人体血清凝血因子Ⅷ中的病毒过滤方法.pdf

本发明公开一种能使人血浆来源的凝血因子Ⅷ溶液快速流通过纳滤材料的方法，在浓度为10—100IU/ml，pH为6.0—8.0的人体血清凝血因子Ⅷ水溶液中添加浓度为50—500mmol/L的医学上可接受的水溶性二价金属盐，溶液通过10—35纳米孔径的过滤器除去病毒，实现纳滤方法除去病毒的工业应用，通过透析除去加入的金属盐，可恢复凝血因子Ⅷ的天然结构。过滤过程凝血因子Ⅷ效价的衰减低于10%，优选情况下，凝血因子Ⅷ效价的衰减低于6%，明显优于通用S/D和干热灭活法。

1.  人体血清凝血因子Ⅷ中的病毒过滤方法，其特征在于，在浓度为10—100IU/ml，pH为6.0—8.0的人体血清凝血因子Ⅷ水溶液中添加浓度为50—500mmol/L的医学上可接受的水溶性二价金属盐，溶液通过10—35纳米孔径的过滤器除去病毒。

2.  根据权利要求1所述病毒过滤方法，其特征在于，所述水溶性二价金属盐为水溶性钙盐或锌盐。

3.  根据权利要求2所述病毒过滤方法，其特征在于，所述水溶性钙盐为氯化钙、醋酸钙、柠檬酸钙、草酸钙、酒石酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙。

4.  根据权利要求2所述病毒过滤方法，其特征在于，所述水溶性锌盐为氯化锌、醋酸锌、柠檬酸锌、草酸锌、酒石酸锌、葡萄糖酸锌或乳酸锌。

5.  根据权利要求2所述病毒过滤方法，其特征在于，所述水溶性钙盐或锌盐浓度为200—400mmol/L。

6.  根据权利要求1所述病毒过滤方法，其特征在于，所述人体血清凝血因子Ⅷ水溶液中，人体血清凝血因子Ⅷ的效价为20—70IU/ml。

7.  根据权利要求1所述病毒过滤方法，其特征在于，所述溶液中加入氨基酸，浓度为50—500mmol/L。

8.  根据权利要求1所述病毒过滤方法，其特征在于，所述氨基酸为L-精氨酸或其盐酸盐、L-组氨酸或其盐酸盐、L-赖氨酸或其盐酸盐的一种或以上。

9.  根据权利要求7或8所述病毒过滤方法，其特征在于，所述氨基酸含量为200—500mmol/L。

人体血清凝血因子Ⅷ中的病毒过滤方法
技术领域
本发明涉及医用血制品制造方法，具体是采用纳米孔径的过滤材料过滤除去人体血清凝血因子Ⅷ中的病毒的方法。
背景技术
人体血清凝血因子Ⅷ（FⅧ）是指从人血浆中提取获得的血液制品，临床上主要用于凝血因子Ⅷ缺乏所致的凝血障碍纠正，主要是甲型血友病的治疗。为确保产品的临床使用安全，产品生产过程必须进行病毒去除/灭活步骤，主要的血源性病毒包括脂包膜病毒例如乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒，艾滋病毒和人类T细胞白血病病毒（HTLV-I）；无包膜病毒，如肝炎病毒（HAV）以及细小病毒B19和TSE朊病毒导致变异型克雅氏病（vCJD）。
制造工艺必须平衡安全需求（病毒去除和/或灭活的需要）和提供高收率，合理的成本和有效的高纯度的最终产品，现在使用的领先病毒灭活/去除技术是巴氏灭菌法，干热处理，S/D处理和纳米过滤，在凝血因子Ⅷ制品上，则通用S/D和干热灭活法，但S/D法和干热灭活法会导致凝血因子Ⅷ效价衰减12—15%,甚至更高。
纳米过滤，也称为“病毒过滤”，是基于使用的膜具有多层微孔结构，可以通过尺寸排阻清除病毒。该技术条件温和并有效分离蛋白和病毒，包括包膜和无包膜病毒，可用于脆弱的凝血因子Ⅷ并保持完好的FⅧ天然结构。用10—35纳米的过滤器能有效去除非脂包膜细小病毒，如：HAV/猪细小病毒（PPV，一个耐受的病毒模型）/TSE(分子大小约18-35nm)。而凝血因子Ⅷ分子较大，被认为不能有效的穿过10-35nm的过滤器，而更大空隙的过滤器（例如≥35nm）又不能有效去除HAV、B19和TSE。
采用10—50nm的过滤器将凝血因子Ⅷ溶液进行病毒过滤时，过滤速度非常缓慢，且容易造成过滤器堵塞，使整个过滤中断，而且过滤器的有效过滤载量非常小，达不到5L/m²。过滤速度小于1L/m²·h，因此对于凝血因子Ⅷ而言，工业上没有采用过滤方法除去病毒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能使人血浆来源的人体血清凝血因子Ⅷ溶液快速流通过纳滤材料的方法，由此实现采用纳滤方法除去病毒的工业应用。
本发明在浓度为10—100IU/ml，pH为6.0—8.0的人体血清凝血因子Ⅷ水溶液中添加浓度为50—500mmol/L的医学上可接受的水溶性二价金属盐，溶液通过10—35纳米孔径的过滤器除去病毒。
本发明中，水溶性二价金属盐可以是钙盐、锌盐、亚锡盐、铜盐、二价锰盐等，优选是水溶性钙盐或锌盐。水溶性钙盐包括氯化钙、醋酸钙、柠檬酸钙、草酸钙、酒石酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙，优选是氯化钙。水溶性锌盐包括氯化锌、硫酸锌、醋酸锌、柠檬酸锌、草酸锌、酒石酸锌、葡萄糖酸锌或乳酸锌，优选是氯化锌或硫酸锌。
钙离子或锌离子浓度优选为200—400mmol/L。
溶液中还可加入氨基酸，其浓度为50—500mmol/L，优选200—500mmol/L。氨基酸优选为L-精氨酸、L-组氨酸或L-赖氨酸的一种或以上。
人体血清凝血因子Ⅷ水溶液中，人体血清凝血因子Ⅷ效价优选为20—70IU/ml。
本发明通过二价金属盐的极性吸附等作用，降低了凝血因子Ⅷ的粒径，可使凝血因子Ⅷ顺利通过10—35nm孔径的过滤器进行病毒过滤，过滤器载量高于15L/m²，过滤速度可超过6L/m²·h，实现纳滤方法除去病毒的工业应用，通过透析可除去加入的金属盐，可恢复凝血因子Ⅷ的天然结构。过滤过程凝血因子Ⅷ效价的衰减低于10%，优选情况下，凝血因子Ⅷ效价的衰减低于6%，明显优于通用S/D和干热灭活法。
具体实施方式
实施例1：不同钙离子浓度的过滤速度
人体血清凝血因子Ⅷ的制备方法：血浆离心分离后获得冷沉淀，经氢氧化铝吸附或PEG处理后，经S/D病毒灭活后，层析，洗脱获得含凝血因子Ⅷ的蛋白质水溶液。
人体血清凝血因子Ⅷ溶液按下表所列浓度配制，调节pH至6.95，先测定凝血因子Ⅷ溶液的效价，在室温，操作压力差2.5bar下，依次通过200nm、50nm和20nm的过滤器串联过滤，对配制后的凝血因子Ⅷ溶液进行病毒过滤，测出过滤速度和过滤后凝血因子Ⅷ效价见下表：

