说明书新型植物表达构建物
本申请是申请日为2000年12月12日，申请号为 200810212531.1，发明名称为“新型植物表达构建物”的发明专利申 请的分案申请。
发明领域
本发明涉及分离和应用核酸分子以控制植物中的基因表达，所述 核酸分子具体是新型植物启动子。
发明背景
植物遗传工程的一个目标是产生具有重要农学特征或性状的植 物。遗传工程的最近发展已经提供了产生包含和表达外源基因的转基 因植物的必要工具(Kahl等，World J.of Microbiol.Biotech.11：449-460， 1995)。对于植物遗传工程尤其需要的目的性状或品质包括但不限于： 昆虫抗性、真菌病抗性、对其它害虫和病原体的抗性、除草剂耐性、 更高的稳定性或更长的保存期、更高产量、环境耐性以及营养强化 (nutritional enhancement)。植物转化和再生领域内的技术进步已经使 得研究者能够从异源来源或天然来源提取外源DNA(如一个基因或 多个基因)，然后将所述外源DNA掺入植物基因组。在一种方法中， 通常不在特定植物或特定植物组织中表达的新型基因的表达可能赋 予所需的表型效应。在另一种方法中，以反义取向的基因或基因部分 的转录可能通过防止或抑制内源基因的表达而产生所需效应。
为产生转基因植物，将包括异源基因序列的构建物引入植物细 胞，所述异源基因序列当在植物中表达时赋予所需表型。所述构建物 还包括有效连接所述异源基因序列的植物启动子，该植物启动子通常 在一般情况下不与所述异源基因连接。将所述构建物引入植物细胞， 产生转化植物细胞，然后将所述转化植物细胞再生为转基因植物。所 述启动子控制该启动子有效连接的所引入DNA序列的表达，并因此 影响所述DNA序列所赋予的所需特性。
利用多种启动子定制基因表达可能是有利的，以便一个基因或多 个基因在植物生长和发育的恰当时间、在所述植物中的最佳位点并且 以产生所需效应所必需的量有效转录。例如，基因产物的组成型表达 在植物的一个位点可能是有利的，但在该植物的另一部分就不是那么 有利。在其它情况下，在植物某个发育阶段或在应答某些环境或化学 刺激时产生基因产物可能是有利的。遗传改良种质的商业化发展也已 经前进到将多种性状引入作物的阶段，该方法常常被称为基因堆积方 法(gene stacking approach)。在该方法中，可以将赋予不同目的性状的 多种基因引入植物。当将多种基因引入植物时，重要的是调整或控制 每个基因以获得最佳表达，并且使得调节元件多样化，以降低基因沉 默的可能性。根据这些和其它的考虑，在植物生物工程技术中基因表 达的最佳控制和调节元件多样化显然是重要的。
发明概述
本发明涉及包含以下元件的DNA植物表达构建物：拟南芥属肌 动蛋白(Act)启动子序列Act1a、Act1b、Act2、Act3、Act7、Act8、Act11、 Act12和延伸因子1α(EF1α)启动子序列、以及由有效连接于在作物细 胞中起作用的异源结构基因序列的这些启动子获得的片段和顺式元 件。
因此，根据本发明的一个实施方案，提供以有效连接包含下列元 件的重组DNA构建物：在作物细胞中起作用的启动子，所述启动子包 括：来自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、 SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的至少一种顺式元件；对于所述启动子异源的结构DNA序 列；和在植物中起作用的3’非翻译区，该3’非翻译区引起在RNA序 列的3’末端添加聚腺苷酸化核苷酸。例如，所述启动子可以主要包含 来自下面任何一种的5’调节区：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26(包括或不包括它们中间的任 何内含子序列)。所述结构基因可以包含任何异源核苷酸序列，其中所 述序列的表达导致转基因作物中在农学上有用的性状或产品。
根据本发明的一方面是一种DNA构建物，该DNA构建物包含有 效连接本发明启动子序列的结构DNA序列，所述结构DNA序列编码 赋予作物除草剂耐性的蛋白。该除草剂耐性蛋白包括但不限于草甘膦 耐性蛋白基因如单独的草甘膦抗性EPSP合酶基因，或者该基因与一 种或多种草甘膦降解蛋白基因的组合。
根据本发明的另一实施方案，提供如上文所述的那些DNA构建 物，其中所述启动子是杂种或嵌合启动子，包含有效连接异源启动子 序列的由选自以下的一种或多种序列获得的至少一种顺式元件：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，所述异源启动子序列如花椰菜花叶病毒启动子，例如花椰菜 花叶病毒35S启动子或玄参花叶病毒启动子。
.根据本发明的又一实施方案，提供串联的例如如上文所述的DNA 构建物，其中所述启动子是杂种或嵌合启动子，包含有效连接在转基 因作物细胞中表达的异源基因序列的由选自以下的一种或多种序列获 得的至少一种顺式元件：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26。所述嵌合启动子序列更具体 地是包含在SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30中定义的序列。
根据本发明的再一实施方案，提供例如如上文所述的DNA构建 物，其中所述结构DNA序列是草甘膦耐性基因，使得当将所述DNA 构建物引入植物细胞时，它赋予所述植物细胞对于每升至少包括50克 酸当量(g a.e./l)草甘膦的草甘膦水溶液制剂的耐性。在其它相关实施方 案中，所述DNA构建物赋予所述植物细胞对于草甘膦浓度更高(例如 每升至少300克酸相当草甘膦)的草甘膦制剂的耐性。根据一个实施方 案，所述DNA构建物赋予所述植物细胞对于以下除草剂施用的耐性： 例如以每英亩16盎司(oz)的比率施用Roundup至少一次，而在 其它实施方案中，草甘膦耐性扩展到例如以每亩16oz、每英亩32oz 或每英亩64oz施用一到二次或更多次。
根据本发明的另一实施方案，提供用上文所述DNA构建物转化 的转基因作物，其中包括单子叶植物物种和双子叶植物物种。我们已 经发现：当使用拟南芥属肌动蛋白和拟南芥属EF1α启动子在其它作物 物种例如棉花、番茄和向日葵中控制草甘膦耐性基因(如aroA：CP4)表 达时，所述启动子充分有活性，所述植物耐受草甘膦的商业化施用比 率，展现良好的营养性耐性以及对繁殖组织的损伤低。也可以使用这 样的启动子在植物中表达其它目的基因，所述目的基因包括但不限于 赋予下列性状的基因：除草剂耐性、昆虫防制、抗病性、稳定性增加 或保存期增加、产量提高、营养强化、表达药用多肽产物或其它需要 的多肽产物、或植物生理学或形态学的所需改变等等。
根据本发明的另一实施方案，提供用多种DNA构建物转化的转 基因植物，所述DNA构建物包含拟南芥属肌动蛋白和拟南芥属EF1α 启动子，所述启动子在其它作物物种例如棉花、番茄和向日葵中控制 草甘膦耐性基因(如aroA：CP4)表达时充分有活性，所述植物耐受草甘 膦的商业化施用比率，展现良好的营养性耐性以及对繁殖组织的损伤 低。也可以使用这样的启动子在植物中表达其它目的基因，所述目的 基因包括但不限于赋予下列性状的基因：除草剂耐性、昆虫防制、抗 病性、稳定性增加或保存期增加、产量提高、营养强化、表达药用多 肽产物或其它需要的多肽产物、或植物生理学或形态学的所需改变等 等。
根据本发明的再一实施方案，提供用DNA构建物转化的转基因 作物，所述DNA构建物包含拟南芥属肌动蛋白和拟南芥属EF1α启动 子作为与花椰菜花叶病毒DNA分子融合的嵌合DNA分子，所述嵌合 DNA分子在植物中具有启动子活性，在其它作物物种例如棉花、番茄 和向日葵中充分有活性，例如当用来控制草甘膦耐性基因(如aroA：CP4) 表达时，所述植物耐受草甘膦的商业化施用比率，展现良好的营养体 耐性以及对生殖组织的损伤低。也可以使用这样的启动子在植物中表 达其它目的基因，所述目的基因包括但不限于赋予下列性状的基因： 除草剂耐性、昆虫防制、抗病性、稳定性增加或保存期增加、产量提 高、营养强化、表达药用多肽产物或其它需要的多肽产物、或植物生 理学或形态学的所需改变等等。
根据本发明的又一实施方案，提供在植物中表达结构DNA序列 的方法。这样的方法包括：提供如上文所述的DNA构建物，将所述 DNA构建物引入植物细胞，然后再生所述植物细胞产生植株，以便在 所述植物中可表达所述结构DNA。根据一个相关实施方案，提供防除 杂草的方法，其中所述DNA构建物包含草甘膦耐性基因，对用所述 DNA构建物转化的作物施用一次其用量足以防除杂草而不会显著损 害所述作物的草甘膦。
附图简述
图1是pCGN8086的质粒图谱。
图2是pMON45325的质粒图谱。
图3是pMON45331的质粒图谱。
图4是pMON45332的质粒图谱。
图5是pCGN9190的质粒图谱。
图6是pCGN9153的质粒图谱。
图7是pCGN8099的质粒图谱。
图8是pCGN8088的质粒图谱。
图9是pCGN8068的质粒图谱。
图10是pCGN8096的质粒图谱。
图11是pCGN9151的质粒图谱。
图12是pMON10156的质粒图谱。
图13是pMON52059的质粒图谱。
图14是pMON54952的质粒图谱。
图15是pMON54953的质粒图谱。
图16是pMON54954的质粒图谱。
图17是pMON54955的质粒图谱。
图18是pMON54956的质粒图谱。
序列表简述
SEQ ID NO：1是用于分离Act2启动子的正向PCR引物。
SEQ ID NO：2是用于分离Act2启动子的反向PCR引物。
SEQ ID NO：3是用于分离Act8启动子的正向PCR引物。
SEQ ID NO：4是用于分离Act8启动子的反向PCR引物。
SEQ ID NO：5是用于分离Act11启动子的正向PCR引物。
SEQ ID NO：6是用于分离Act11启动子的反向PCR引物。
SEQ ID NO：7是用于分离EF1启动子的正向PCR引物。
SEQ ID NO：8是用于分离EF1启动子的反向PCR引物。
SEQ ID NO：9是Act2启动子的序列，其中包括Act2基因的内含 子序列。碱基位置1-764代表启动子序列；碱基位置765-1215代表 内含子，其后是在ATG之前的5碱基5’非翻译区(5’UTR)；转录起始 位点位于碱基位置597。
SEQ ID NO：10是Act8启动子的序列，其中包括Act8基因的第一 个内含子。碱基位置1-797代表启动子序列；碱基位置798-1259代 表内含子，其后是在ATG之前的10碱基5'UTR；转录起始位点位于 碱基位置646。
SEQ ID NO：11是Act11启动子的序列，其中包括Act11基因的第 一个内含子。碱基位置1-1218代表启动子序列；碱基位置1219-1381 代表内含子，其后是在ATG之前的10碱基5'UTR；转录起始位点位 于碱基位置1062。
SEQ ID NO：12是EF1启动子的序列，其中包括EFI基因的第一 个内含子。碱基位置1-536代表启动子序列；碱基位置537-1137代 表内含子，其后是在ATG之前的22碱基5'UTR；转录起始位点位于 碱基位置481。
SEQ ID NO：13是用于分离Act1a启动子的正向PCR引物。
SEQ ID NO：14是用于分离Act1b启动子的正向PCR引物。
SEQ ID NO：15是用于分离Act1a和Act1b启动子的反向PCR引 物。
SEQ ID NO：16是用于分离Act3启动子的正向PCR引物。
SEQ ID NO：17是用于分离Act3启动子的反向PCR引物。
SEQ ID NO：18是用于分离Act7启动子的正向PCR引物。
SEQ ID NO：19是用于分离Act7启动子的反向PCR引物。
SEQ ID NO：20是用于分离Act12启动子的正向PCR引物。
SEQ ID NO：21是用于分离Act12启动子的反向PCR引物。
SEQ ID NO：22是Act1a启动子的序列，其中包括Act1a基因的第 一个内含子。碱基位置1-1033代表启动子序列；碱基位置1034-1578 代表内含子和5'UTR。
SEQ ID NO：23是Act1b启动子的序列，其中包括Act1b基因的第 一个内含子。碱基位置1-914代表启动子序列；碱基位置915-1468 代表内含子和5'UTR序列。
SEQ ID NO：24是Act3启动子的序列，其中包括Act3基因的第一 个内含子。碱基位置1-1023代表启动子序列；碱基位置1024-1642 代表内含子和5'UTR序列。
SEQ ID NO：25是Act7启动子的序列，其中包括Act7基因的第一 个内含子。碱基位置1-600代表启动子序列；碱基位置601-1241代 表内含子和5'UTR序列。
SEQ ID NO：26是Act12启动子的序列，其中包括Act12基因的第 一个内含子。碱基位置1-1017代表启动子序列；碱基位置1018-1313 代表内含子和5'UTR序列。
SEQ ID NO：27是嵌合FMV-Act11启动子的序列，其中包括Act11 基因的第一个内含子。碱基位置1-536代表重复FMV启动子序列； 碱基位置553-1946代表拟南芥属肌动蛋白11启动子、内含子和 5’UTR序列。
SEQ ID NO：28是嵌合FMV-EF1α启动子的序列，其中包括EF1α 基因的第一个内含子。碱基位置1-536代表FMV启动子序列；碱基 位置553-1695代表EF1α启动子、内含子和5'UTR序列。
SEQ ID NO：29是CaMV-Aet8启动子的序列，其中包括Act8基因 的第一个内含子。碱基位置1-523代表CaMV启动子序列；碱基位 置534-1800代表Act8启动子、内含子和5’UTR序列。
SEQ ID NO：30是CaMV-Act2启动子的序列，其中包括Act2基因 的第一个内含子。碱基位置1-523代表CaMV启动子序列；碱基位 置534-1742代表Act2启动子、内含子和5'UTR序列。
发明详述
本申请要求于99年12月16日申请的美国临时申请第60/171,173 号的权益。提供下面的定义和方法以更好地定义本发明，并指导本领 域内的一般技术人员实施本发明。除特别指出，应当按照相关领域内 一般技术人员的常规使用来理解术语。使用在37CFR§1.822陈述的 DNA碱基命名法。使用标准的氨基酸残基单字母命名法和三字母命名 法。
“核酸(序列)”或“多核苷酸(序列)”指基因组来源或合成来源的 单链或双链DNA或RNA，即分别是从5’(上游)端读到3’(下游)端的脱 氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的聚合物。核酸可以代表有义链 或互补(反义)链。
“天然的”指天然出现的(“野生型”)核酸序列。
“异源的，，序列指源自外来来源或物种的序列，或者当来自同一 来源时指由其原始形式受到修饰的序列。
“分离的”核酸序列是与所述核酸天然出现的生物细胞中其通常 结合的其它核酸序列(即其它染色体DNA或染色体外DNA)基本分离 或纯化出来的。该术语包括经过生物化学纯化以便基本去除污染的核 酸和其它细胞成份的核酸。该术语还包括重组核酸和化学合成的核 酸。
