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1、(10)申请公布号 CN 104054819 A (43)申请公布日 2014.09.24 C N 1 0 4 0 5 4 8 1 9 A (21)申请号 201410314131.7 (22)申请日 2014.07.03 A23B 7/154(2006.01) (71)申请人浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路 866号 (72)发明人余挺 傅达 项华灵 余辰 曾丽珍 周涛 盛况 (74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人金祺 (54) 发明名称 诱导果实抗性控制病害的方法及所用制剂 (57) 摘要 本发明公开了一种用于诱导果实抗性控制 病害的制。
2、剂，为质量浓度为0.10.5的胶体 几丁质溶液。胶体几丁质溶液的制备方法为：先 进行胶体几丁质浓缩液的制备，然后在胶体几丁 质浓缩液中加水进行稀释，从而获得质量浓度为 0.10.5的胶体几丁质溶液。本发明还同时 公开了利用上述制剂诱导果实抗性控制病害的方 法：在温度为25/4，湿度为90条件下，诱导 处理24小时。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104054819 A CN 104054819 A 1/1页 2 1.用于诱导果实抗性控制病害。
3、的制剂，其特征是： 质量浓度为0.10.5的胶体几丁质溶液。 2.根据权利要求1所述的用于诱导果实抗性控制病害的制剂，其特征是： 胶体几丁质溶液的制备方法为依次进行以下步骤： 1)、胶体几丁质浓缩液的制备： 称取5g几丁质，于11.5分钟缓慢加入到100mL质量分数为37.5的浓盐酸中，置 于200r/min摇床中搅拌12h；然后加入至2000mL的05的体积浓度95乙醇中，搅拌 后于2025的室温放置沉降0.51h，收集沉淀，用无菌蒸馏水反复冲洗沉淀，直到洗 涤液的pH为7.0； 在沉淀中加水稀释直至几丁质的质量浓度为5，得胶体几丁质浓缩液； 2)、在胶体几丁质浓缩液中加水进行稀释，从而获得。
4、质量浓度为0.10.5的胶体几 丁质溶液。 3.根据权利要求2所述的用于诱导果实抗性控制病害的制剂，其特征是： 胶体几丁质溶液的质量浓度为0.1、0.2或0.5。 4.利用权利要求1、2或3所述的制剂诱导果实抗性控制病害的方法，其特征是：在温 度为25，湿度为90条件下，诱导处理24小时。 5.利用权利要求1、2或3所述的制剂诱导果实抗性控制病害的方法，其特征是：低温 诱导时，在温度为4，湿度为90的环境条件下，诱导处理24小时。 权 利 要 求 书CN 104054819 A 1/8页 3 诱导果实抗性控制病害的方法及所用制剂 技术领域 0001 本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的。
5、是一种通过胶体几丁质诱导果 实抗性的生物保鲜技术。 背景技术 0002 水果在采后由于腐烂而导致的损失非常巨大，据资料显示，我国每年果蔬腐烂超 过8000万吨，损失率高达30，造成的经济损失达千亿元。病原真菌侵染是造成梨果实采 后腐烂的主要原因，如Penicillium expansum侵染造成的青霉病，不仅导致水果在数量上 的严重损失，而且P.expansum分泌的棒曲霉素会引起严重的食品安全问题。 0003 目前，化学杀菌剂仍然是控制水果采后病害的主要措施。中国发明专利(申请号 200910028802.2，柑橘保鲜剂)提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括甲基托布 津、多菌灵。中国发。
6、明专利(申请号200910028804.1，柑橘长效保鲜剂)提供了可控制柑 橘病害的化学杀菌剂，包括2,4-D钠盐，托布津。中国发明专利(申请号201110209305.X， 一种柑橘保鲜剂及其制备方法、应用)提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括醚 菌酯、唑菌胺脂、肟菌酯、烯肟菌酯等。然而，化学杀菌剂具有一定的毒副作用，其残留问题 日益严重，容易对人体健康及环境安全产生严重的危害；同时会导致病原微生物耐药性的 产生，从而影响病害防治效果。因此，寻找新型的、安全有效的病害控制方法来代替杀菌剂 日益成为人们关注的焦点。 0004 植物在长期进化过程中形成了多种保护机制对抗微生物的侵染，其中包。
