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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410510867.1 (22)申请日 2014.09.29 C07D 239/49(2006.01) C07K 14/765(2006.01) C07K 14/77(2006.01) C07K 14/795(2006.01) C07K 1/107(2006.01) C07K 16/44(2006.01) G01N 33/543(2006.01) (71)申请人江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800号江南大学食品学院 (72)发明人匡华 徐乃丰 胥传来 徐丽广 马伟 刘丽强 宋珊珊 吴晓玲 (74)专利代。
2、理机构无锡市大为专利商标事务所 (普通合伙) 32104 代理人时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一种甲氧苄啶半抗原化合物T1制备完全抗 原的方法和应用 (57) 摘要 一种甲氧苄啶半抗原化合物T1制备完全抗 原的方法和应用，属于生物化工技术领域。本发明 的甲氧苄啶半抗原化合物T1是利用嘧啶核一端 的氨基衍生出活性羧基，经过纯化得到单一特异 性结构的甲氧苄啶羧基衍生物（TMP-HS），该衍生 物为甲氧苄啶半抗原化合物T1，将该甲氧苄啶半 抗原化合物T1与载体蛋白偶联后形成甲氧苄啶 完全抗原T1-MA-BSA。本发明的抗原或抗体可用 于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速 检测法，从而用于。
3、快速检测食品中的甲氧苄啶残 留。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104370829 A (43)申请公布日 2015.02.25 CN 104370829 A 1/1页 2 1.一种甲氧苄啶半抗原化合物T1的制备方法，其特征在于： 甲氧苄啶半抗原化合物T1结构简式如下： 制备步骤为：在100mL的三颈瓶中依次加入 10mL吡啶、2g丁二酸酐、5mg 4-二甲氨基 吡啶，60水浴加热磁力搅拌至溶液澄清；另以 10mL 吡啶溶解2.9g甲氧苄啶并滴加到所 述三颈瓶中，继续搅拌反应3。
4、天；采用薄层色谱法，以甲醇三氯甲烷体积比为15作为 展开剂监控反应进程；减压蒸馏将溶剂全部蒸走，得到淡黄色油状物；继续滴加质量体积 比为10%的NaHCO 3 水溶液至不再产生浑浊，过滤并调节上清液在酸性条件下重结晶析出白 色固体，离心烘干即得产品甲氧苄啶半抗原化合物T1。 2.用权利要求1所述方法制得的甲氧苄啶半抗原化合物T1制备甲氧苄啶完全抗原的 方法，其特征在于：将甲氧苄啶半抗原化合物T1与载体蛋白偶联后制备得到甲氧苄啶完全 抗原。 3.根据权利要求2所述甲氧苄啶半抗原化合物T1制备甲氧苄啶完全抗原的方法，其特 征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA、匙孔血蓝蛋白K。
5、LH、血蓝蛋 白LPH或人血清白蛋白HAS中的一种。 4.根据权利要求3所述甲氧苄啶半抗原化合物T1制备甲氧苄啶完全抗原的方法，其特 征在于：当载体蛋白为BSA时，具体步骤为： （1）甲氧苄啶半抗原化合物T1的活化：将甲氧苄啶半抗原化合物T1用DMF溶解，按甲 氧苄啶半抗原化合物T1三正丁胺氯甲酸异丁酯的摩尔比为11.21.2比例添加 反应物，0反应1h，得到活化的甲氧苄啶半抗原化合物T1溶液； （2）载体蛋白BSA溶液的配制：取BSA，使甲氧苄啶半抗原化合物T1BSA的摩尔比为 1001，用 0.01M pH6.5的磷酸盐缓冲液溶解BSA，0预冷30min，其中溶解后的BSA浓度 大于3mg。
6、/mL，且磷酸盐缓冲液与DMF的体积比例为51，得到BSA溶液； （3）甲氧苄啶完全抗原的制备：在0条件下，将步骤（1）所得14.5mg/mL活化的甲氧 苄啶半抗原化合物T1溶液1mL，慢速滴加到步骤（2）所得22mg/mL BSA溶液3mL中，0条 件下反应2h，然后室温下反应12h；用PBS缓冲液透析3天，期间换水8次，即得到甲氧苄啶 完全抗原T1-MA-BSA。 5.用权利要求2或4所述方法制备的甲氧苄啶完全抗原的应用，其特征在于：通过甲 氧苄啶完全抗原免疫得到多克隆抗体和/或单克隆抗体，用于检测甲氧苄啶。 权 利 要 求 书CN 104370829 A 1/5页 3 一种甲氧苄啶半抗原。