本文所用术语“基本纯化的”指与其天然状态通常结合的其它分 子分离开来的分子。更优选基本纯化的分子是在制备物中主要存在的 种类。基本纯化的分子可以不含有天然混合物中存在的60％、优选 75％、更优选90％其它分子(不包括溶剂)。术语“基本纯化的”并不包 括以天然状态存在的分子。
假如第一种核酸序列在与参考核酸(或其互补链)进行最佳序列对 比(在整个比较窗口上，适当地插入或缺失低于参考序列的20％的核苷 酸)时，在至少20个核苷酸位置、优选至少50个核苷酸位置、更优选 至少100个核苷酸位置、最优选所述第一种核酸全长的比较窗口上， 存在至少约75％核苷酸序列同一性、优选至少约80％同一性、更优选 至少约85％同一性、最优选至少约90％同一性，那么该种核酸序列就 与所述参考序列显示“基本同一性”。可以通过下面方法进行比较窗 口的最佳序列对比：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981 的局部同源性算法；Needleman和Wunseh，J.Mol.Biol.48：443，1970 的同源性序列对比算法；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988的相似性搜寻方法；优选使用在Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575Science Dr.， Madison，WI上这些算法的计算机化实现形式(GAP、BESTFIT、FASTA 和TFASTA)。所述参考核酸可以是全长分子或较长分子的一部分。或 者，假如一种核酸分子在严格条件下与另一种核酸分子杂交，如下文 所定义，那么这两种核酸分子就具有基本同一性。
假如两种核酸序列的布置使得第一种核酸序列影向第二种核酸 序列的功能，那么所述第一种核酸序列就与所述第二种核酸序列“有 效连接”。优选这两种序列是单一连续核酸分子的组成部分，或者更 优选是临近的。例如，假如一种启动子调节或介导一种基因在细胞中 的转录，那么所述启动子就与所述基因有效连接。
“重组”核酸是通过人工组合两种在其它情况下是分离的序列区 段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸 区段。进行核酸操作的技术是众所周知的(参见例如Sambrook等， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1989； Mailga等，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor Press， 1995；Birren等，Genome Analysis：第一卷，分析DNA，(1997)，第二卷， 检测基因，(1998)，第三卷，克隆系统，(1999)，第四卷，基因组作图， (1999)，Cold Spring Harbor，New York)。
化学合成核酸的方法在例如Beaucage和Carruthers，Tetra.Letts. 22：1859-1862，1981和Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103：3185，1981 中讨论。可以例如在商业化的自动寡核苷酸合成仪上进行核酸的化学 合成。
可以设计并化学合成“合成核酸序列”以增强在特定宿主细胞中 的表达并用于克隆进合适的构建物。宿主细胞常常显示优选的密码子 选择(Murray等，1989)。因此设计用于增强在特定宿主中表达的合成 DNA应当反映在该宿主细胞中的密码子选择模式。可以获得用于这些 目的的计算机程序，包括但不限于Sequence Analysis Software Package， Genetics Computer Group，Inc.，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI 53711的“BestFit”或“Gap”程序。
核酸“扩增”或“核酸复制”指产生额外的核酸序列拷贝，并使 用聚合酶链式反应(PCR)技术进行。多种扩增方法是本领域内已知的并 且已经得到描述，尤其是美国专利第4,683,195号和第4,683,202号以 及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Innis等编辑， Academic Press，San Diego，1990。在PCR中，引物指退火到DNA模板 以起始聚合酶链式反应的确定序列的短寡核苷酸。
“转化的”、“转染的”或“转基因”指已经引入外源核酸(如重 组构建物)的细胞、组织、器官或生物。所引入的核酸最好整合入受体 细胞、组织、器官或生物的基因组DNA，以便所引入的核酸通过随后 的后代遗传。“转基因”或“转化的”细胞或生物还包括所述细胞或 生物的后代，以及由使用所述“转基因”植物作为杂交亲本的育种程 序产生、并表现由于重组构建物或构建物的存在而引起的表型改变的 后代。
术语“基因”指染色体DNA、质粒DNA、eDNA、合成DNA或 其它编码肽、多肽、蛋白或RNA分子的DNA、以及在编码序列两侧 参与表达调节的区。一些基因可以转录成为mRNA并翻译成为多肽(结 构基因)；而其它基因可以转录成为RNA(如rRNA、tRNA)；其它类型 基因作为表达调节物起作用(调节基因)。
基因“表达”指基因转录产生对应mRNA并且该mRNA翻译产 生对应基因产物，即肽、多肽或蛋白。调节元件控制或调整基因表达， 所述调节元件包括5’调节元件如启动子。
“遗传成分”指可以构成表达构建物的成分或部分的任何核酸序 列或遗传元件。遗传成分的例子包括但不限于启动子区、5’非翻译前 导区、内含子、基因、3’非翻译区和其它调节序列或影响一个或多个 核酸序列转录或翻译的序列。
术语“重组DNA构建物”、“重组构建物”、“表达构建物” 或“表达盒”指来自任何来源、能够整合入基因组或自主复制的任何 因子如质粒、粘粒、病毒、BAC(细菌人工染色体)、自主复制型序列、 噬菌体、或者线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列，包括 其中一种或多种DNA序列使用众所周知的重组DNA技术以功能性可 操作方式连接的DNA分子。
“互补”指核酸序列通过碱基配对(A-G-T与互补序列T-C-A配对) 的天然结合。假如两个单链分子间只有部分核酸对是互补的，那么它 们之间的互补性是部分的；假如所有碱基对都是互补的，那么它们的 互补性就是完全的。互补性的程度影响杂交和扩增反应的效率和强 度。
“同源性”指核酸序列或氨基酸序列分别按照核苷酸或氨基酸位 置同一性百分率而言的相似性水平(即序列相似性或同一性)。同源性 也指在不同核酸或蛋白之间相似功能特性的概念。
“启动子”指位于基因的可读框(或蛋白编码区)翻译起始密码子 5’或上游、涉及RNA聚含酶II和其它蛋白(反式作用转录因子)的识别 和结合以起始转录的核酸序列。“植物启动子”是在植物细胞中有功 能的天然或非天然启动子。组成型启动子在植物的整个发育过程在大 多数或所有植物组织中起作用。组织特异性启动子、器官特异性启动 子或细胞特异性启动子分别仅在或主要在特定组织、器官或细胞类型 中表达。启动子可能在植物的一个部分(如细胞类型、组织或器官)比 在植物的其它部分呈现“增强的”表达(即更高的表达水平)，而不是 在特定组织、器官或细胞类型中“特异性”表达。时序调节的启动子 仅在或主要在植物发育的某些时期或一天内的某些时刻起作用，例如 与昼夜节律有关的基因就是这种情况。诱导型启动子应答内源刺激或 外源刺激的存在，例如化合物(化学诱导物)，或应答环境信号、激素 信号、化学信号和/或发育信号，选择性表达有效连接的DNA序列。 诱导型或调节型启动子包括例如由光、热、胁迫、洪涝或干旱、植物 激素、创伤或化学药品如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂调节的 启动子。
可以用任何植物启动子作为5’调节序列以调节特定一个基因或多 个基因的表达。一种优选的启动子是植物RNA聚合酶11启动子。植物 RNA聚合酶II启动子象其它高等真核生物的RNA聚合酶II启动子一 样，有复杂的结构并由几个独立元件组成。一种这样的元件是真核基 因在体外正确表达和在体内准确有效地起始转录所必需的TATA框或 Goldberg-Hogness框。TATA框通常位于约-25到-35，即在定义为位置 +1的转录起始位点或加帽位点上游(5’)25到35碱基对(bp)(Breathnach 和Chambon，Ann.Rev.Biochem.50：349-383，1981；Messing等，Genetics Engineering of Plants，Kosuge等编辑，第211-227页，1983)。另一个常 见元件CCAAT框位于-70和-100bp之间。在植物中，CCAAT框可以 具有与哺乳动物启动子的功能类似序列不同的共有序列(所述植物类 似物已经命名为“AGGA框”，以将其与动物中的类似元件区分开来； Messing等，Genetics Engineering of Plants，Kosuge等编辑，第21l-227 页，1983)。此外，事实上所有启动子都包括从约-100bp延伸到-1,000bp 或转录起始位点更上游的其它上游激活序列或增强子(Benoist和 Chambon，Nature 290：304-310，1981；Gruss等，Proc.Nat.Acad.Sci. USA 78：943-947，1981；和Khoury和Gruss，Cell 27：313-314，1983)。
当所述启动子与异源DNA序列融合时，所述启动子通常引起所 融合的序列以类似于所述启动子正常连接的基因序列的转录方式进行 转录。可以加入包括调节序列的启动子片段(例如融合到具有其自身的 部分或完全调节序列的活性启动子的5’端，或插入其中)(Fluhr等， Science 232：1106-1112，1986；Ellis等，EMBO J.6：11-16，1987； Strittmatter和Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84：8986-8990，1987； Poulsen和Chua，Mol.Gen.Genet.214：16-23，1988；Comai等，Plant Mol. Biol.15：373-381，1991)。或者，可以在无活性的截短的启动子5’上游 区加上异源调节序列，所述无活性的截短的启动子例如仅包括核心 TATA、有时还包括CCAAT元件的启动子(Fluhr等，Science 232： 1106-1112，1986；Strittmatter和Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84： 8986-8990，1987；Aryan等，Mol.Gen.Genet.225：65-71，1991)。
启动子通常包含多个独立的“顺式作用转录调节元件”或简称“顺 式元件”，每个顺式元件赋予对基因表达总体控制的不同方面 (Strittmatter和Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84：8986-8990，1987；Ellis 等，EMBO J.6：11-16，1987；Benfey等，EMBO J.9：1677-1684，1990)。 “顺式元件”结合调节转录的反式作用蛋白因子。一些顺式元件结合 不止一种因子，而反式作用转录因子可以与不止一个顺式元件以不同 亲和性相互作用(Johnson和McKnight，Ann.Rev.Biochem.58：799-839， 1989)。已经讨论过植物转录因子、对应的顺式元件和它们相互作用的 分析，例如参见Martin，Curr.Opinions Biotech.7：130-138，1996；Murai， Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology，Dashek编辑，CRC Press，1997，第397-422页；和Methods in Plant Molecular Biology， Maliga等编辑，Cold Spring Harbor Press，1995，第233-300页。本发明 的启动子序列可以包含赋予或调节基因表达的“顺式元件”。
可以通过多种技术鉴定顺式元件，包括：缺失分析，即从启动子 的5’末端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹法的DNA 结合蛋白分析、甲基化干扰、电泳迁移率变动分析、通过连接介导的 PCR的体内基因组足迹分析和其它常规分析；或通过常规序列比较方 法分析与已知顺式元件基序的序列相似性。可以通过诱变(或取代)顺 式元件中的一个或多个核苷酸，或通过其它常规方法，进一步研究所 述元件的精细结构(参见例如，Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology，Dashek编辑，CRC Press，1997，第397-422页；和 Methods in Plant Molecular Biology，Maliga等编辑，Cold Spring Harbor Press，1995，第233-300页)。
可以通过化学合成或从包含顺式元件的启动子中克隆，获得所述 顺式元件。也可以合成顺式元件，使其具有添加的包含有用限制酶位 点的侧翼序列，以利于亚序列操作。在一个实施方案中，所述启动子 由多个独立的“顺式元件”组成。在一个优选的实施方案中，使用计 算机程序鉴定包含以下核酸序列的“顺式元件”的序列区：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、 SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，其 中所述计算机程序包括但不限于专门设计用于鉴定序列内顺式元件或 结构域或基序的MEME或SIGNALSCAN。
本发明包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的片段或顺式元件，或者与本发明的核酸序列 具有同源性的已知影响基因调节的顺式元件的同源物。这样的核酸片 段可以包括已公开序列的任何区。如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、 SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的本发明的启动子区 或部分启动子区可以包含至少一种调节元件，所述调节元件包括但不 限于能够例如在雄性生殖组织中调节有效连接的DNA的表达的“顺式 元件”或结构域。