7、括诱导抗 性，经外源因子诱导后可以表现出来，从而对多种病原微生物形成抗病性。大量研究表明许 多生物、物理和化学激发子都能诱导果实采后抗性，如热处理、紫外线、钙处理、植物天然抑 菌物质、生物防腐剂等。其中，化学激发子生产、运输、储藏方便，成本低，诱导操作简单，效 果稳定，应用较为广泛。中国发明专利(申请号200580006760.2，在植物中诱导抗性的混合 物和方法)提供了一种使用了两种或者多种化合物，包括水杨酸、促进性化合物、调节性化 合物，通过刺激植物天然防御系统，增强植物诱导抗性抑制病原菌的侵染的方法。中国发明 专利(申请号201010118266.8，利用提高植物免疫力防治植物病毒害的方。
8、法及其用途)提 供了一种使用了多种化合物诱导植物免疫系统使植物产生对植物病毒抗性用于植物保护 的方法。中国发明专利(申请号200810140359.3，一种果蔬保鲜剂及其制备与应用)提供 了一种通过以牛蒡低聚糖为主要成分的混合物诱导果蔬系统获得抗性的方法。 0005 几丁质(-(1,4)-N-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖)是广泛存在于自然界的一 种含氮多糖类生物高分子，主要的来源为虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳，软体动物的器 官以及真菌类的细胞壁等。其蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，在农业食品医药 行业有多方面的应用潜力，已经被美国食品和药物管理局(FDA)批准为食品添加剂，非常 具有。
9、市场潜力。中国发明专利(申请号03129922.9，抗氧化、抗衰老、抗重金属污染的保 健食品复方生物)提供了一种含几丁质的抗氧化、抗衰老、抗重金属污染的保健食品配方， 并可做成医用薄膜，防治心脑血管病、减肥、降血脂降血糖的保健食品及调整肠内菌群平衡 说 明 书CN 104054819 A 2/8页 4 的保健食品。中国发明授权专利一种微生物及其OS-植物调理素，公开号CN1118374，公 开了利用脱乙酰几丁质作为B S-6 菌株的诱导物及发酵底物，可以获得富含不同分子量聚氨 基糖和氨基寡糖素，可提高植物抗性及促进植物生长的OS植物调理素，并建立了一步发酵 法生产工艺流程。中国发明授权专利一种。
10、抗灰霉病的生物杀菌剂及其制备方法，公开号 CN1685834，公开了一种由木霉菌直接发酵制备得到的生物杀菌剂。发酵是在含麦麸或稻糠 或马铃薯为基料、几丁质为诱导物和其他基础营养成分的液体培养基中于2540条件 发酵510天。其工艺简单，使用方便，对环境无污染、无发酵残留，是名副其实的绿色无 公害杀菌剂。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题是提供一种不使用化学杀菌剂的条件下，采用化学激发 子抑制果实采后病害的保鲜技术。 0007 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于诱导果实抗性控制病害的制剂：质 量浓度(质量分数)为0.10.5的胶体几丁质溶液。 0008 作为本发明的用于诱导果实抗。
11、性控制病害的制剂的改进： 0009 胶体几丁质溶液的制备方法为依次进行以下步骤： 0010 1)、胶体几丁质浓缩液的制备： 0011 称取5g几丁质(粉末状)，于11.5分钟缓慢加入到100mL质量分数为37.5的 浓盐酸中，置于200r/min摇床中搅拌12h；然后加入至2000mL的05的体积浓度95 乙醇中，搅拌后于2025的室温放置沉降0.51h，收集沉淀，用无菌蒸馏水反复冲洗 沉淀，直到洗涤液的pH为7.0； 0012 在沉淀中加水稀释直至几丁质的质量浓度为5(即，沉淀干重的质量浓度为 5)，得胶体几丁质浓缩液； 0013 2)、在胶体几丁质浓缩液中加水进行稀释，从而获得质量浓度为0。
12、.10.5的胶 体几丁质溶液。 0014 本发明还同时提供了利用上述制剂诱导果实抗性控制病害的方法：在温度为 25，湿度(相对湿度)为90条件下，诱导处理24小时。 0015 本发明制剂诱导果实抗性控制病害的方法的改进：低温诱导时，在温度为4，湿 度为(相对湿度)90的环境条件下，诱导处理24小时。 0016 本发明是通过胶体几丁质诱导果实抗性的生物保鲜技术。 0017 上述胶体几丁质的使用浓度为0.10.5(质量分数)，可根据具体果实和品种 以及储藏条件的不同可以进行必要的调整。 0018 本发明的优点是：(1)本发明中的几丁质资源丰富、成本低廉，容易生产、运输，而 且防效稳定，使用简单，受。