7、化合物 T1 制备完全抗原的方法和应 用 技术领域 0001 本发明涉及一种甲氧苄啶半抗原化合物T1制备完全抗原的方法和应用，属于生 物化工技术领域。 背景技术 0002 三甲氧苄胺嘧啶（Trimethoprim，TMP），又名甲氧苄啶，和二甲氧苄胺嘧啶 （Diaveridine，DVD）都是一种二氨基嘧啶类的二氢叶酸还原酶抑制剂，白色结晶型粉末，不 溶于水，微溶于氯仿、乙醇、丙酮，但易溶于冰乙酸等有机酸。本身抗菌能力较弱，因此常不 单独使用，但与磺胺类、呋喃类、喹诺酮类等抗生素联合使用，可大幅度增强抗生素的应用 效果，可治疗鸡白痢、禽霍乱、细菌性感染等畜禽疾病。但抗生素和协同增效剂的过度使用。
8、 和不合理用药，使药物过量残留于动物性食物中，从而对人体健康造成危害。我国农业部 和欧盟、日本等都对TMP 在动物组织中的最大残留限量值（MRL）做出了规定，其中我国规 定 TMP 的标志性残留物是其本身，其在畜禽肌肉、肝肾、脂肪以及鱼肉、皮等组织中的MRL 值为 50g/kg，欧盟明确规定其不能用于蛋类，日本规定其在鱼类、鸡组织中的 MRL 值为 50g/kg。 0003 TMP和DVD的结构式如下： 目前我国对TMP的检测方法主要有气相色谱法（LC）、高效液相色谱法(HPLC)、液质联 用法（LC/MS）、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金试纸条法等，并且主要集中在HPLC和LC/ MS。
9、等仪器分析方法上。尽管仪器方法是TMP检测的确证方法，但存在样品制备复杂、操作繁 琐、对操作人员素质要求较高、样本前处理时间太长等缺点，导致检测成本高，周期长，无法 满足大批量样本的快速筛查及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分 析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于 大量样本的现场快速检测。 0004 免疫分析方法的关键在于合适的特异性抗原和抗体的获得。由于存在活性氨基基 团，传统的TMP人工抗原的合成一般通过EDC法、重氮化法直接与TMP分子上的氨基偶联， 再偶联载体蛋白。但由于TMP上有不止一个氨基，都能参与反应，因此得到的偶。
10、联物是一个 混合物，最终通过免疫动物得到的抗体是针对这种混合物的，抗体的特异性和灵敏度会受 说 明 书CN 104370829 A 2/5页 4 到很大影响。而且，由于TMP结构中氨基与嘧啶核直接相连，空间位阻显著将导致免疫效果 较差，所制备的抗体灵敏度不理想。 0005 本发明的甲氧苄啶半抗原是利用嘧啶核一端的氨基衍生出活性羧基，经过纯化得 到单一特异性结构的甲氧苄啶羧基衍生物（TMP-HS），该衍生物为甲氧苄啶半抗原，将甲氧 苄啶半抗原与载体蛋白偶联最后形成甲氧苄啶完全抗原。 发明内容 0006 本发明的目的是针对现有甲氧苄啶检测技术及抗原合成、相应抗体制备的不足和 缺陷，提供一种甲氧苄啶。
11、半抗原化合物T1制备甲氧苄啶完全抗原的方法和应用。 0007 本发明的技术方案，一种甲氧苄啶半抗原化合物T1的制备方法， 甲氧苄啶半抗原化合物T1结构简式如下： 制备步骤为：在100mL的三颈瓶中依次加入 10mL吡啶、2g丁二酸酐、5mg 4-二甲氨基 吡啶，60水浴加热磁力搅拌至溶液澄清；以 10mL 吡啶溶解2.9g甲氧苄啶并滴加到所述 三颈瓶中，继续搅拌反应3天；采用薄层色谱法，以甲醇三氯甲烷体积比为15作为展 开剂监控反应进程；减压0.090MPa、50蒸馏10min将溶剂全部蒸走，得到淡黄色油状物； 继续滴加质量体积比为10%的NaHCO 3 水溶液至不再产生浑浊，过滤并调节上清液。
12、在pH5.0 酸性条件下重结晶析出白色固体，6000 r/min离心10min，滤饼50烘干即得产品甲氧苄 啶半抗原化合物T1。 0008 用所述甲氧苄啶半抗原化合物T1制备甲氧苄啶完全抗原的方法，将甲氧苄啶半 抗原化合物T1与载体蛋白偶联后制备得到甲氧苄啶完全抗原。 0009 所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋 白LPH或人血清白蛋白HAS中的一种。 0010 当载体蛋白为BSA时，具体步骤为： （1）甲氧苄啶半抗原化合物T1的活化：将甲氧苄啶半抗原化合物T1用DMF溶解，按甲 氧苄啶半抗原化合物T1三正丁胺氯甲酸异丁酯的摩尔比为11.21.2比。