植物启动子也可以包括通过操作已知启动子以获得合成、嵌合或 杂种启动子而产生的启动子。这样的启动子也可以结合来自一个或多 个启动子的顺式元件，例如通过在具有其自身部分或完全调节序列的 活性启动子上添加异源调节序列(Ellis等，EMBO J.6：11-16，1987； Strittmatter和Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84：8986-8990，1987； Poulsen和Chua，Mol. Gen.Genet.214：16-23，1988；Comai等，Plant.Mol. Biol.15：373-381，1991)。也已经通过在无活性的截短启动子的5’上游 区添加异源调节序列，发展出嵌合启动子，所述无活性的截短启动子 即仅包括核心TATA并任选包括CCAAT元件的启动子(Fluhr等， Science 232：1106-1112，1986；Strittmatter和Chua，Proc.Nat.Acad.Sci. USA 84：8986-8990，1987；Aryan等，Mol.Gen.Genet.225：65-71， 1991)。
依照本发明的嵌合或杂种启动子可以包括至少一种已知的顺式 元件，如由各种环境因子如光、热或胁迫调节的元件；由病原体或化 学药品等等调节或诱导的元件。根据所述条件，这类元件可以或者正 调节或者负调节基因的表达。顺式元件的例子包括但不限于氧效应元 件(Cowen等，J.Biol.Chem.268(36)：26904，1993)、光调节元件(参见例 如，Bruce和Quail，Plant Cell 2：1081，1990和Bruce等，EMBO J.10： 3015，1991)、响应茉莉酮酸甲酯处理的顺式元件(Beaudoin和Rothstein， Plant Mol.Biol.33：835，1997)、水杨酸效应元件(Strange等，Plant J.11： 1315，1997)、热激反应元件(Pelham等，Trends Genet.1：31，1985)、响应 创伤和非生物性胁迫的元件(Loace等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89： 9230，1992；Mhiri等，Plant Mol.Biol.33：257，1997)、冷效应元件(Baker 等，Plant Mol.Biol.24：701，1994；Jiang等，Plant Mol.Biol.30：679，1996； Nordin等，Plant Mol.Biol.21：641，1993；Zhou等，J.Biol.Chem.267： 23515，1992)以及干旱效应元件(Yamaguchi等，Plant Cell 6：251-264， 1994；Wang等，Plant Mol.Biol.28：605，1995；Bray E.A.Trends in Plant Science 2：48，1997)。
在另一实施方案中，如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列包括任何 长度能够调节有效连接的DNA序列的所述核苷酸序列。例如，如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30 所公开的序列可以截短或缺失部分序列，但仍然能够调节有效连接的 DNA序列的转录。在一个相关实施方案中，所公开序列的顺式元件可 以赋予特定的特异性，例如赋予有效连接的DNA序列在某些组织中的 增强表达。因此，SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29 和SEQ ID NO：30所公开序列的任何序列片段、部分或区可以用作调节 序列，其中包括但不限于所公开序列的顺式元件或基序。例如，可以 从启动子序列的5’或3’末端缺失一个或多个碱基对，以产生“截短的” 启动子。也可以在启动子序列内部插入、缺失或置换一个或多个碱基 对。可以通过例如将启动子片段置于最小启动子的上游而构建启动 子，以便所述启动子片段或元件有效连接。最小启动子或基础启动子 是能够募集并结合基本转录机器的DNA片段。真核细胞中基本转录机 器的一个例子是RNA聚合酶II复合物及其辅助蛋白。所述基本转录机 器的酶促成份能够利用最小或基础启动子，起始和延伸特定基因的转 录。也就是说，在启动子区没有添加的能够募集和结合调节转录(如增 强转录、阻抑转录、使转录成为激素依赖型等等)的转录因子的顺式作 用序列。可以结合取代、缺失、插入或它们的任何组合以产生最终构 建物。
可以修饰本发明的启动子序列，例如以在其它植物系统内表达。 在另一方法中，可以通过多种方法设计或工程化新型杂种启动子。许 多启动子包含激活、增强或确定所述启动子强度和/或特异性的上游序 列(Atchison，Ann.Rev.Cell Biol.4：127，1988)。例如，T-DNA基因包含 确定转录起始位点的“TATA”框以及其它位于转录起始位点上游调整 转录水平的上游元件(Gelvin，Transgenic Plants，Kung，S.-D.和Us，R.编 辑，San Diego：Academic Press，第49-87页，1988)。另一种嵌合启动子 将章鱼氨酸合酶(ocs)激活剂的三聚体结合到甘露氨酸合酶(mas)激活 子加启动子上，据报道该启动子增加报道基因的表达(Min Ni等，The Plant Journal 7：661，1995)。本发明的上游调节序列可以用于构建这样 的嵌合或杂种启动子。构建本发明变异型启动子的方法包括但不限于 组合不同启动子的控制元件或重复启动子的部分或区(参见例如美国 专利5,110,732和美国专利5,097,025)。本领域内的技术人员熟悉构 建、操作和分离大分子(如DNA分子、质粒等等)、产生重组生物、筛 选和分离基因的特定条件和程序(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1989；Mailga等， Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor Press，1995； Birren等，Genome Analysis：第1卷，分析DNA，(1997)，第2卷，检测 基因，(1998)，第3卷，克隆系统，(1999)，第4卷，基因组作图，(1999)， Cold Spring Harbor，New York)。
本发明还包括设计、构建和应用包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26中一种或多 种顺式元件的嵌合或杂种启动子以调整或调节有效连接的核酸序列的 表达。
SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、 SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的启动子序列、片段、区或其顺式元件能够在多种组织中转录 有效连接的DNA序列，因此能够在多种组织中选择性调节基因表达。
对于许多农学性状，需要在多种组织中转录一个或多个目的基因 以赋予所需的特征。需要获得调节有效连接的基因在选定靶组织中转 录的合适启动子，因为可能不希望在所有组织中表达基因，而是仅在 某些组织中表达基因。例如，假如人们希望选择性表达靶基因以表达 除草剂耐性基因，人们可能希望在营养性组织和生殖组织中表达所述 除草剂抗性基因。本发明的启动子序列可以用于在多种组织中调节基 因表达，所述组织包括但不限于快速生长的分生组织、雄性生殖组织 (雄蕊群)如花粉、花药和花丝、雌性生殖组织(雌蕊群)如柱头、花柱和 子房、叶、萼片和花瓣。因此，本发明的启动子可用于表达除草剂耐 性基因，例如当在植物发育的多种组织和阶段需要耐性时表达。本发 明的启动子序列可用于调节任何靶基因的转录，所述靶基因包括但不 限于控制下列性状的基因：育性、产量、耐虫性、真菌耐性、除草剂 耐性或任何所需性状。尤其优选的基因包括除草剂耐性基因或耐虫性 基因。
在一个实施方案中，当需要在多种组织中表达除草剂耐性基因 时，本发明的启动子尤其可用于调节除草剂耐性基因的表达。例如， 所述除草剂耐性基因可以赋予对除草剂草甘膦的耐性。合适的草甘膦 耐性基因的例子包括但不限于草甘膦抗性EPSP合酶基因或降解草甘 膦的基因产物如草甘膦氧化还原酶和膦酸N-乙酰转移酶。对于任何植 物生物工程策略而言，获得5’调节元件的广泛选择是重要的，以便获 得对于所需的表达分布型最为有效的合适调节元件。
在另一实施方案中，本发明的启动子可用于确定基因功能。许多 基因的功能是未知的，而本发明的启动子可以用作构建物中的遗传元 件，以允许对以有义或反义取向表达的一个或多个基因进行表型评 价。当需要在组成组织和生殖组织进行高水平基因表达时，本发明的 启动子可以成为开发用于高通量测定的植物表达构建物的成分。
可以选择任何植物来鉴定基因和调节序列。用于分离基因和调节 序列的合适植物靶的例子包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属、 朝鲜蓟、芝麻菜、石刁柏、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、 越桔、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、canola、网纹甜瓜、胡萝卜、 木薯、篦麻籽、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽叶、柑桔、克里曼 丁、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、酸果蔓、黄瓜、花旗松、茄 子、苣荬菜、宽叶苦苣、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、 葡萄柚、蜜瓜、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、 亚麻籽、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油料种子油 菜(oil seed rape)、秋葵、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、番木瓜、欧芹、 欧洲防风、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松、菠萝、车前、李、 石榴、杨、马铃薯、南瓜、？？、radiata pine、radiscchio、萝卜、油 菜籽、树莓、水稻、黑麦、高梁、南方松、大豆、菠菜、笋瓜、草莓、 甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香、红桔、茶树、烟草、番茄、小黑 麦、草皮、芜菁、藤、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。对于鉴定调节序 列尤其优选的植物是拟南芥属、玉米、小麦、大豆和棉花。
本发明的启动子序列分离自拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物 DNA。在一个优选的实施方案中，构建物包括有效连接可转录序列的 本发明启动子序列，以及合适的终止子和调节元件。可以将这样的构 建物转化进合适的靶植物。可以使用任何植物作为包含本发明启动子 序列的核酸构建物的合适宿主。合适靶植物的例子包括但不限于苜 蓿、嫩茎花椰菜、卷心菜、canola、花椰菜、玉米、棉花、酸果蔓、黄 瓜、苦苣、豌豆、杨、松、马铃薯、洋葱、水稻、树莓、大豆、甘蔗、 甜菜、向日葵、番茄和小麦。
启动子分离和修饰方法
可以使用多种方法分离本文公开的启动子序列的片段。可以采用 公众可得到的序列信息，使用基于PCR的方法从植物基因组文库扩增 侧翼区。本领域内的技术人员已知多种扩增与已知序列核心区邻近的 未知DNA序列的方法。方法包括但不限于反向PCR(IPCR)、载体盒 (vectorette)PCR、Y型(Y-shaped)PCR和基因组步查方法。对于本发 明，通过可得的序列信息通过设计PCR引物从拟南芥属分离所述核酸 分子。
也可以通过其它技术获得核酸片段，例如通过化学方法直接合成 片段，正如通常使用自动寡核苷酸合成仪所进行的实践。也可以通过 应用核酸复制技术获得片段，例如使用分子生物学领域技术人员众所 周知的重组DNA技术的PCR(聚合酶链式反应)技术。对于使用特定 扩增引物对扩增靶核酸序列(如通过PCR)，“严格PCR条件”指这样 的条件：允许所述引物对仅与具有对应野生型序列(或其互补物)的引 物将会结合的靶核酸序列杂交，并且最好产生单一扩增产物。
本领域内的技术人员知道制备植物基因组DNA的方法。在一种 方法中，可以用限制酶部分消化，然后根据大小选择处于特定大小范 围内的DNA片段，可以从选定物种制备基因组DNA文库。可以将所 述基因组DNA克隆进合适的构建物，所述构建物包括但不限于噬菌 体，使用从许多销售商(参见例如Stratagene，La Jolla CA或Gibco BRL， Gaithersburg，MD)获得的合适克隆试剂盒用合适的构建物如噬菌体制 备。
在另一实施方案中，可以修饰本文公开的启动子的核苷酸序列。 本领域内的技术人员可以创造在核苷酸序列上有改变的DNA分子。可 以修饰或改变如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29 和SEQ ID NO：30所示的本发明的核苷酸序列，以增强它们的控制特 性。例如，可以通过在基于PCR的DNA修饰方法中插入、缺失或取 代模板序列而修饰所述序列。“变异型”DNA分子是包含如下改变的 DNA分子：其中天然序列的一个或多个核苷酸发生了缺失、添加和/ 或置换，但最好同时基本保留启动子功能。在启动子片段的情况下， “变异型”DNA可以包括影响其有效连接的最小启动子转录的改变。 例如通过标准DNA诱变技术或通过化学合成所述变异型DNA分子或 其部分，可以产生变异型DNA分子。
本发明的启动子序列除可用于调节基因表达外，还可用作核酸杂 交实验中的探针或引物。本发明的核酸探针和引物可以在严格条件下 与靶DNA序列杂交。术语“严格杂交条件”定义为：在该条件下探针 或引物特异性地与靶序列杂交，而不与非靶序列杂交，该条件可以根 据经验确定。术语“严格条件”按照通过特定杂交程序(参见例如 Sambrook等，1989，在9.52-9.55，Sambrook等，1989在9.47-9.52，9.56- 9.58；Kanehisa，Nuci.Acids Res.12：203-213，1984；和Wetmur和 Davidson，J.Mol.Biol.31：349-370，1968)使核酸探针与靶核酸的杂交 (即与特定目的核酸序列的杂交)，在功能上加以定义。促进DNA杂交 的合适严格杂交条件是本领域内技术人员已知的，例如，在6.0x氯 化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃，然后用2.0x SSC在50℃洗涤，或者 所述条件可以在实验室手册中找到，所述实验室手册包括但不限于 Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，1989， 6.3.1-6.3.6。例如，可以在以下范围内选择洗涤步骤中的盐浓度：从约 2.0x SSC在50℃的低严格性到约0.2x SSC在50℃的高严格性。此外， 洗涤步骤中的温度可以从室温(约22℃)的低严格性条件增加到约65℃ 的高严格性。可以同时改变温度和盐，或者可以使温度或盐浓度保持 恒定，而改变另一变量。对于高严格性，例如，使用DNA或RNA探 针或引物的杂交可以在以下条件下进行：6x SSC，0.5％SDS，5x Denhardt’s，100μg/mL非特异性DNA(如超声处理过的鲑精DNA)， 65℃，用0.5x SSC，0.5％SDS在65℃下洗涤。