表中看到，钙离子浓度在200—400mmol/L效果最佳，过滤速度为未添加钙离子溶液的4—6倍，通过测定过滤后凝血因子Ⅷ效价可看到凝血因子Ⅷ可完全通过20nm的过滤器，过滤过程效价衰减少于8%。
实施例2：不同凝血因子Ⅷ浓度的过滤速度
人体血清凝血因子Ⅷ制备方法：依照实施例1进行。
人体血清凝血因子Ⅷ溶液中添加L-盐酸组氨酸250mmol/L，添加氯化钙250mmol/L，调节pH至6.89，按梯度稀释凝血因子Ⅷ溶液效价约为10—100IU/ml，在室温，操作压力差2.5bar下，依次通过200nm、50nm和20nm的过滤器，对进行配制后的凝血因子Ⅷ溶液进行病毒过滤，测出过滤速度和过滤后凝血因子Ⅷ效价见下表：

表中看到，凝血因子Ⅷ的浓度在20—70IU/ml时过滤效率较高，凝血因子Ⅷ效价衰减小于6%，浓度低于20IU/ml时溶液过滤速度虽然较快，但凝血因子Ⅷ效价衰减大于10%，浓度高于70IU/ml时凝血因子Ⅷ效价衰减也大于10%。
实施例3：不同氨基酸浓度的过滤速度
人体血清凝血因子Ⅷ制备方法：依照实施例1进行。
人体血清凝血因子Ⅷ溶液通过超滤配制，添加氯化钙250mmol/L，调节pH至6.95，使最终凝血因子Ⅷ溶液效价约为50—60IU/ml，按梯度添加L-盐酸精氨酸，梯度范围为50—400mmol/L，在室温，操作压力差2.5bar下进行采用200nm、50nm和15nm的过滤器串联，对配制后的凝血因子Ⅷ溶液进行病毒过滤，测出过滤速度和过滤后凝血因子Ⅷ效价见下表：

表中看到，添加氨基酸可一定程度提高过滤速度，氨基酸浓度在200mmol/L以上时过滤速度较佳。
实施例4：不同锌离子浓度的过滤速度
人体血清凝血因子Ⅷ制备方法：依照实施例1进行。
人体血清凝血因子Ⅷ溶液通过超滤配制，添加L-盐酸精氨酸200mmol/L，调节pH至6.95，使最终凝血因子Ⅷ溶液效价约为30—35IU/ml，按梯度添加氯化锌，梯度范围为200—400mmol/L，在室温下，操作压力差2.5bar，采用100nm和20nm的过滤器串联，对配制后的凝血因子Ⅷ溶液进行病毒过滤，过滤后通过透析降低氯化钙浓度，其代表性结果列于下表：

表中看到，锌离子浓度在300—400mmol/L效果最佳，过滤速度约为未添加锌离子溶液的3倍。