一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒及其检测方法.pdf

本发明公开了一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒及其检测方法，属于水体污染检测领域。一种检测水体中鸡粪污染的巢式PCR试剂盒，包括两对巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg2+溶液和ddH2O，该巢式PCR方法使用两轮PCR扩增，检测方法如下：提取水样DNA，以其为模板进行第一轮PCR扩增，引物为SCF、SCR，反应结束后，以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，引物为NCF、NCR，结束后，琼脂糖凝胶电泳检测403bp条带存在表明水体收受到鸡粪污染。该方法通过巢式PCR扩增，大大增加了检测的灵敏度，可以检测到水中存在的微量鸡粪污染，并且具有良好的特异性，可直接应用于水体粪便污染检测及防治工作中。

1.  一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒，包括两对巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg²⁺溶液和ddH₂O，其特征在于：所述的两对巢式PCR引物为：
SCF:5’‐CACATGTTATCTGCACCAGC‐3’
SCR:5’‐GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG‐3’
NCF:5’‐CCAAATCCATCTTAGCCTCAAC‐3’
NCR:5’‐GGCGGGTTTCACATCCTT‐3’。

2.  根据权利要求1所述的检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR buffer为10×PCR buffer，所述dNTP浓度为各2.5mmol/L，所述Taq酶浓度为5U/ul，所述Mg²⁺溶液浓度为25mmol/L。

3.  使用如权利要求1或2所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸡粪污染的方法，其步骤为：
(1)取待测水样提取DNA；
(2)以水样DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，PCR引物为SCF和SCR；
(3)第一轮PCR扩增结束后，取PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR引物为NCF和NCR；
(4)凝胶电泳，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为403bp的条带，若存在，则表明水体受到了鸡粪污染。

4.  根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸡粪污染的方法，其特征在于，步骤(2)中第一轮PCR引物为SCF和SCR，反应体系为2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；0.1ul Taq酶；2ul Mg²⁺；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SCF、SCR；2ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存。

5.  根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸡粪污染的方法，其特征在于，步骤(3)中第二轮PCR引物为NCF和NCR，反应体系为2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；0.1ul Taq酶；2ul Mg²⁺；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物NCF、NCR；0.5ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃30s，40个循环；72℃7min，4℃保存。

6.  根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸡粪污染的方法，其特征在于，步骤(4)中凝胶电泳为1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min。

7.  根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其特征在于：步骤(4)中检测阈值为0.0021ng/ul鸡粪DNA。

8.  根据权利要求3所述的巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其特征在于：步骤(2)后对第一轮PCR产物进行凝胶电泳，若存在长度为783bp的条带，则表明水体受到了较严重的鸡粪污染，检测阈值为0.034ng/ul鸡粪DNA，无需进行步骤(3)和步骤(4)。