假如一种核酸分子与另一种核酸分子显示完全互补性，那么说前 者是后者的“互补物”。如本文所用，当其中一种分子的每一个核苷 酸都与另一种分子的核苷酸互补，就说这两种分子显示“完全互补 性”。假如两种分子相互杂交，其稳定性足以允许它们至少在常规的 “低严格性”条件下保持相互退火，那么这两种分子就是“最小互补 的”。相似地，假如两种分子相互杂交，其稳定性足以允许它们在常 规的“高严格性”条件下保持相互退火，那么这两种分子就是“互补 的”。人们考虑：假如探针或引物与靶序列结合的特异性是保守的， 那么就可以用低严格性条件如低杂交和/或洗涤温度来鉴定具有较低 程度序列相似性的相关序列。因此，由于本发明核苷酸序列与互补 DNA片段序列段选择性形成双链体分子的能力，因此可以使用它们。 通过杂交检测DNA区段是本领域内技术人员众所周知的，因此根据所 设想的应用，人们会希望使用不同的杂交条件以获得探针对靶序列不 同程度的选择性，而选择的方法将取决于所希望的结果。常规严格性 条件描述于Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二 版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1989和 Haymes等，Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press， Washington，DC，1985。
在本发明的一个实施方案中，在其它植物组织的杂交测定中使用 核酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25 和SEQ ID NO：26、或这些序列的片段、区、顺式元件或寡聚物，以鉴 定密切相关或同源的基因和相关的调节序列。这些包括但不限于在任 何基体上进行的DNA印迹分析或RNA印迹分析，所述基体包括但不 限于合适制备的植物组织、纤维素、尼龙或组合滤膜、芯片或载玻片。 这样的方法是本领域内众所周知的，并且可以在由经销商提供的试剂 盒或制剂中获得。
本文所用的核酸片段是并非全长的核酸的部分。例如，对于本发 明，任何长度短于所公布的SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核苷酸序列的核苷酸序列 都被认为是片段。片段也可以包括能够在如上文所定义的严格杂交条 件下与天然核酸特异性杂交的至少最小长度。这样的最小片段的长度 最好是天然核酸序列的至少8个核苷酸、更优选15个核苷酸、甚至更 优选至少20个核苷酸、最优选至少30个核苷酸。
“探针”是分离的核酸，其上连接有常规的可检测标记或报道分 子，例如放射性同位素、配体、化学发光试剂或酶。“引物”是分离 的核酸，其通过核酸杂交与互补靶DNA链退火，形成引物和靶DNA 链之间的杂交体，然后由聚合酶如DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸。 可以使用引物对扩增核酸序列，如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常 规核酸扩增方法。
探针和引物的长度一般为11个核苷酸或更长，最好18个核苷酸 或更长，更优选25个核苷酸、最优选30个核苷酸或更长。所述探针 和引物在高严格性杂交条件下与靶DNA或RNA序列特异性杂交，在 低严格性条件下与另一物种的靶天然序列特异性杂交。依照本发明的 探针和引物最好与天然序列有完全序列相似性，虽然探针与天然序列 不同并且可以通过常规方法设计保留与靶天然序列杂交的能力。制备 和使用探针和引物的方法描述于，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1-3卷，Sambrook等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989(下文称为 “Sambrook等，1989”)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel 等编辑，Green Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定期 更新)(下文称为“Ausubel等，1992”)；和Innis等，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press：San Diego，1990。可以从已 知序列衍生出PCR引物对，例如通过使用为该目的的计算机程序如 Primer(Version 0.5，Whitehead Institute for Biomedical Research， Cambridge，MA)。可以使用基于本文公开的天然启动子序列的引物和 探针确认所公开的序列，必要时使用所述引物和探针通过常规方法如 重克隆和重测序来修饰所公开的序列。
构建物和表达构建物
可以将依照本发明的天然或合成的核酸掺入能够引入宿主细胞 并在宿主细胞中复制的重组核酸构建物中，一般是DNA构建物。在一 个优选的实施方案中，将如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示的本发明的核苷酸序列 或其片段、变异体或衍生物掺入表达盒，所述表达盒包括与遗传元件 例如可选择、可筛选或可评价的标记基因有效连接的本发明的启动子 区。
在另一实施方案中，如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示的本发明所公开的核酸 序列有效连接到遗传元件，如赋予与下列性状有关的所需特征的核 酸：植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养强化、抗病性或 有害生物耐性、或环境或化学药品耐性。这些遗传元件如标记基因或 目的农学基因可以在转化植物细胞或转化植物的鉴定中起作用，或产 生具有农学应用的产物。
在另一实施方案中，一种遗传元件产生作为选择装置的产物，该 产物在可再生植物组织中起作用，产生赋予所述植物组织对在其它情 况下有毒的化合物的抗性的化合物。用作可选择、可筛选或可评价标 记的目的基因包括但不限于GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶的编码序列)、 GFP(绿荧光蛋白的编码序列)、LUX(萤光素酶的编码基因)、抗生素 抗性标记基因或除草剂耐性基因。转座子和相关抗生素抗性基因的例 子包括转座子Tns(bla)、Tn5(npt II)、Tn7(dhfr)、青霉素、卡那霉素(和 新霉素、G418、博来霉素)；氨甲碟呤(和三甲氧苄二氨嘧啶)；氯霉素； 卡那霉素和四环素。
在一份关于微生物应用的报道中已经概述了对于植物选择标记 有用的特征(Advisory Committee on Novel Foods and Processes，1994年 7月)。这些包括产生最小数目未转化组织的严格选择、不明显干扰再 生的大量独立转化事件、应用于大量物种、以及评价组织中所述标记 存在的测定的可用性。
许多选择标记基因是本领域内已知的，几种抗生素抗性标记满足 这些标准，包括卡那霉素抗性标记(npt II)、潮霉素B抗性标记(aph IV) 和庆大霉素抗性标记(aac3和aacCA)。有用的显性选择标记基因包括编 码抗生素抗性的基因(如潮霉素抗性、卡那霉素抗性、博来霉素抗性、 G418抗性、链霉素抗性或壮观霉素抗性)；和除草剂抗性基因(如膦丝 菌素乙酰转移酶)。选择除草剂抗性转化子的有用策略描述于，例如， Vasil，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第I-III卷， Laboratory Procedures and Their Applications Academic Ptess，New York， 1984。尤其优选用于本发明中的选择标记基因是赋予化合物抗性的基 因，所述化合物如抗生素如卡那霉素，以及除草剂如草甘膦(Della- Cioppa等，Bio/Technology 5(6)，1987，美国专利5,463,175，美国专利 5,633,435)。也可以实施其它选择装置，这些选择装置也处于本发明的 范围内。
为实施本发明，使用制备和应用DNA构建物和宿主细胞的常规 组合物和方法，如特别是在Sambrook等，1989中讨论的。在一个优选 的实施方案中，所述宿主细胞是植物细胞。许多适于转染植物细胞或 适于建立转基因植物的DNA构建物已经在如Pouwels等，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，增刊1987)；Weissbach和 Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989； Gelvin等，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers， 1990；和R.R.D.Croy Plant Molecular Biology LabFax，BIOS Scientific Publishers，1993中描述。植物表达构建物可以包括，例如，处于5’和 3’调节序列转录控制下的一个或多个克隆植物基因。它们也可以包括 如所述选择含有所述表达构建物的宿主细胞的选择标记。这样的植物 表达构建物还包含一个启动子调节区(如控制诱导型或组成型表达、环 境调节或发育调节表达、细胞特异性或组织特异性表达的调节区)、一 个转录起始位点、一个核糖体结合位点、一个RNA加工信号、一个转 录终止位点和一个聚腺苷酸化信号。也包括其它细菌起源的序列以允 许所述构建物在细菌宿主中克隆。所述构建物一般还将包含广宿主范 围的原核生物复制起点。在一个尤其优选的实施方案中，所述宿主细 胞是植物细胞，所述植物表达构建物包含：一个如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所公开的启 动子区；一个有效连接的可转录序列；和一个转录终止序列。设想作 为表达载体中遗传成分的其它调节序列包括但不限于可以与所述启动 子偶联的非翻译前导序列。在一个尤其优选的实施方案中，所述宿主 细胞是植物细胞，所述植物表达构建物包含：一个如SEQ ID NO：9、 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所公开的启 动子区；一个有效连接的可转录序列；和一个转录终止序列。植物表 达构建物也可以包含其它序列，其中包括但不限于包含可用于克隆目 的的限制酶位点的多接头序列。
植物表达构建物中的遗传元件
植物表达构建物可以包含不止一个各自与不同启动子有效连接 的可表达基因序列。许多启动子可用于任何目的基因的植物基因表 达，所述目的基因包括但不限于选择标记、评价标记、有害生物耐性 基因、抗病性基因、营养强化基因和任何其它有农学意义的基因。可 用于植物基因表达的组成型启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶 病毒(CaMV)P-35S启动子，该启动子赋予在大多数植物组织，包括单 子叶植物(参见，例如，Dekeyser等，Plant Cell 2：591，1990；Terada和 Shimamoto，Mol.Gen.Genet.220：389，1990)中的组成型、高水平表达 (参见，例如，Odel等，Nature 313：810，1985)；CaMV 35S启动子的串 联重复形式、增强的35S启动子(P-e35S)、胭脂氨酸合酶启动子(An等， PIant Physiol.88：547，1988)、章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等，Plant Cell 1：977，1989)；如美国专利第5,378,619号所述的玄参花叶病毒(P-FMV) 启动子和FMV启动子的增强形式(P-eFMv)(其中P-FMV的启动子序列 串联重复)、花椰菜花叶病毒19S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖 草黄斑驳病毒启动子以及其它已知在植物细胞中表达的植物DNA病 毒启动子。
多种对环境信号、激素信号、化学信号和/或发育信号应答的植物 基因启动子可用于在植物细胞中表达有效连接的基因，所述启动子包 括由下列信号调节的启动子：(1)热(Callis等，Plant Physiol.88：965， 1988)，(2)光(如豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等，Plant Cell 1：471， 1989；玉米rbcS启动子，Schaffner和Sheen，Plant Cell 3：997，1991； 或叶绿素a/b结合蛋白启动子，Simpson等，EMBO J.4：2723，1985)，(3) 激素如脱落酸(Marcotte等，Plant Cell 1：969，1989)，(4)创伤(如wun I， Siebertz等，Plant Cell 1：961，1989)；或(5)化学药品如茉莉酮酸甲酯、 水杨酸或安全剂。使用(6)器官特异性启动子(如Roshal等，EMBO J.6： 1155，1987；Schernthaner等，EMBO J.7：1249，1988；Bustos等，Plant Cell 1：839，1989)也是有利的。
本发明的启动子是能够在快速生长的分生组织和生殖组织中转 录有效连接的DNA序列、并且可以在表达构建物中有效连接任何目的 基因的植物启动子。