13、例添加 反应物，0反应1h，得到活化的甲氧苄啶半抗原化合物T1溶液； （2）载体蛋白BSA溶液的配制：取BSA，使甲氧苄啶半抗原化合物T1BSA的摩尔比为 1001，用 0.01M pH6.5的磷酸盐缓冲液溶解BSA，0预冷30 min，其中溶解后的BSA浓 度大于3mg/mL，且磷酸盐缓冲液与DMF的体积比例为51，得到BSA溶液； （3）甲氧苄啶完全抗原的制备：在0条件下，将步骤（1）所得14.5mg/mL活化的甲氧 苄啶半抗原化合物T1溶液1mL，慢速滴加到步骤（2）所得22mg/mL BSA溶液3mL中，0条 件下反应2h，然后室温下反应12h；用PBS缓冲液透析3天，期间换水8次，即。
14、得到甲氧苄啶 完全抗原T1-MA-BSA。 说 明 书CN 104370829 A 3/5页 5 0011 制备的甲氧苄啶完全抗原的应用：通过甲氧苄啶完全抗原免疫得到多克隆抗体和 /或单克隆抗体，用于检测甲氧苄啶。 0012 本发明的有益效果：本发明提供了一种新的甲氧苄啶完全抗原合成方法，其甲氧 苄啶完全抗原呈现出的特异性的甲氧苄啶抗原决定簇，使得筛选出高特异性的甲氧苄啶单 克隆抗体成为可能。 0013 实验结果表明，用本发明的甲氧苄啶完全抗原免疫动物得到的抗血清效价可达 27000，半数抑制浓度为2.05ng/mL，检测限为0.47ng/mL，各类似物的交叉反应率均小于 5%。产生的抗体特异。
15、性高、灵敏度极高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分 析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的甲氧苄啶残留。 附图说明 0014 图1是甲氧苄啶完全抗原合成紫外鉴定路线图。 0015 图2是甲氧苄啶小鼠抗血清抑制率检测示意图。 具体实施方式 0016 下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 0017 下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0018 实施例1 甲氧苄啶半抗原T1的制备 100mL 三颈瓶中依次加入 10mL吡啶、2g丁二酸酐、5mg 4-二甲氨基吡啶，60水浴加 热磁力搅拌至溶液澄清。再以 10mL 吡啶溶。
16、解2.9g 甲氧苄啶并滴加到三颈瓶中，继续搅 拌反应3天。薄层色谱法以甲醇三氯甲烷体积比15作为展开剂监控反应进程。减 压0.090MPa、50蒸馏10min将溶剂全部蒸走，得到淡黄色油状物。滴加质量体积比10% NaHCO 3 溶液至不再产生浑浊，过滤并调节上清液在pH5.0酸性条件下重结晶析出白色固体， 6000 r/min离心10min，滤饼50烘干即为甲氧苄啶半抗原T1。 0019 实施例2 甲氧苄啶完全抗原的制备 取8mg甲氧苄啶半抗原T1，用1mL DMF溶解，与三正丁胺、氯甲酸异丁酯（T1三正丁 胺氯甲酸异丁酯的摩尔比为11.21.2）0反应1h，得活化的甲氧苄啶半抗原化合 物T。
17、1溶液。取BSA/OVA（半抗原T1与BSA，OVA的摩尔比均为1001），用 0.01M pH6.5 磷酸盐缓冲液溶解，0预冷30min，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，且磷酸盐缓冲液 与DMF的体积比例为51，得蛋白溶液。在0条件下，将活化的半抗原T1溶液慢速滴加 到蛋白溶液中，0条件下反应2h，然后室温下反应12h。用PBS缓冲液透析3天，期间换水 8次，即得到甲氧苄啶完全抗原（T1-MA-BSA及T1-MA-OVA）。 0020 实施例3 甲氧苄啶抗血清的制备 以实施例2制得的抗原（T1-MA-BSA）为免疫原，选用8周龄雌性BALB/C小鼠为免疫动 物，采用弗氏佐剂进行免疫，免。
18、疫小鼠5只。弗氏佐剂免疫方法为：首免取适量免疫原与等 体积弗氏完全佐剂混合，加强免疫首免取适量免疫原与等体积弗氏不完全佐剂混合，乳化 好后经颈背部皮下多点注射免疫，每间隔3周加强免疫一次。 0021 实施例4 甲氧苄啶抗血清的测定 采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下： 说 明 书CN 104370829 A 4/5页 6 （1）包被：将实施例2中的抗原（T1-MA-OVA）用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从10g/mL 开始倍比稀释，加入酶标板孔中100L/孔，37反应2h； （2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min； （3）封闭：拍干后，加入。
