga gtaatgtatg gggatctgcc cgatagaggg ggataactac    120
 
tggaaacggt agctaatacc gcataatctc taaggagcaa agcaggggaa cttcggtcct    180
 
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atccagagaa cttagcagag atgctttggt gccttcggga actctgagac aggtgctgca   1020
 
tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaawtgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct   1080
 
tatcctttgt tgccagcgat tcggtcsgga actcaaagga gactgccggk gatamaccgg   1140
 
aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct   1200
 
acaatggcgt atacaaagag aagcgacctc gcgagagcaa gcggaactca taaagtacgt   1260
 
cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgta   1320
 
gatcagaatg ctacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg   1380
 
ggagtgggtt gcaaaagaag taggtagctt aaccttcggg agggcgctac cactttgatc   1440
 
gtgtt                                                               1445