植物表达构建物可以包括位于转基因中多肽编码序列上游或下 游的RNA加工信号如内含子。此外，所述表达构建物可以包括来自植 物基因3’非翻译区的其它调节序列(Thornburg等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84：744(1987)；An等，Plant Cell 1：115(1989))，例如包括3’终止 子区以增加所述mRNA的mRNA稳定性，例如马铃薯的PI-II终止子 区或章鱼氨酸或胭脂氨酸合酶3’终止子区。mRNA的5’非翻译区在翻 译起始中起重要作用，也可以成为植物表达构建物中的遗传成分。例 如，已经证明来自热激蛋白基因的非翻译5’前导序列增强植物中的基 因表达(参见，例如，美国专利5,362,865)。这些其它的上游和下游调 节序列可以来自对于所述表达构建物中存在的其它元件为天然或异源 的来源。
用本发明的启动子序列控制植物细胞中的基因表达。所公开的启 动子序列是构成用于植物转化的构建物的一部分的遗传成分。本发明 的启动子序列可以与任何合适的植物转化质粒或构建物一起使用，所 述质粒或构建物包含如所述的可选择或可筛选标记以及相关调节元 件，以及一种或多种以足以赋予特定所需性状的方式表达的核酸。本 发明设想的有农学意义的合适结构基因的例子包括但不限于：一种或 多种耐虫性基因如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)基因、 有害生物耐性基因如防制真菌病的基因、除草剂耐性基因如赋予草甘 膦耐性的基因、改善品质的基因，所述品质指例如产量、营养强化、 环境或胁迫耐性、或任何在植物生理学、生长、发育、形态学或植物 产品上的所需改变。例如，结构基因将包括任何赋予耐虫性的基因， 包括但不限于如下列文献所述的芽孢杆菌属昆虫防制蛋白基因：WO 9931248，特此通过引用完整地结合到本文中，美国专利第5,689,052 号，特此通过引用完整地结合到本文中，美国专利第5,500,365号和第 5,880275号，特此通过引用完整地结合到本文中。在另一实施方案中， 所述结构基因可以赋予对除草剂草甘膦的耐性，赋予所述耐性的基因 包括但不限于农杆菌属(Agrobacterium)菌株CP4草甘膦抗性EPSPS基 因(aroA：CP4)，如美国专利第5,633,435所述，特此通过引用完整地结 合到本文中，或草甘膦氧化还原酶基因(GOX)，如美国专利第5,463,175 所述，特此通过引用完整地结合到本文中。
或者，所述DNA编码序列可以通过编码非翻译RNA分子，例如 通过反义介导的机制或共阻抑介导的机制引起内源基因表达的定向抑 制，从而影响这些表型(参见，例如，Bird等，Biotech.Gen.Engin.Rev. 9：207，1991)。所述RNA也可以是工程化以切割所需内源mRNA产物 的催化性RNA分子(即核酶)(参见例如，Gibson和Shillitoe，Mol.Biotech. 7：125，1997)。因此，产生表达目的表型改变或形态学改变的蛋白或 mRNA的任何基因可用于实施本发明。
除位于上游(5’)或DNA序列内的调节元件或序列外，还有下游(3’) 序列影响基因表达。因此，本文所用术语调节序列指与细胞的蛋白质 合成装置联合作用，控制、介导或影响基因产物表达的位于DNA序列 上游、中间或下游的任何核苷酸序列。
本领域内的技术人员知道适于植物转化的构建物。最好使用所述 的可筛选或可评价标记，将本发明的启动子序列掺入表达构建物中， 并在瞬时分析中进行测试以在转化植物中提供基因表达的指标。在瞬 时测定中检测基因表达的方法是本领域内技术人员已知的。已经报道 了使用各种植物、组织和DNA传递系统瞬时表达标记基因。例如，瞬 时分析的类型可以包括但不限于在任何瞬时植物测定中使用任何目的 植物物种，通过对组织的电穿孔或粒子轰击直接传递基因。这样的瞬 时系统将包括但不限于来自小麦悬浮培养物的原生质体(Zhou等，Plant Cell Reports 12：612，1993)、小麦叶原生质体的电穿孔(Sethi等，J.Crop Sci.52：152，1983)；由玉米组织制备的原生质体的电穿孔(Sheen，J.The Plant Cell 3：225，1991)、或对特定目的组织的粒子轰击。本发明包括应 用任何瞬时表达系统来评价与选定报道基因、标记基因或目的农学基 因有效连接的调节序列。设想在瞬时测定中通过合适传递系统测试的 植物组织的例子将包括但不限于叶基组织、愈伤组织、子叶、根、胚 乳、胚、花组织、花粉和表皮组织。
在瞬时测定中可以使用任何可评价或可筛选标记。对本发明启动 子或5’调节序列进行瞬时分析优选的标记基因包括β-葡糖醛酸糖苷酶 (GUS)基因或绿荧光蛋白(GFP)基因。将包含有效连接标记基因的5’调 节序列的表达构建物传递到组织中，然后根据所述标记，通过合适的 机制分析所述组织。使用定量或定性分析作为工具，评价所述5’调节 序列当有效连接目的农学基因时在稳定植物中的可能表达分布型。最 后，将本发明的5’调节序列直接掺入合适的植物转化表达构建物，所 述构建物包含有效连接可转录目的DNA序列的5’调节序列，将所述 构建物转化进植物，分析稳定转化植株及其后代的所述5’调节序列赋 予的所需表达分布。
将外源DNA引入植物细胞的合适表达构建物包括但不限于用于 农杆菌属介导的方法中的无毒性(disarmed)Ti质粒。这些构建物可以包 含一个抗性标记、1-2个T-DNA边界、大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属的 复制起点以及一个或多个目的基因和相关调节区。本领域内的技术人 员知道在农杆菌介导的方法中，可以利用许多菌株和方法。这样的菌 株包括但不限于农杆菌属菌株C58、LBA4404、EHA101和EHA105。 尤其优选的菌株是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株。
可以通过本发明方法引入的核酸的例子包括，例如，来自另一物 种的DNA序列或基因，或甚至起源于同一物种或在同一物种中存在、 但通过并非传统繁殖或育种技术的遗传工程方法掺入受体细胞的基因 或序列。然而，术语“外源的”也用于指不在受转化的细胞中正常存 在、或者可能仅仅不以所述转化DNA区段或基因中出现的形式、结构 存在的基因，或者指正常存在、但人们希望以不同于天然表达模式的 方式(如过量表达)表达的基因。因此，术语“外源的”基因或DNA用 于指任何引入受体细胞的基因或DNA区段，而不论所述细胞中是否已 经存在相似基因。外源DNA中包括的DNA类型包括：已经在所述植 物细胞中存在的DNA、来自其它植物的DNA、来自不同生物的DNA、 或外部产生的DNA如包含基因反义信息的DNA序列或编码基因的合 成或修饰形式的DNA序列。
可以通过任何植物转化方法将包含本发明启动子序列的植物转 化构建物引入植物。可以利用几种方法将DNA序列引入植物细胞，这 些方法是本领域内众所周知的。合适的方法包括但不限于细菌感染(如 用上文所述的农杆菌属)、二元细菌人工染色体构建物、直接传递DNA (如通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄入、电穿孔、与碳 化硅纤维一起搅拌)以及加速DNA包被的粒子(在Potrykus，Ann.Rev. Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42：205，1991中综述)。
特异性转化双子叶植物的方法主要使用根癌农杆菌。例如，已经 报道的转基因植物包括但不限于棉花(美国专利第5,004,863号；美国 专利第5,159,135号；美国专利第5,518,908号，WO97/43430)、大豆(美 国专利第5,569,834号；美国专利第5,416,011号；McCabe等， Bio/Technology，6：923，1988；Christou等，Plant Physiol.，87：671， 1988)；芸苔属(Brassica)(美国专利第5,463,174号)以及花生(Cheng等， Plant Cell Rep.，15：653，1996)。
已经报道了转化单子叶植物的相似方法。已经针对多种作物描述 了使用这些方法的转化和植物再生，所述作物包括但不限于石刁柏 (Asparagus officinalis；Bytebier等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345， 1987)；大麦(Hordeum vulgarae；Wan和Lemaux，Plant Physiol.，104：37， 1994)；玉米(Zea mays；Rhodes，C.A.等，Science，240：204，1988； Gordon-Kamm等，Plant Cell，2：603，1990；Fromm等，Bio/Technology，8： 833，1990；Koziel等，Bio/Technology，11：194，1993)；燕麦(Avena sativa； Somers等，Bio/Technology，10：1589，1992)；鸡脚草(Dactylis glomerata； Horn等，Plant Cell Rep.，7：469，1988)；水稻(Oryza sativa，包括indica 变种和japonica变种，Toriyama等，Bio/Technology，6：10，1988；Zhang 等，Plant Cell Rep.，7：379，1988；Luo和Wu，Plant Mol.Biol.Rep.，6：165， 1988；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.，76：835，1988；Christou等， Bio/Technology，9：957，1991)；高梁(Sorghum bicolor；Casas，A.M.等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：11212，1993)；甘蔗(Saccharum spp.； Bower和Birch，Plant J.，2：409，1992)；苇状羊茅(Festuca arundinacea； Wang，Z.Y.等，Bio/Technology，10：691，1992)；草皮草(Agrostis palustris； Zhong等，Plant Cell Rep.，13：1，1993)；小麦(Triticum aestivum；Vasil等， Bio/Technology，10：667，1992；Weeks T.等，Plant Physiol.，102：1077， 1993；Becker等，Plant，J.5：299，1994)和苜蓿(Masoud，S.A.等，Transgen. Res.，5：313，1996)。对于本领域内技术人员明显的是：可以利用和改 变多种转化方法，从多种目的作物产生稳定的转基因植物。
植物分析方法
分析转化植物中目的基因的存在以及本发明启动子序列赋予的 表达水平和/或分布型。本领域内的技术人员知道可用于分析转化植物 的多种方法。使用多种方法评价基因表达，并确定所引入的基因是否 整合、是否正常起作用以及是否如所预期地遗传。对于本发明，可以 通过测定启动子有效连接的基因的表达水平，评价所述启动子。使用 报道基因，通过瞬时测定方法，可以确定对启动子功能的初步评价， 但从对稳定植物的分析可以获得更确定性的启动子评价。植物分析方 法包括但不限于DNA印迹分析或RNA印迹分析、基于PCR的方法、 生物化学分析、表型筛选方法、田间评价和免疫诊断学测定。
本发明的方法包括但不限于PCR技术、分离基因组DNA、构建 表达构建物、瞬时测定和植物转化方法，这些方法是本领域内技术人 员众所周知的，并使用标准技术或其修改形式执行。
草甘膦喷洒试验
在一个实施方案中，进行草甘膦耐性的温室或田间评价。本文用 术语“草甘膦”统称母体除草剂N-膦酰甲基甘氨酸(也称为草甘膦酸)、 其盐或酯、或在植物组织中转化为N-膦酰甲基甘氨酸的化合物、或以 其它方式提供离子形式N-膦酰甲基甘氨酸(也称为草甘膦离子)的化合 物。作为例证，Franz的美国专利第3,799,758号和第4,405,531号公开 了本文使用的水溶性草甘膦盐，所述文献的公开内容通过引用结合到 本文中。可以按照本发明使用的草甘膦盐包括但不限于碱金属盐，例 如钠盐和钾盐；铵盐；C1-16烷基铵盐，例如二甲基铵盐和异丙基铵盐； C1-16链烷醇铵盐，例如单乙醇铵盐；C1-16烷基锍盐，例如三甲基锍盐； 它们的混合物等等。草甘膦酸分子有三个酸位点，这三个酸位点有不 同的pKa值；因此可以使用一代盐、二代盐和三代盐，或它们的混合 物，或任何中间中和水平的盐。
草甘膦盐有商业意义，部分因为它们是水溶性的。许多铵盐、烷 基铵盐、链烷醇铵盐、烷基锍盐和碱金属盐是高度水溶性的，允许配 制成高度浓缩的水溶液，在使用时用水稀释。
这样的浓缩水溶液可以含有按酸相当(g a.e./l)表示的每升约50克 到约500克草甘膦。优选更高的草甘膦浓度，例如约300到约500g a.e..l。
或者将草甘膦盐配制成水溶性组合物或水分散性组合物，例如采 用粉剂、颗粒剂、丸状或片剂的形式。所述组合物常常称为干制剂， 但词语“干”在这里不应当理解为意味着完全不含水。通常干制剂含 有少于约5％(重量)的水，例如约0.5％到约2％(重量)的水。这样的制 剂需要在使用时溶解或分散于水中。
设想的干草甘膦制剂可以含有按酸相当(％a.e.)表示的约5％到约 80％(重量)的草甘膦。优选在上述范围内的较高草甘膦浓度，例如约 50％到约80％a.e.。用于制造干制剂的尤其有用的草甘膦盐是钠盐和铵 盐。
本发明的植物处理组合物和液体以及干浓缩组合物可以任选地 含有一种或多种所需的赋形剂成份。对于草甘膦组合物尤其有用的赋 形剂成份是表面活性剂，表面活性剂协助水性喷洒溶液保留在相对疏 水的植物叶表面，也帮助草甘膦穿透叶的蜡质外层(角质层)并因此接 触叶内的活组织。表面活性剂也可以执行其它有用功能。
可以用于本发明草甘膦组合物中的表面活性剂在类型和化学种 类上没有限制。在特定情形下，非离子型、阴离子型、阳离子型和两 性型或者一种以上所述类型的组合都是有用的。然而，一般优选至少 一种存在的表面活性剂(如果有的话)应当是非阴离子型的，即至少一 种所述表面活性剂应当是非离子型、阳离子型或两性型的。
在此有用的许多表面活性剂具有包含一个或多个部分的化学结 构，所述部分各由一个C2-4烯化氧单位或C2-4烯化氧单位聚合链或共 聚合链组成。所述表面活性剂称为聚氧化烯表面活性剂，包括非离子 型、阴离子型、阳离子型和两性型。在目前设想的组合物中有用的聚 氧化烯表面活性剂包含约2到约100个C2-4烯化氧单位。在优选的聚 氧化烯表面活性剂中，烯化氧单位形成一条或多条环氧乙烷链或环氧 乙烷和环氧丙烷共聚物链，烯化氧单位的每条链具有一个氢(hydrido) 端基或用C1-4烷基或C1-4烷酰基封端。
在本发明组合物中有用的表面活性剂的疏水部分可以是基本基 于烃的，在这种情况下所述疏水部分一般是C8-24、优选C12-18的烷基、 链烯基、烷芳基、烷酰基或链烯酰基链。这些链可以是线性或分支的。 或者，所述疏水部分可以含有硅原子，例如采取硅氧烷基团的形式如 七甲基三硅氧烷基团，或者所述疏水部分可以含有氟原子，例如作为 部分氟化的烷基链或全氟烃基链。