19、200L/孔封闭液，37反应2h。洗涤后烘干备用； （4）加样：将抗血清从11000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100L/ 孔，37反应1h；充分洗涤后，加入13000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100L/孔，37反应 1h； （5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100L的TMB显色液（TMB与底物液比 例1:5），37避光反应15min； （6）终止和测定：每孔加入100L终止液（2mol/L的硫酸）以终止反应，然后用酶标仪 测定各孔的OD 450 值； （7）结果判读：以OD 450 值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N2.1）所对应的血 清最高稀释倍数即为血。
20、清的ELISA效价。 0022 最低检测限、半数抑制以及特异性的检测 具体操作步骤如下： （1）用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD 450 值在1.5 左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度； （2）包被：将包被原（T1-MA-OVA）用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100L/孔，37 反应2h； （3）洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法； （4）配制甲氧苄啶标准溶液：将甲氧苄啶标准品用0.01mol/L、pH7.4的PBS溶液配制成 1mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L、pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度； （5）加样：。
21、每孔加入50L倍比稀释的甲氧苄啶各浓度标准品，然后再加入50L/孔最适 稀释倍数的抗血清，37反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100L/ 孔，37反应1h； （6）显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100L的TMB显色液，37避光反 应15min； （7）终止和测定：每孔加入100L终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450 值； （8）数据处理：以甲氧苄啶各浓度的对数为横坐标，以甲氧苄啶各浓度对应的OD值B 与甲氧苄啶浓度为零时的OD值B 0 的比值B/B 0 为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度 （IC 50 ，即OD 450 值从。
22、零标准溶液对应的A 0 下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血 清对甲氧苄啶是否具有特异性； （9）将甲氧苄啶的标准品换成二甲氧苄啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、 磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、庆大霉素、林可霉素、呋喃唑酮、呋喃西林、诺氟沙星，恩诺沙 星，按上述方法测定IC 50 值，并计算交叉反应率； 交叉反应率（%）= IC 50 （甲氧苄啶）/ IC 50 （类似物） 实验设3次重复，结果取平均值。 0023 结果显示，五免后，小鼠抗血清效价可达27000，半数抑制浓度为2.05 ng/mL，检测 说 明 书CN 104370829 A 5/5页 7 限为0.47ng/mL，各类似物的交叉反应率均小于5%。 说 明 书CN 104370829 A 1/1页 8 图1 图2 说 明 书 附 图CN 104370829 A 。