13、环境因素影响较小；(2)诱导抗性是植物受病虫害侵染后产生的 一种自然反应，可以对病虫害产生持久和系统的广谱抗性；(3)能显著降低果实的采后病 害，对环境和人体健康无任何毒害作用，具有经济实用、安全高效、环境友好等特点。 附图说明 0019 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 说 明 书CN 104054819 A 3/8页 5 0020 图1是胶体几丁质不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响对比图； 0021 其中图(a)为伤口处理发病率，图(b)为伤口处理病斑直径。 0022 图2冷藏条件下胶体几丁质对梨果实青霉病抗性的影响对比图； 0023 其中图(a)为发病率，图(b)为。
14、病斑直径。 0024 图3胶体几丁质整果处理对梨果实青霉病抗性的影响对比图； 0025 其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径。 0026 图4冷藏条件下胶体几丁质整果处理对梨果实青霉病抗性的影响对比图； 0027 其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径。 具体实施方式 0028 实验1胶体几丁质不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响 0029 1、实验材料： 0030 果实为梨，品种为水晶梨。 0031 病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)，25活化7天备用。 0032 2、处理： 0033 (1)胶体几丁质溶液制备：称取5g几丁质粉末，缓慢(11.5分钟)加入到1。
15、00mL 质量分数为37.5的浓盐酸中，置于200r/min摇床中搅拌过夜(12h)；然后加入至2000mL 冰冷(05)的95(体积)乙醇中，搅拌后于室温(2025)放置沉降(0.5 1h)获得沉淀，收集沉淀，用无菌蒸馏水反复冲洗沉淀，直到洗涤液的pH7.0，取适量沉淀， 称量其湿重，然后置于60烘箱中烘干至恒重，称量其干重，根据干湿重比例计算得沉淀中 胶体几丁质的质量浓度，适当加水稀释直至几丁质的质量浓度为5，得胶体几丁质浓缩 液，于4保存。 0034 备注说明： 0035 将胶体几丁质浓缩液与水按照1:49的重量比混合，得质量浓度为0.1的胶体几 丁质溶液； 0036 将胶体几丁质浓缩液。
16、与水按照1:24的重量比混合，得质量浓度为0.2的胶体几 丁质溶液； 0037 将胶体几丁质浓缩液与水按照1:9的重量比混合，得质量浓度为0.5的胶体几 丁质溶液。 0038 (2)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗， 然后再浸入0.1(质量)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗 去残余次氯酸钠，晾干备用。 0039 (3)用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小(5mm)和尽可能相同的深 度(2mm)的伤口4个。每个伤口处分别加入等量(50L)0.1、0.2、0.5的胶体几丁质 溶液，在25恒温、恒湿(90的相对湿度)条件下诱导24小。
17、时，以加入等量的无菌水作为 对照。 0040 (4)在伤口处接入110 4 spores/mL扩展青霉Penicillium expansum菌悬液 30L，处理完毕后在常温下(25)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时观察并记 录结果，对不同浓度胶体几丁质的效力进行比较，结果以平均发病率()和平均病斑直径 说 明 书CN 104054819 A 4/8页 6 (mm)表示。选取9个果为一组重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。 0041 胶体几丁质不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响如图1所示。 0042 3、结果： 0043 如图1所示，在接种扩展青霉Penicillium e。