在非离子型表面活性剂中，尤其优选的种类包括聚氧乙烯烷基、 链烯基或烷芳基醚(例如乙氧基化伯醇或仲醇或烷基酚)、聚氧乙烯烷 基或链烯基酯(例如乙氧基化脂肪酸)、聚氧乙烯脱氧山梨糖醇烷基 酯、甘油基烷基酯、蔗糖酯、烷基多聚糖苷等等。所述非离子型表面 活性剂的代表性具体例子包括聚氧乙烯(9)壬基酚、Shell的NeodolTM25-7(聚氧乙烯(7)C12-15线性伯醇)、Union Carbide的TergitolTM 15-S-9 (聚氧乙烯(9)C12-15仲醇)、ICI的TweenTM 20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖 醇单月桂酸酯)和Henkel的AgrinulTM PG-2069(C9-11烷基多聚糖苷)。
在阳离子型表面活性剂中，尤其优选的种类包括聚氧乙烯叔烷基 胺或链烯基胺(如乙氧基化脂肪胺)、季铵表面活性剂、聚氧乙烯烷基 醚胺等等。所述阳离子型表面活性剂有代表性的具体例子包括聚氧乙 烯(5)椰油胺(cocoamine)、聚氧乙烯(15)牛油脂肪胺、氯化二硬脂酰基 二甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、氯化甲基双(2-羟乙基)椰油铵、氯 化N-十二烷基吡啶和聚氧丙烯(8)氯化乙氧基三甲基铵。尤其优选的聚 氧乙烯烷基醚胺是PCT公开说明书WO 96/32839公开的那些化合物。 本领域内知道许多阳离子叔铵表面活性剂可以与草甘膦组合使用，并 且可以用于本文所设想的组合物中；所述叔铵表面活性剂具有式
(NRaRbRcRd)mAn
其中A是合适的阴离子如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、硫 酸根或磷酸根，m和n是整数，使得阳离子(NRaRbRcRd)的正电荷与阴 离子A的负电荷相平衡，Ra、Rb、Rc和Rd的选择包括但不限于：
(i)Ra是苄基或C8-24，优选C12-18、烷基或链烯基，而Rb、Rc和Rd独立地是C1-4烷基，优选甲基；
(ii)Ra和Rb独立地是C8-24、优选C12-18烷基或链烯基，而Rc和 Rd独立地是C1-4烷基，优选甲基；
(iii)Ra是C8-24、优选C12-18烷基或链烯基，Rb是具有约2到约 100个C2-4烯化氧单位(优选环氧乙烷单位)的聚氧化烯链， 而Rc和Rd独立地是C1-4烷基，优选甲基；
(iv)Ra是C8-24、优选C12-18烷基或链烯基，Rb和Rc是具有总共 约2到约100个C2-4烯化氧单位(优选环氧乙烷单位)的聚氧 化烯链，而Rd是C1-4烷基，优选甲基；
(v)Ra是具有约2到约100个C2-4烯化氧单位的聚氧化烯链， 其中主要是C3-4烯化氧单位(优选环氧丙烷单位)，而Rb、Rc和Rd独立地是C1-4烷基，优选甲基或乙基。
该类型中尤其优选的季铵表面活性基是那些在Claude等的美国 专利第5,464,807号中公开的化合物。
在一个实施方案中，与所述季铵表面活性基结合的所述阴离子A 可以是草甘膦阴离子。
在两性型表面活性剂，包括本领域内习惯更正确地描述为两性离 子型的表面活性剂中，尤其优选的种类包括聚氧乙烯烷基氧化胺、烷 基甜菜碱、烷基取代的氨基酸等等。所述两性型表面活性剂有代表性 的例子包括氧化十二烷基二甲基胺、聚氧乙烯(2)氧化椰油胺和硬脂酰 基二甲基甜菜碱。
本领域内技术人员可以从标准参考来源中选择不限于上述种类 的合适表面活性剂，所述标准参考来源包括Gower出版的Handbook of Industrial Surfactants，第二版(1997)、MC Publishing Company出版的 McCutcheon′s Emulsifiers and Detergents，北美和国际版(1997)和 Cosmetic，Toiletry and Fragranee Association出版的International Cosmetic Ingredient Dictionary，第六版(1995)卷1和卷2。
本发明组合物的其它可选成份包括改变颜色、粘度、胶凝特性、 冰点、吸湿性、结块行为、溶解速率、分散性或其它配制特性的试剂。
草甘膦商业制剂的例子包括但不限于：Monsanto Company销售的 和除草剂，所有这些除 草剂都含有异丙基铵盐形式的草甘膦；Monsanto Company销售的 和除草剂，所述除草剂含有铵盐形式的草 甘膦；Monsanto Company销售的除草剂， 所述除草剂含有钠盐形式的草甘膦；Zeneca Limited销售的 除草剂，所述除草剂含有三甲基锍盐。
选择有生物活性的草甘膦制剂的施用量在一般农业技术人员的 知识范围内。本领域内技术人员同样会认识到：在实施本发明的过程 中，单株条件、天气条件和生长条件影响所获得的结果。二十多年的 草甘膦应用和关于所述应用的已发表的研究已经提供了丰富的信息， 杂草防除实施人员可以根据这些信息选择对于特定物种在特定环境条 件下在特定生长阶段有效除草的草甘膦施用量。
本发明的一种方法适用于草甘膦作为除草剂或植物生长调节剂 对其有生物活性的任何或所有植物物种。这包括世界范围内各种各样 的植物物种。同样，本发明的组合物可应用于草甘膦对其有生物活性 的任何和所有植物物种。
在一个实施方案中，施用含草甘膦的除草剂于含本发明DNA构 建物的植株，然后评价所述植株对所述草甘膦除草剂的耐性。可使用 任何草甘膦制剂测试含本发明DNA构建物的植株。例如，可以使用草 甘膦组合物如Roundup UltraTM。评价植物草甘膦耐性的测试参数将随 多种因素而变。因素将包括但不限于：草甘膦制剂的类型、所述制剂 中使用的草甘膦的浓度和用量、植物类型、施用期间植物的发育阶段、 环境条件、施用方法以及特定制剂的施用次数。例如，可以在温室环 境中使用喷洒施用方法测试植物。使用Roundup UltraTM的测试范围可 以包括但不限于8盎司/英亩到256盎司/英亩。根据具体作物和植物发 育阶段，Roundup UltraTM的优选商业有效范围可以从16盎司/英亩到 64盎司/英亩。一种作物可以至少喷洒施用一次草甘膦制剂。为在棉花 中测试，在3叶期以32盎司/英亩施用一次，然后在后面的发育阶段 再施用。对于小麦，可以在3-5叶期以32盎司/英亩施用Roundup UltraTM一次，然后根据所测试的小麦类型，在收获前或收获后施用一次。可 以优化每种作物的测试参数，以便找出赋予所需商业有效草甘膦耐性 水平的包含本发明构建物的特定植株。
提供下面的实施例以示范本发明的优选实施方案。本领域内的技 术人员应该认识到：在下面实施例中公开的技术代表本发明人发现的 在本发明实施中作用良好的技术。然而，本领域内的技术人员根据本 公开物应当理解：在不偏离本发明的精神和范围的情况下，对于所公 开的具体实施方案可以作出许多改变而仍然获得类似或相似的结果， 因此在附图中陈述或显示的所有内容应当被解释为是说明性、而不是 限制性的。
实施例
实施例1
使用的质粒构建物是pUC克隆构建物或双边界植物转化构建 物，所述构建物包含大肠杆菌复制起点如ori322、广宿主范围复制起 点如oriV或oriRi、和选择标记的编码区如编码赋予壮观霉素或链霉素 抗性的Tn7氨基糖苷腺苷转移酶(aadA)的Spc/Str或庆大霉素(Gm，Gent) 选择标记。为进行植物转化，所述宿主细菌菌株是根癌农杆菌ABI或 LBA4404。
所述遗传元件描述如下：P-e35S是来自CaMV的35S RNA，包 含重复的-90-300区，如美国专利第5,424,200号所述，该文献特此通 过引用完整地结合到本文中；P-FMV是来自玄参花叶病毒的34S启动 子，如美国专利第5,378,619号所述，该文献特此通过引用完整地结合 到本文中；P-eFMV是所述FMV启动子的衍生物，包含重复的FMV 启动子增强子区；CTP2是拟南芥属EPSP合酶的转运肽区，如美国专 利第5,633,435号所述；aroA：CP4syn(aroA：CP4)是如美国专利第 5,633,435号所述的CP4EPSP(合成序列)编码区，或根据特定植物物 种中的密码子选择而修饰以在植物中表达；E93’是豌豆RbcS基因分 离物的作为聚腺苷酸化信号起作用的3’末端；nos是胭脂氨酸合酶基 因的作为聚腺苷酸化信号起作用的3’末端；Hsp70是来自矮牵牛 (Petunia hybrida)的非翻译前导序列，如美国专利第5,362,865号所述， 该文献特此通过引用完整地结合到本文中；GUS是大肠杆菌β-葡糖醛 酸糖苷酶编码序列(Jefferson，R.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83： 8447-8451，1987)；右边界(RB)和左边界(LB)来自根癌农杆菌章鱼氨酸 和胭脂氨酸菌株的Ti质粒。P-AtAct2是来自拟南芥肌动蛋白2基因的 启动子；AtAct2i是拟南芥肌动蛋白2基因5’非翻译区(UTR)中的内含 子；P-AtAct8是拟南芥肌动蛋白8基因的启动子；AtAct2i是拟南芥肌 动蛋白8基因5’UTR中的内含子；P-AtAct11是拟南芥肌动蛋白11 基因的启动子；AtAct11i是拟南芥肌动蛋白11基因5'UTR中的内含 子；P-AtAct1a是拟南芥肌动蛋白1a基因的启动子，L-AtAct1a是所述 肌动蛋白1a基因的非翻译前导序列，I-AtAct1a是来自所述肌动蛋白 1a基因的基因组DNA的内含子；P-AtAct1b是拟南芥肌动蛋白1b基 因的启动子，L-AtAct1b是来自所述肌动蛋白1b基因的非翻译前导序 列，I-AtAct1b是来自肌动蛋白1b基因的基因组DNA的内含子；P- AtAct3是拟南芥肌动蛋白3基因的启动子，L-AtAct3是来自所述肌动 蛋白3基因的非翻译前导序列，I-AtAct3是来自所述肌动蛋白3基因 的基因组DNA的内含子；P-AtAct7是拟南芥肌动蛋白7基因的启动 子，L-AtAct7是来自所述肌动蛋白7基因的非翻译前导序列，I-AtAct7 是来自所述肌动蛋白7基因的基因组DNA的内含子；P-AtAct12是拟 南芥肌动蛋白12基因的启动子，L-AtAct12是来自所述肌动蛋白12 基因的非翻译前导序列，I-AtAct12是来自所述肌动蛋白12基因的基 因组DNA的内含子；P-AtEF1α(P-AtEF1或EF1α)是拟南芥延伸因子 基因1α的启动子，AtEF1α-i(AtEF1-i)是拟南芥延伸因子基因1α的 5'UTR中的内含子。’
图1-18提供包含一到三个植物表达盒的植物转化构建物的例 子。植物分子生物学领域内的技术人员能够不经过分的试验，就可构 建包含本发明启动子和遗传元件的植物表达盒的多种组合并在作物中 测试。不应当认为在附图中显示的构建物是能够装配的仅有的构建 物，所述构建物仅仅是作为例子提供给本领域内的技术人员。图1 (pCGN8086)提供了包含一个表达盒的植物转化构建物的例子，该表达 盒包含与目的基因(CTP2-aroA：CP4syn)有效连接的一个本发明的启动 子(P-AtAct8)。图2(pMON45325)提供了包含两个表达盒的植物转化构 建物的例子，所述表达盒包含与至少一个目的基因(CTP2-aroA：CP4syn) 有效连接的至少一个本发明的启动子(P-AtAct11)。图3(pMON45331) 提供了包含一个表达盒的植物转化构建物的例子，所述表达盒包含与 至少一个目的基因(CTP2-aroA：CP4syn)有效连接的一个本发明的启动 子(P-AtEF1加内含子)。图4(pMON45332)提供了包含两个表达盒的植 物转化构建物的例子，所述表达盒包含与至少一个目的基因(CTP2- aroA：CP4syn)有效连接的至少一个本发明的启动子(P-AtEF1加内含 子)。图5(pMON9190)提供了包含三个表达盒的植物转化构建物的例 子，在所述表达盒中，至少两个本发明的启动子(P-AtEF1加内含子， AtEF1α-i；P-AtAct2加内含子，AtAct2i)与至少一个目的基因(CTP2- aroA：CP4syn)有效连接，而P-eFMV启动子与CTP2-aroA：CP4syn有效 连接。图6(pMON9153)植物表达盒与图4(pMON45332)显示的植物表 达盒相同，显示该质粒图谱的目的是鉴定在说明书中显示的数据表中 关于植物表型所示数据的表达盒。图7(pCGN8099)提供了包含两个表 达盒的植物转化构建物的例子，所述表达盒包含驱动目的基因 (aroA：CP4syn)转录的本发明杂种启动子P-eFMV-AtEF1α和P-e35S- AtAct8。图8(pCGN8088)提供了包含两个表达盒的植物转化构建物的 例子，所述表达盒包含本发明的一个启动子P-AtAct8加内含子、 AtAct8i和驱动目的基因(aroA：CP4syn)表达的P-eFMV启动子。图9 (pCGN8068)提供了包含两个表达盒的植物转化构建物的例子，所述表 达盒包含本发明的一个启动子P-AtAct2加内含子、AtAct2i和驱动目 的基因(aroA：CP4syn)表达的P-eFMV启动子。图10(pCGN8096)提供 了包含两个表达盒的植物转化构建物的例子，所述表达盒包含驱动目 的基因(aroA：CP4syn)转录的本发明杂种启动子P-eFMV/-AtAct11和P- e35S-AtAct2。图11(pCGN9151)提供了包含两个表达盒的植物转化构 建物的例子，所述表达盒包含驱动目的基因(aroA：CP4syn)转录的本发 明杂种启动子P-eFMV-AtEF1α和P-e35S-AtAct2。图12(pMON10156) 提供了包含一个表达盒的植物转化构建物的例子，所述表达盒包含驱 动目的基因aroA：CP4syn表达的P-eFMV启动子，该载体用于与本发 明启动子序列进行比较的目的。图13(pMON52059)提供了包含一个表 达盒的植物转化构建物的例子，所述表达盒包含驱动目的基因 (aroA：CP4syn)表达的杂种启动子(P-eFMV-AtEF1α)。图14 (pMON54952)提供了包含一个表达盒的植物转化构建物的例子，所述 表达盒包含与至少一个目的基因(CTP2-aroA：CP4syn)有效连接的一个 本发明启动子(P-AtAct1a加AtAct1a内含子)。图15(pMON54953)提供 了包含一个表达盒的植物转化构建物的例子，所述表达盒包含与至少 一个目的基因(CTP2-aroA：CP4syn)有效连接的一个本发明启动子(P- AtAct1b加AtAct1b内含子)。图16(pMON54954)提供了包含一个表达 盒的植物转化构建物的例子，所述表达盒包含与至少一个目的基因 (CTP2-aroA：CP4syn)有效连接的一个本发明启动子(P-AtAct3加AtAct3 内含子)。图17(pMON54955)提供了包含一个表达盒的植物转化构建 物的例子，所述表达盒包含与至少一个目的基因(CTP2-aroA：CP4syn) 有效连接的一个本发明启动子(P-AtAct7加AtAct7内含子)。图18 (pMON54956)提供了包含一个表达盒的植物转化构建物的例子，所述 表达盒包含与至少一个目的基因(CTP2-aroA：CP4syn)有效连接的一个 本发明启动子(P-AtAct12加AtAct12内含子)。
实施例2