一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及水体污染检测领域，更具体地说，涉及一种检测粪便污染水体中鸡粪污染的巢式PCR试剂盒及其检测方法。
背景技术
近年来，我国水体污染日趋严重，威胁着人们的生存环境和健康用水，并对社会造成了严重的经济损失。太湖流域畜禽养殖业发达，养殖业废水是造成太湖流域水体污染的主要来源之一。粪便污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成富营养化，并且会带入粪便中可能存在的致病菌，引发疾病的水体传播(Baldursson,S.and Karanis,P.(2011)Waterborne transmission of protozoan parasites:Review of worldwide outbreaks‐An update 2004‐2010.Water Research 45(20),6603‐6614.)。进行水体污染的控制和治理已经刻不容缓。
粪便污染的潜在污染源种类繁多，呈现点、面源结合的特征，缺乏对粪便污染来源的准确掌握和定位，使得治理工作只停留在“见污治污”阶段，在一定程度上增加了污染治理的成本。如何寻找和区分水体中粪便污染主要来源，从而快速、准确地确定污染源，成为了解决问题的关键。传统方法通过检测水中粪便污染指示菌(如大肠杆菌、肠球菌等)来判断水体粪便污染情况，耗时长且无法区分污染源。通过检测水体宿主特异性微生物或化学标志物，可以达到粪便污染溯源的目的，但现存的一些微生物及化学标志物特异性不高，往往导致假阳性结果的产生。2000年，Pierre等最先证实粪便中的线粒体DNA(mtDNA)具有其种属特异性，并且动物粪便中含有较高丰度的mtDNA，通过PCR手段能够检测到明显的mtDNA信号，因此提出了“水体粪便污染的mtDNA溯源方法”(Caldwell,J.,Payment,P.and Villemur,R.(2011)Mitochondrial DNA as Source Tracking Markers of Fecal Contamination.)。
以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为水体粪便污染的检测提供了强有力的工具。通过特异性引物PCR扩增水体中的目标线粒体DNA片段，即可检测样品是否受到潜在的粪便污染，用时短且准确度高。另外通过设计特异性的巢式PCR引物进行二次扩增，极大的提高了方法的灵敏度，能够检测到水体中的微量粪便污染。
目前国内对水体粪便污染溯源公开文献较少，国外针对鸡粪污染溯源主要集中在宿主特异性微生物溯源法上，但微生物溯源法常常会出现特异性不高的现象(Kobayashi,A.,Sano,D.,Hatori,J.,Ishii,S.and Okabe,S.(2013)Chicken‐and duck‐associated Bacteroides‐Prevotella genetic  markers for detecting fecal contamination in environmental water.Applied Microbiology and Biotechnology 97(16),7427‐7437.)，相比之下，线粒体DNA溯源法具有更好的特异性。目前尚未公开基于鸡mtDNA设计的特异性巢式PCR引物及检测方法，此方法进行鸡粪污染溯源，具有较高的特异性，且相比之前报道的巢式PCR方法具有更高的灵敏度(Kortbaoui,R.,Locas,A.,Imbeau,M.,Payment,P.and Villemur,R.(2009)Universal mitochondrial PCR combined with species‐specific dot‐blot assay as a source‐tracking method of human,bovine,chicken,ovine,and porcine in fecal‐contaminated surface water.Water Res 43(7),2002‐2010.)。
发明内容
1、要解决的技术问题
针对传统检测粪便污染的方法无法溯源的技术问题，本发明提供了一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR检测方法及试剂盒，可以实现快速、准确地检测水体微量鸡粪污染。
2、技术方案
本发明的目的通过以下技术方法实现：
一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒，包括两对巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg²⁺和ddH₂O，两对巢式PCR引物为：
SCF:5’‐CACATGTTATCTGCACCAGC‐3’
SCR:5’‐GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG‐3’
NCF:5’‐CCAAATCCATCTTAGCCTCAAC‐3’
NCR:5’‐GGCGGGTTTCACATCCTT‐3’。
具体地，所述PCR buffer为10×PCR buffer，dNTP浓度为各2.5mmol/L，Taq酶浓度为5U/ul，Mg²⁺溶液浓度为25mmol/L。
采用上述巢式PCR试剂盒检测水体鸡粪污染的方法，其步骤为：
(1)取待测水样提取DNA；
(2)以水样DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，PCR引物为SCF和SCR；
(3)第一轮PCR扩增结束后，取PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR引物为NCF和NCR；
(4)凝胶电泳，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为403bp的条带，若存在，则表明水体受到了鸡粪污染。
进一步，利用巢式PCR试剂盒检测水体鸡粪污染的方法，其具体步骤为：
(1)采集待测水样，提取水样DNA；
(2)以水样DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，反应体系为2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；0.1ul Taq酶；2ul Mg²⁺；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SCF、SCR；2ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存。
(3)第一轮PCR扩增结束后，取0.5ul PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，反应体系为2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；0.1ul Taq酶；2ul Mg²⁺；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物NCF、NCR；0.5ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃30s，40个循环；72℃7min，4℃保存。