18、xpansum后第5天，胶体几丁质在高浓 度0.5时，虽然不能显著抑制病害的发生，但是可以控制病害的发展，减小病斑直径；当 浓度下降到0.2和0.1时，可以明显降低病害的发生率(23.1、12.0)，相比对照处 理，发病率分别降低了19.5和30.6，有效的抑制了青霉病害，且两者之间无明显差异， 在病斑直径上也有明显的抑制效果。 0044 因此，本发明0.10.2的胶体几丁质是诱导梨果实抗性的最适处理浓度。 0045 实验2冷藏条件下胶体几丁质对梨果实青霉病抗性的影响 0046 1、实验材料： 0047 果实为梨，品种为水晶梨。 0048 病原菌：扩展青霉(Penicillium expans。
19、um)，25活化7天备用。 0049 2、处理： 0050 (1)胶体几丁质溶液制备：同实验1。 0051 (2)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗， 然后再浸入0.1(质量)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗 去残余次氯酸钠，晾干备用。 0052 (3)用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小(5mm)和尽可能相同的深 度(2mm)的伤口4个。每个伤口处分别加入等量(50L)0.1、0.2、0.5的胶体几丁质 溶液，在4恒温、恒湿(90的相对湿度)条件下诱导24小时，以加入等量的无菌水作为 对照。 0053 (4)在伤口处接入110。
20、 4 spores/mL扩展青霉Penicillium expansum菌悬液 30L，处理完毕后在低温下(4)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，从接入病原菌的 第20天开始，每隔3天定时观察并记录结果，对胶体几丁质在低温下诱导效力进行比较，结 果以平均发病率()和平均病斑直径(mm)表示。选取9个果为一组重复，3个重复，实验 重复两次，以相同结果为准。 0054 冷藏条件下胶体几丁质对梨果实青霉病抗性的影响如图2所示。 0055 3、结果： 0056 如图2所示，在低温条件下贮藏，各浓度处理组与对照组相比果实青霉病的发病 情况均有所减弱，其中以胶体几丁质浓度为0.5的处理组效果最为明显。在。
21、低温贮藏的 早期(接入病原菌后的第20天)，对照组与处理组的发病率均较低。从第20天开始，对照 组发病速度较快，到第29天时达到了96.3，而胶体几丁质0.5诱导处理的发病率仅为 44.9，相比对照降低了51.4，有效减缓了果实青霉病的发生。在病斑直径上也有类似的 结果。 0057 因此，本发明提供的胶体几丁质诱导方法在低温贮藏下也具有十分明显的效果， 只是最适诱导浓度有所不同。 0058 实验3胶体几丁质整果处理对梨果实青霉病抗性的影响 0059 1、实验材料： 说 明 书CN 104054819 A 5/8页 7 0060 果实为梨，品种为水晶梨。 0061 病原菌：扩展青霉(Penici。
22、llium expansum)，25活化7天备用。 0062 2、处理： 0063 (1)胶体几丁质溶液制备：同实验1。 0064 (2)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗， 然后再浸入0.1(质量)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗 去残余次氯酸钠，晾干备用。 0065 (3)将梨果实置于0.1、0.2、0.5的胶体几丁质溶液中浸泡5分钟，取出自然 晾干，以无菌水作为对照，在25恒温、恒湿(90的相对湿度)条件下诱导24小时，用消 过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小的伤口。 0066 (4)在伤口处接入110 4 spores/m。