克隆构建物和GUS构建物列于表1。使用拟南芥Landsberg erecta DNA作为模板(Rogers和Bendich，Plant Mol.Biol.5：69，1998)，用SEQ ID NO：1(正向引物)和SEQ ID NO：2(反向引物)在下面反应中分离拟南 芥属肌动蛋白2启动子和内含子(Genbank登记号U41998，如An等， Plant J. 10：107-121，1996所述)：0.5μg模板DNA、25pmole每种引物、 taq聚合酶(BMB，Indianapolis，IN)，用蜡珠进行“热起始”PCR。PCR 热循环仪条件如下：94℃1分钟；30个循环的92℃40秒，55℃1分钟， 72℃1分钟30秒；5分钟72℃延伸。所述PCR用GeneClean II(Bio101 Inc.，Vista，CA)纯化，用HindlII和Nco I消化，然后连接进用HindIII 和Nco I消化的构建物pMON26149(表1)。证实启动子克隆的序列， 并将得到的构建物命名为pMON26170(表1)。
表1.包含拟南芥属肌动蛋白和EF1启动子序列的克隆构建物和GUS 构建物
*所述肌动蛋白和延伸因子启动子序列也包含来自对应基因的5’ UTR的内含子序列。
实施例3
使用拟南芥Landsberg erecta DNA作为模板，应用实施例2所述 的PCR条件和纯化方法，用引物SEQ ID NO：3(正向引物)和SEQ ID NO：4(反向引物)分离拟南芥属肌动蛋白8启动子和内含子(Genbank登 记号U42007，如An等，Plant J. 10：107-121，1996所述)。如实施例2 所述用限制酶克隆所述启动子，证实所述启动子的序列，并将获得的 构建物命名为pMON26171(表1)。
实施例4
使用拟南芥Landsberg erecta DNA作为模板，应用实施例2所述 的PCR条件和纯化方法，用引物SEQ ID NO：5(正向引物)和SEQ ID NO：6(反向引物)分离拟南芥属肌动蛋白11启动子和内含子(Genbank 登记号U27981，如Huang等，Plant Mol.Biol.，33：125-139，1997所述)。 用限制酶EcoR V和Nco I克隆所述启动子并将其连接进pMON8677 (表1)，证实所述启动子的序列，并将获得的构建物命名为pMON48407 (表1)。
实施例5
使用拟南芥Landsberg erecta DNA作为模板，应用实施例2所述 的PCR条件和纯化方法，用引物SEQ ID NO：7(正向引物)和SEQ ID NO：8(反向引物)分离拟南芥属延伸因子1α(AtEF1α)启动子和内含子 (Genbank登记号X16430，如Axelos等，Mol.Gen.Genet.219：106-112， 1989；Curie等，NAR 19：1305-1310；Curie等，Plant Mol.Biol.18：1083- 1089，1992；Curie等，Mol.Gen.Genet.238：428-436，1993所述)。如实 施例2所述用限制酶HindIII和Nco I克隆所述启动子并将其连接进 pMON26152(表1)，证实所述启动子的序列，并将获得的构建物命名 为pMON26177(表1)。
实施例6
将所述植物转化构建物通过交配转移进农杆菌属。基本如 WO/0036911所述进行棉花转化，该文献特此通过引用完整地结合到 本文中。如Ye等，Plant Journal 19：249-257，1999所述进行拟南芥属转 化。如美国专利第5,565,347号所述进行番茄转化，该文献特此通过引 用完整地结合到本文中。
实施例7
通过合适的传递系统例如农杆菌介导的转化方法将DNA构建物 转化进靶作物(参见例如美国专利第5,569,834号，该文献特此通过引 用完整地结合到本文中，美国专利第5,416,011号，该文献特此通过引 用完整地结合到本文中，美国专利第5,631,152号，该文献特此通过引 用完整地结合到本文中，美国专利第5,159,135号，该文献特此通过引 用完整地结合到本文中，美国专利第5,004,863号，该文献特此通过引 用完整地结合到本文中，以及美国临时申请第60/111795号，该文献 特此通过引用完整地结合到本文中)。或者，可以使用粒子轰击方法(参 见例如专利申请WO 92/15675、WO 97/48814和欧洲专利申请586,355 和美国专利第5,120,657号、美国专利第5,503,998号、美国专利第 5,830,728号、美国专利第5,015,580号，所有这些文献都通过引用完 整地结合到本文中)。
可以利用大量转化和再生系统，并且这些转化和再生系统是本领 域内技术人员众所周知的。然后通过多种本领域内技术人员已知的分 子、免疫诊断学、生物化学和/或田间评价方法，分析稳定转化植株和 后代中所述基因在目标组织中的表达，所述评价方法包括但不限于在 生长室或田间环境中以商业化有效的浓度使用草甘膦制剂进行喷洒测 试。
实施例8
通过本领域内技术人员已知的常规方法进行GUS测定(参见，例 如，Jefferson等，EMBO J. 6：3901，1987)。对于棉花，测试R0植株。 在发育不同阶段根据大小选择组织，取样，汇集样品以进行分析。收 获棉花花序芽，取雄性生殖组织样品(花药和花丝)、雌性生殖组织样 品(整个柱头、花柱和子房)和花冠(萼片和花瓣)。为进行大小选择，选 择每个阶段的三个花序芽，所述花序芽包括小(短于0.5cm)、中(从 0.5-0.7em)和大(candle stage或开花)的几种大小。将棉花植株放置在温 室中约1-2周后收集叶样品，并在约1-2月后收集其它样品。不收集初 花(头五个结果位置保持完整)。
对于拟南芥属，分析V1植株，并仅测试纯合分离体和杂合分离 体。每种构建物分析八到十个事件(每事件5个植株)。拟南芥属的GUS 结果代表8-10个事件的汇集样品。所公开的表(表2和表3)中的值代 表对于所指定组织的平均GUS表达(pmol/MU/分钟/mg)。
实施例9
分析植株在叶组织和生殖组织中的GUS表达，所述生殖组织包括 未成熟的花序芽和花。结果显示于表2。测试的构建物包括pMON48407 (P-AtAct11+内含子/GUS/nos)、pMON26170(P-AtAct2+内含子 /GUS/nos)、pMON26171(P-At-Act8+内含子/GUS/nos)、pMON11750 (e35S/GUS/nos)、pMON26177(P-EF1α+内含子/GUS/nos)和 pMON15737(P-FMV/GUS/nos)。所述肌动蛋白和延伸因子启动子在多 种组织包括生殖组织中赋予高水平GUS表达。
表2.平均拟南芥属V1GUS表达
实施例10
测试R0棉花植株选定组织不同发育阶段的GUS报道基因表达。 根据大小对花序芽划分阶段(小、中和大；大＝candle和开花)。雄蕊群 代表包括整个花托(柱头、花柱和子房)的雄性生殖组织。花冠样品包 括萼片和花瓣。如实施例8所述制备所述组织并进行GUS测试。结果 概述于表3。测试的构建物包括pMON48407(P-EF1α+内含子 /gus/nos)、pMON26170(P-AtAct2+内含子/gus/nos)和pMON48407 (P-AtAct11+内含子/gus/nos)。
对于pMON26177测试六株植株并获得平均GUS值。对于 pMON26170测试二十株植株并获得平均GUS值。对于pMON48407 测试八株植株并获得平均GUS值。结果证明：所述肌动蛋白和延伸因 子启动子可用于尤其在生殖组织中有效表达有效连接的基因。
表3.棉花植株的GUS测定结果
实施例11
在一个温室喷洒测试中，使用Roundup UltraTM草甘膦制剂和Track Sprayer装置(Roundup Ultra是Monsanto Company的注册商标)，测试 转化植株。植株处于“二”真叶期或更晚的生长阶段，在应用喷洒前使叶干燥。使用的制剂是3磅/加仑a.e.(酸相当)Roundup UltraTM制剂。使用如下的校准：
对于20加仑/英亩喷洒体积：
根据所需测试范围，喷洒浓度将有所变化。例如，如所需喷洒率 为8盎司/英亩，则使用3.1ml/L的工作溶液，如所需喷洒率为64盎司 /英亩，则使用24.8ml/L的工作溶液。
根据作物、植物发育阶段和所需的耐性水平，评价周期将有所变 化。
实施例12
用于番茄转化的植物表达构建物列于表4。在使用草甘膦 (Roundup UltraTM)制剂的温室草甘膦喷洒试验中，筛选包含构建物的番 茄植株(T0)赋予转基因番茄植株草甘膦耐性的效率，其中所述构建物 包含有效连接一个aroA：CP4草甘膦耐性基因的至少一个肌动蛋白或 延伸因子启动子(包含内含子)。任选地通过喷洒应用草甘膦(Roundup UltraTM)，筛选转化进番茄植株的有效连接一个aroA：CP4基因的至少 一个肌动蛋白或延伸因子启动子序列以及有效连接一个aroA：CP4的 一个eFMV花椰菜花叶病毒启动子。以48盎司/英亩喷洒番茄植株， 然后在应用后两周进行评价，分析营养性耐性，并在应用后直到60天 进行评价，分析生殖性耐性。结果显示于表4，并根据选择生殖耐受 系的效率进行分级。营养性耐性百分率是筛选出的显示对草甘膦损害 有足够营养性耐性的系的百分率，考虑进一步研究所述系的农学性状 以制备商业化候选物。生殖性耐性百分率是也显示有足够繁殖耐性的 营养耐受系的百分率，考虑对所述系进行进一步的农学评价。所有构 建物都证明能够为转基因番茄植株有效提供营养性耐性和生殖性耐 性。各种启动子组合能够增加在本试验中通过筛选选择营养性耐性系 和生殖性耐性系的效率。包含拟南芥属EF1α启动子的构建物更加特异 性地与营养性耐受系的高百分率相关。P-Act2启动子与P-eFMV和P- AtEF1α(pCGN9190)的组合提高了通过本方法筛选的繁殖性耐受系的 百分率。
表4.温室轨道喷洒试验，其中喷洒率为48盎司/英亩*
*施用一次
1从25次筛选汇集的结果。施用后14天计数
2从25次筛选汇集的结果。施用后直到60天计数
使用番茄种子产量作为本发明使用的赋予转基因植物草甘膦耐 性的各种启动子序列和表达盒组合的效率的衡量。在表5中，显示了 转基因番茄植株三个田间试验的结果，所述转基因番茄植株包含用本 发明的启动子驱动草甘膦耐性的aroA：CP4编码序列表达的构建物。试 验1是用从构建物产生的植株的测试，所述构建物包含天然形式的玄 参花叶病毒启动子(P-FMV)或其重复增强形式(P-eFMV)以及也在用于 测试本发明启动子序列的构建物中出现的所述构建物中的其它遗传元 件。也测试其它遗传元件例如5’非翻译序列和叶绿体转运肽的来 源。构建物pMON20998包含连接矮牵牛Hsp70 5’UTR的P-eFMV、 连接拟南芥属EPSPS叶绿体转运肽(CTP-2)的前导序列，并连接到E9 3’终止区。构建物pMON20999与pMON20998的不同之处仅在于其启 动子是P-FMV。构建物pMON10156与pMON20998的不同之处仅在 于其CTP来自矮牵牛EPSPS叶绿体转运肽(CTP-4)。构建物 pMON45312与pMON20998的不同之处仅在于其前导序列是天然 FMV前导序列。
将番茄植株移植到大田，排列成行。在田间用Roundup除草剂以 48盎司/英亩的比率喷洒处理所述植株。从果实收集番茄种子并称重。 一个未喷洒的番茄植株系作为对照以进行比较，每种构建物的效力以 对照的百分率表示。试验1的结果(表5的栏1)是：FMV启动子和P- eFMV仅提供未喷洒对照种子产量的5-11％。试验2和3在不同地点 测试本发明的构建物(表5的栏2和3)。试验2在试验1的同一地点进 行，构建物pCGN8099(图7)、pCGN9151(图11)和pCGN9190(图5) 表现很好，提供了相对于未喷洒对照的25-46％种子。在一个生长季节 较冷的不同地点，试验3证明：pCGN8068(图9)、pCGN8088(图8)、 pCGN8099、pCGN9151、pCGN9153(图6)和pMON45325(图2)能够 赋予番茄足够的草甘膦耐性，产生相对于未喷洒对照约34-77％的正常 种子。
表5.番茄种子产量试验
实施例13
SEQ ID NO：1-8和SEQ ID NO：13-21是由拟南芥Act1、Act2 (Genbank#U41998)、Act3、Act7、Act8(Genbank#ATU42007)、Act11 (Genbank#ATU27981)、Act12和Elflα(Genbank#X16430)基因公共可 得的信息设计的PCR引物。这些序列用于使用聚合酶链式反应(PCR) 扩增技术延伸所述核酸序列(参见例如Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263，1986；Erlich等，欧洲专利申请50,424；欧洲 专利申请84,796、欧洲专利申请258,017、欧洲专利申请237,362；Mullis， 欧洲专利申请201,184；Mullis等，美国专利第4,683,202号；Erlich，美 国专利4,582,788；和Saiki等，美国专利第4,683,194号)。许多PCR扩 增方法是本领域内技术人员已知的，并用于鉴定与已知序列邻近的核 酸序列。例如，已经描述了反向PCR (IPCR)方法，该方法用于扩增与 已知序列核心区邻近的未知DNA序列。也可以利用其它方法，例如捕 获PCR(Lagerstrom M.等，PGR Methods Applic.1：111，1991)和步查 PCR(Parker等，Nucleic Acids Res 19：3055，1991)。许多生产商也已经 开发了基于这些方法的改进形式的试剂盒以鉴定目的序列。技术进步 包括引物和连接物设计的改进、聚合酶的改进、以及热循环仪的能力 已经促进了更快的分离目的序列的有效方法。
表5.分离拟南芥属肌动蛋白和EF1α启动子序列的引物序列
At.肌动蛋白2正向：TTTTTTTTGATATCAAGCTTCAACTATTTTTATGTATGC
At.肌动蛋白2反向：
GCCTCAGCCATGGTGAGTCTGCTGCAAACACACAAAAAGAGTTCAAT
At.肌动蛋白8正向：
TTTTTTTTGATATCAAGCTTCCATTTTTCTTTTGCATAATTC
At.肌动蛋白8反向：
GCATCGGCCATGGTGAGTCTTCTGCAATCAAAAACATAAAGATCTGA
At.肌动蛋白11正向：
TTTTTTTTTAAGCTTGATATCACAACCAAATGTCAAATGG
At.肌动蛋白11反向：CCATCTGCCATGGTCTATATCCTGTC
At.EF1α正向：TTTTTTTTTAAGCTTGATATCGGAAGTTTCTCTCTTG
At.EF1α反向：CTTTTCCCATGGTAGATCTCTGGTCAACAAATC
At.肌动蛋白1a正向：CCCAAGCTTAAATGACATCAGATACACGC
At.肌动蛋白1b正向：CATAAGCTTAGAGGTCCAAATTCA
At.肌动蛋白1反向：CCATCAGCCATGGTCTTCTACCTTTATGCAAA