(4)对第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为403的条带，若存在，则表明水体受到了鸡粪污染。利用本发明进行水体鸡粪污染检测的检测限为0.0021ng/ul鸡粪DNA。具体的，步骤(4)中凝胶电泳为1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min。
上述利用巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法中，步骤(2)完成后对第一轮PCR产物进行凝胶电泳，若存在长度为783bp的条带，则表明水体受到了较严重的鸡粪污染，检测阈值为0.034ng/ul鸡粪DNA，无需进行步骤(3)和步骤(4)。
3、有益效果
相比现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明选取的鸡粪污染标志物为鸡线粒体DNA，使得检测方法具有良好的特异性，减低了对检测样品的误判；
(2)本发明采用巢式PCR方法检测水体鸡粪污染，通过两次PCR扩增使得检测方法具有较高的灵敏度，能够检测到水体中的微量鸡粪污染，在粪便污染防控预警方面具有很高的应用价值。
附图说明
图1：巢式PCR方法的特异性检测电泳结果图：图1(A)为第一轮PCR扩增特异性检测电泳结果图；图1(B)为第二轮PCR扩增特异性检测电泳结果图。
图2：巢式PCR方法的第一轮PCR检测限确定电泳结果图。
图3：巢式PCR方法的第二轮PCR检测限确定电泳结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。
实施例1：
一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒，包括两对巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg²⁺和ddH₂O，两对巢式PCR引物为：
SCF:5’‐CACATGTTATCTGCACCAGC‐3’
SCR:5’‐GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG‐3’
NCF:5’‐CCAAATCCATCTTAGCCTCAAC‐3’
NCR:5’‐GGCGGGTTTCACATCCTT‐3’。
上述两对巢式PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司定制合成得到。
上述ddH₂O为灭菌双蒸水。Taq酶浓度为5U/ul。Mg²⁺溶液的浓度为25mmol/L，为MgCl₂溶液。dNTP的浓度为2.5mmol/L。PCR buffer为10×PCR缓冲液(购买于Takara，Code No.RR001A)
采集新鲜的鸡、人、猪、牛、羊、鸭、鹅、鼠粪便，分别将取0.2克粪便提取DNA，以其为模板进行第一轮PCR扩增，反应体系为2.5ul的10×PCR缓冲液(PCR buffer,Takara)；2.5ul脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)；0.1ul Taq酶；2ul的25mmol/L Mg²⁺溶液；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SCF、SCR；2ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存。
再以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，反应体系为2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；0.1ul Taq酶；2ul Mg²⁺；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物NCF、NCR；0.5ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃30s，40个循环；72℃7min，4℃保存。
对第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，电泳结果如图1(B)所示，图中只有鸡粪样品中出现长度为403bp的条带，其他粪便样品和阴性对照中均无条带，表明本发明中巢式PCR试剂盒能够检测水体鸡粪污染，且具有良好的特异性，不会出现误判或假阳性结果。
为了进一步验证该试剂盒的特异性，对第一轮PCR扩增进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，电泳结果如图1(A)所示，图中同样只有鸡粪样品中出现长度为783bp的条带，其他粪便样品和阴性对照中均无该长度条带，表明如果待测样品的粪便污染较严重，第一次PCR产物也能用来检测鸡粪污染。
实施例2：
取0.2克鸡粪提取DNA，测得DNA浓度为35.0ng/ul，将DNA溶液用四倍稀释法对其进行梯度稀释，得到稀释倍数分别为1/4、1/4²、1/4³、1/4⁴、1/4⁵、1/4⁶、1/4⁷的鸡粪DNA溶液，分别取各浓度的DNA溶液为模板进行第一轮PCR扩增，反应体系为2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；0.1ul Taq酶；2ul的25mmol/L Mg²⁺溶液；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SCF、SCR；2ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存。
对第一轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，电泳结果如图2所示，当鸡粪DNA溶液稀释1024倍时的PCR产物仍能检测到783bp长度的条带，当稀释倍数大于1024倍时则检测不到，此时对应的DNA浓度为0.034ng/ul。
再以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，反应体系为2.5ul的10×PCR buffer；2.5ul dNTP；0.1ul Taq酶；2ul Mg²⁺；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物NCF、NCR；0.5ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至25ul；反应条件为95℃，预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃30s，40个循环；72℃7min，4℃保存。
对第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，电泳结果如图3所示，当鸡粪DNA溶液稀释到4⁷倍时的PCR产物仍能检测到403bp长度的条带，当稀释倍数大于4⁷时则检测不到，此时对应的DNA浓度为0.0021ng/ul。