At.肌动蛋白3正向：CCAAGCTTACCACACTCAGATGCATAAACAAACACA
At.肌动蛋白3反向：CATCAGCCATGGTCTACTCTCTGCAAAAACA
At.肌动蛋白7正向：GCAAAGCTTACTAGTCAACAATTGGCC
At.肌动蛋白7反向：GATCGGCCATGGTTCACTAAAAAAAAAG
At.肌动蛋白12正向：GGAAGCTTGCGGCCGCTTTCTACTCTACATGTTTCT
将拟南芥小植株的叶(1g)在9ml CTAB缓冲液(Saghai-Maroof等， 1984，PNAS 81：8014-8018)中匀浆。所述CTAB缓冲液含100mM TrisHCl，pH 7.8，700mM NaCl，50mM EDTA，1％CTAB(溴化烷基 三甲基铵)和140mM2-巯基乙醇。在65℃温育90分钟后，加入4.5ml 氯仿∶异戊醇(24∶1)，混合样品10分钟。通过在1500g离心10分钟， 分离水层，并用氯仿∶异戊醇再萃取。第二次离心后，将水层转移到含 50ml 10mg/ml RNA酶A(无DNA酶)的试管中，在室温下温育30分 钟以除去RNA。用6ml异丙醇沉淀DNA，并重悬浮于1ml 10mM TrisHCl缓冲液pH 8.5中。DNA溶液用等体积苯酚萃取一次，然后用 等体积氯仿∶异戊醇萃取一次。离心后，在水层加入1/10体积乙酸钠(3 M，pH 5.2)，然后加入2.5倍体积乙醇。钩起DNA，在70％乙醇中洗， 然后风干并重悬浮于0.2ml 10mM TrisHCl缓冲液。
在50ml PCR反应中使用拟南芥属基因组DNA(100ng)。包含显 示于表5的所述引物的反应包含0.2mM反向和正向引物溶液、200nM dNTP和含镁的PCR缓冲液、来自ExpandTM High Fideity PCR System (Roche Molecular Biochemicals)的DNA聚合酶混合物。在开始于94℃ 变性2分钟后，反应物以94℃0.5分钟、55℃0.5分钟和72℃1.5分钟 循环35次。在1％琼脂糖凝胶上通过电泳分析PCR产物。用T4DNA 激酶将凝胶分离的代表肌动蛋白1a、肌动蛋白1b、肌动蛋白7和肌动 蛋白12序列的DNA片段磷酸化，连接进去磷酸化并用Sma I切割的 pUC19克隆构建物中。筛选白色菌落中含适插入片段的存在，用M13 测序以确认肌动蛋白启动子的存在。选定的克隆命名为pMON54941 (P-AtAct1a)、pMON54942(P-AtAct1b)、pMON54943(P-AtAct7)和 pMON54944(P-AtAct12)。随后，用HindIII和Nco I消化包含所述插 入片段序列的pUC19构建物，释放肌动蛋白启动子DNA序列，凝胶 分离所述DNA片段并连接进用同样限制酶消化的pMON26165。用 HindIII和Nco I消化肌动蛋白3启动子(P-AtAct3)的PCR产物，然后 直接克隆进pMON26165，形成pMON54951。pMON26165包含 GUS/nos终止子基因区段。与该启动予区段的连接使得能够通过在植 物细胞中β-葡糖醛酸糖苷酶的表达测定每种启动子的功能活性。所述 植物细胞可以是分离自例如烟草叶原生质体，或者所述植物细胞可以 包含在一种植物组织或器官中，如叶、根、子叶、下胚轴、胚、花或 贮藏器官中。
在大豆下胚轴中测定与P-e35S启动子驱动的GUS相比，由这些 启动子驱动的GUS表达水平(表6)。将质粒DNA/金粒子轰击进大豆下 胚轴，48小时后用组织化学方法测定GUS活性。该测定中测试的所 有肌动蛋白启动子都在下胚轴组织中显示功能活性，证明它们在异源 作物物种中表达转基因的实用性。为了在作物中稳定表达草甘膦抗性 EPSPS，在农杆菌双元植物转化构建物中制备包含由本发明拟南芥属 肌动蛋白1a(pMON54952)、肌动蛋白1b(pMON54953)、肌动蛋白3 (pMON54954)、肌动蛋白7(pMON54955)和肌动蛋白12(pMON54956) 启动子驱动的aroA：CP4EPSPS的构建物。将这些构建物转化进大豆和 棉花细胞，在含草甘膦的组织培养培养基上选择所述细胞并再生成植 株，然后分析aroA：CP4蛋白的表达以及对施用草甘膦的耐性。进一步 通过常规育种方法将草甘膦耐性性状转移进适于栽培的种质中，产生 显示商业上可接受的草甘膦耐性的植株。
表6.在瞬时测定中，不同拟南芥属肌动蛋白启动子与P-e35S相比的 活性
构建物 GUS活性
Pe35S/GUS +++
P-AtAct1a/GUS ++
P-AtAct1b/GUS ++
P-AtAct3/GUS ++
P-AtAct7/GUS ++
P-AtAct12/GUS +
实施例14
棉花产量与结蕾头4到5周内所结棉蕾的数目相关。这些棉蕾保 持到成熟的棉铃以及它们对皮棉收成的贡献是产量的关键因素。当测 定转基因构建物赋予棉花除草剂耐性的效力时，棉铃保留的量是效力 的量度，也是所需的性状。在温室条件下测定包含本发明启动子的转 基因棉花植株(表7)的棉铃保留。所述启动子指导赋予草甘膦耐性表型 的aroA：CP4编码序列的表达。通过农杆菌介导的方法或粒子枪方法转 化植物。所述粒子枪构建物包含一个额外的含有GUS的表达盒，所述 表达盒可用于组织化学定位来自本发明启动子的β-葡糖醛酸糖苷酶活 性。在含有草甘膦的培养基上再生转基因植物，然后在生根培养基使 植物生根。生根的小植株转移到盆栽土壤，并转移到生长室达到种子 硬化(hardening off)期。收集这些植株系的种子并种植。来自每个系的 十五个植株在4叶期以48盎司/英亩喷洒草甘膦。来自每个系的至少8 个存活的植株在8叶期再次以48盎司/英亩喷洒草甘膦。成熟时，计 数产生头五个棉铃的最初位置上棉铃的数目。喷洒草甘膦后保留的最 初位置棉铃数为3或更多的那些系(植株图≥3)用于进一步的研究。表 7显示了该研究获得的数据。作图系的数目指出第一次施用草甘膦喷 洒后存活的系的数目。商业标准是系1445(pMON17136)，该系含有驱 动CTP2-aroA：CP4基因/E9 3’表达的P-FMV启动子，该系在头5个棉 铃中保留了不到1个棉铃。构建物pCGN8099、pCGN9153、 pCGN8088、pCGN8068在棉花中提供了足够的生殖性草甘膦耐性，以 至于来自所述构建物14-35％检测的系进一步进行后面的农学试验。
表7.温室棉铃保留研究
实施例15
棉花产量与结蕾头4到5周内所结棉蕾的数目相关。这些棉蕾保 持到成熟的棉铃以及它们对皮棉收成的贡献是产量的关键因素。当测 定转基因构建物赋予棉花除草剂耐性的效力时，棉铃保留的量是效力 的量度，也是所需的性状。在两个地点，在田间条件下测定包含本发 明启动子的转基因棉花植株的棉铃保留。将转基因棉花系502-254-2 (pCGN8068)、701-178-2(pCGN8068)、53-2(pCGN8088)、178-1 (pCGN9153)和60-1(pCGN9153)与1445(草甘膦耐受系)和包含构建物 pMON17136(P-FMV/CTP2-aroA：CP4/E93’)相比较，另外还包括一个野 生型非转基因系Coker 130。田间设计是包括2行x 20-30英尺x 3个 重复的随机完全区组设计。在棉花植株发育的8叶期以1.12磅ai/A＝48 盎司产物和1.5磅ai/A＝64盎司产物的比率施用作为Roundup UltraTM制剂的草甘膦。积极管理所有棉花小区的杂草防除和害虫防制以及其 它农学因素，例如种植时间、施肥、灌溉、PGR应用和脱叶。棉铃保 留百分率如下确定：随机选择每个小区中间两行中间的十个植株(每行 五株)进行作图，绘制每个保留的棉铃的位置。应该在第一次开花后4 周进行第一次作图(生长中期图)，收获时进行第二次作图。收集的数 据包括底部五个花节最初位置棉铃的数目，该数目指示转基因棉花系 对草甘膦的生殖性耐性。表8说明了本发明启动子的好处：它们使得 转基因棉花植株能够保留棉铃。该增强的生殖性耐性导致皮棉产量增 加(表9)和种子产量增加(表10)。
表8.底部5个最初位置棉铃在生长中期植株作图时的棉铃保留
表9.皮棉产量(磅/英亩)和产量百分率(位置1)
表10.种子产量(磅/英亩)和产量百分率(位置1)
实施例16
在转基因拟南芥中比较驱动CTP2-aroA：CP4编码序列表达的杂种 启动子P-eFMV-AtEF1α(图13，pMON52059)和P-FMV/CTP2- aroA：CP4/E93’(pMON15737)的效力。通过真空渗入产生转基因拟南芥 植株(Bechtold等，C R Acad Paris Life Sci 316：1194-1199)，种子盆栽在 土壤中，置于调整到24℃、16小时光(120μEm-2s-1)周期的生长室内以 允许植株的正常生长和发育。通过以24盎司/英亩的比率喷洒施用草 甘膦除草剂，选择pMON52059V1事件草甘膦耐性转基因拟南芥属植 株，将存活的植株移植到单个的盆中。在约16天后，对应于抽苔的观 察时，以24盎司/英亩的比率第二次喷洒8个pMON52059V1植株和 8个pMON15737纯合植株。所述第二次喷洒将确定所述两种构建物赋 予生殖性耐性的效力。观察植株对施用草甘膦的营养性效应。所有植 株都有完全的营养性耐性，没有观察到不正常的花。然而，出现长角 果败育指示在败育的长角果中没有结种子。计数每个植株产生的长角 果总数以及包含种子的长角果(能育长角果)的总数，并制成表格。结 果显示于表9，该结果表明：杂种启动子构建物pMON52059获得的能 育长角果有89％，比pMON15737的8％改善10倍以上。能育结果结 构的数目与能够产生的种子数量相关，这对于产量与种子数量相关的 作物尤其重要。对于如棉花、大豆、canola、小麦和玉米等作物，对草 甘膦的生殖性耐性对于好的产量是绝对必要的。
表11.比较杂种启动子P-eFMV-EF1α(pMON52059)和P-FMV (pMON15737)赋予拟南芥属植株对草甘膦的生殖性耐性
实施例19
向日葵(Helianthus annuus L.)是用于油和食物的重要农业作物。将 本发明构建物pMON45325(图2)、pMON45332(图4)和pMON45331 (图3)转化进向日葵。已经报道了农杆菌介导的向日葵转化 (Schrammeijer等，Plant Cell Reports，9：55-60，1990；EP 0 486 234)。本 领域内技术人员已知的用转基因表达构建物转化植物的方法包括下胚 轴、顶端分生组织、原生质和其它向日葵组织。转基因向日葵系 SFB250-27包含pMON20999(P-FMV/CTP2-aroA：CP4/E93’)表达盒； SFB288-01、SFB295-09包含pMON45325(P-eFMV/CTP2- aroA：CP4/E93’：：P-AtAct11+内含子/CTP2-aroA：CP4/E93’)；SFB289-01 包含pMON45332(P-AtEF1α+内含子/CTP2-aroA：CP4/E93’：：P- eFMV/CTP2-aroA：CP4/E93’)；SFB303-08、SFB303-09、SFB303-11和 HA300B包含pMON45331(P-AtEF1α+内含子/CTP2-aroA：CP4/E9)。测 试这些系的草甘膦耐性，结果显示于表12。
向日葵对草甘膦的生殖性耐性可以作为正常头状花序百分率、正 常头状花序大小百分率和花粉产生的函数来测量。在V-4叶期和V-8 叶期，以0盎司/英亩、32盎司/英亩或64盎司/英亩的比率用草甘膦喷 洒这些植株。评价所述向日葵植株对草甘膦的营养性耐性。在植株发 育的V4期和V8期、在32盎司/英亩和64盎司/英亩的草甘膦喷洒水 平达到了营养性耐性。
评价草甘膦营养性耐性转基因向日葵系的头状花序数目、正常头 状花序百分率、正常头状花序大小百分率和正常脱落花粉百分率。在 一个地点的一个田间试验中评价这些性状。头状花序计数和花粉产生 的制表显示于表12。从本发明构建物选出的系显示更高的正常头状花 序百分率、一般更高的正常头状花序大小百分率和更好的花粉脱落。
表12.向日葵草甘膦抗性评价
实施例18
可以通过多种方法鉴定适当启动子调节所必需的顺式作用调节 元件。在一种方法中，进行缺失分析以去除所述启动子的多个区，然 后分析获得的启动子片段的启动子活性。假如截短的启动子的活性与 原始启动子片段相比发生改变，就认为该DNA片段对于启动子调节是 必需的。通过这种缺失分析，可以鉴定对于转录正调节或负调节必需 的小DNA区。也可以鉴定启动子序列基序，工程化新型启动子使其包 含这些顺式元件，以调节有效连接的可转录序列的表达。见例如美国 专利第5,223,419号，特此通过引用完整地结合到本文中，美国专利第 4,990,607号，特此通过引用完整地结合到本文中，美国专利第 5,097,025号，特此通过引用完整地结合到本文中。
另一种可采用的方法是寻找启动子间具有相似表达分布型的相 似序列。具有重叠活性模式的启动子可能具有共同的调节机制。可以 利用几种计算机程序鉴定启动子间保守的序列基序，所述计算机程序 包括但不限于MEME、SIGNAL SCAN或GENE SCAN。这些基序可 能代表调节启动子的转录因子的结合位点。一旦鉴定了所述序列基 序，就可以测定它们的功能。例如，可以从启动子中缺失所述基序序 列以确定所述基序对于正常启动子功能是否是必需的。或者，可以将 所述基序添加到最小启动子上，以测试它是否足以激活转录。可以如 下测试怀疑的负调节元件的充分性；将其添加到活性启动子中，检测 启动子活性的降低。一些顺式作用调节元件可能需要其它元件以发挥 功能。因此，可以通过本领域内技术人员已知的任何方法，以不同组 合测试多种元件。
一旦已经鉴定了有功能的启动子元件，就可以在核苷酸水平上修 饰启动子元件以影响蛋白结合。所述修饰可能导致更高或更低的亲和 性结合，这将影响从该启动子开始的转录水平。
启动子元件可以加性作用或协同作用影响启动子活性。在这点 上，可以串联排列来自不同5’调节区的启动子元件，获得具有不同活 性范围或不同表达分布型的启动子。因此，来自异源来源的启动子元 件组合或者相似元件或相同元件的重复可能赋予有效连接的可转录序 列的更高水平表达。例如，可以形成一种启动子元件的多聚体，以增 加由该启动子元件所实现模式的特异性表达的水平。
构建包含新型工程化5’调节元件的表达构建物所需的技术方法是 本领域内技术人员已知的。在表达构建物中测试所述工程化启动子， 并通过有效连接所述新型启动子到合适的报道基因如GUS然后在瞬 时植物测定中测试，瞬时测试所述启动子。将所述新型启动子有效连 接到一个或多个目的基因，并与一个或多个其它调节元件掺入植物转 化构建物，然后通过合适的DNA传递系统转化进目标植物。通过适于 评价所需特征的多种分子方法、免疫诊断学方法、生物化学方法、表 型方法或田间方法，评价稳定转化的植株及其后代。
在举例说明并描述本发明的原理后，本领域内的技术人员应当清 楚可以在安排和细节上改变本发明而不偏离这些原则。我们要求保护 在所附权利要求的精神和范围内的改变。
本说明书中引用的所有出版物和公开专利文件都特此通过引用 结合到本文中，其程度等同于具体并分别指出各个出版物或专利中请 通过引用结合到本文中。