23、L扩展青霉Penicillium expansum菌悬液 30L，处理完毕后在常温下(25)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时观察并记 录结果，对不同浓度胶体几丁质的效力进行比较，结果以平均发病率()和平均病斑直径 (mm)表示。选取9个果为一组重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。 0067 胶体几丁质整果处理对梨果实青霉病抗性的影响如图3所示。 0068 3、结果： 0069 如图3所示，在接种扩展青霉Penicillium expansum后第3天，0.1、0.2和 0.5胶体几丁质溶液整果处理后，都能有效抑制梨果实青霉病的发生，相比对照发病率分 别下降了38.9、33.3。
24、和22.2，结果具有显著性，在病斑直径上也有显著的抑制效果。 0070 因此，本发明0.10.5的胶体几丁质用于整果处理能有效地诱导梨果实的抗 性。 0071 实验4冷藏条件下胶体几丁质整果处理对梨果实青霉病抗性的影响 0072 1、实验材料： 0073 果实为梨，品种为水晶梨。 0074 病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)，25活化7天备用。 0075 2、处理： 0076 (1)胶体几丁质溶液制备：同实验1。 0077 (2)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗， 然后再浸入0.1(质量)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水。
25、冲洗干净，洗 去残余次氯酸钠，晾干备用。 0078 (3)将梨果实置于0.1、0.2、0.5的胶体几丁质溶液中浸泡5分钟，取出自然 晾干，以无菌水作为对照，在4恒温、恒湿(90的相对湿度)条件下诱导24小时，用消过 毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小的伤口。 0079 (4)在伤口处接入110 4 spores/mL扩展青霉Penicillium expansum菌悬液 30L，处理完毕后在低温下(4)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，从接入病原菌的 第8天开始，每隔2天定时观察并记录结果，对胶体几丁质整果处理在低温下诱导效力进行 比较，结果以平均发病率()和平均病斑直径(mm)表示。选。
26、取9个果为一组重复，3个重 复，实验重复两次，以相同结果为准。 0080 冷藏条件下胶体几丁质整果处理对梨果实青霉病抗性的影响如图4所示。 说 明 书CN 104054819 A 6/8页 8 0081 3、结果： 0082 如图4所示，在接种扩展青霉Penicillium expansum后第10天，0.1、0.2 和0.5胶体几丁质溶液整果处理后，在冷藏条件下都能降低梨果实青霉病的发病率，其 中0.1和0.2的抑制效果较小，而0.5的抑制效果较大，其相比对照组发病率下降了 28.8，结果具有显著性；在病斑直径上，0.5的胶体几丁质溶液也有显著的抑制效果，相 比对照组平均病斑直径下降了1.9。
27、mm。 0083 因此，在冷藏条件下，本发明0.10.5的胶体几丁质用于整果处理能有效地诱 导梨果实的抗性，其中0.5的效果较好。 0084 对比实验14、 0085 将上述实验14中所用的胶体几丁质浓缩液(质量浓度5)改成几丁质悬浊 浓缩液(质量浓度5)；几丁质悬浊浓缩液(质量浓度5)的制备方法为：称取5g几丁 质粉末加入95g水，均匀搅拌。 0086 备注说明： 0087 将几丁质悬浊浓缩液与水按照1:49的重量比混合，得质量浓度为0.1的几丁质 悬浊液； 0088 将几丁质悬浊浓缩液与水按照1:24的重量比混合，得质量浓度为0.2的几丁质 悬浊液； 0089 将几丁质悬浊浓缩液与水按照1。
28、:9的重量比混合，得质量浓度为0.5的几丁质 悬浊液。 0090 以上述3种浓度的几丁质悬浊液替代实验1实验4相应浓度的胶体几丁质溶 液，从而相应的获得对比实验1对比实验4；具体如下： 0091 对比实验1、 0092 如表1所示，同样在接种扩展青霉Penicillium expansum后第5天，0.10.5 的几丁质悬浊液对梨果实青霉病害的发生率和病斑直径也有一定的抑制作用，但效果不如 实验1的胶体几丁质溶液，而且各处理组相比对照组在发病率和病斑直径上都没有显著性 差异。 0093 表1几丁质悬浊液对梨果实青霉病的影响 0094 处理号处理发病率()病斑直径(mm) 1对照：无菌水44.4。
29、5.6 7.92.4 2 0.1几丁质悬浊液22.211.1 3.70.8 3 0.2几丁质悬浊液37.85.6 4.52.3 4 0.5几丁质悬浊液43.39.6 6.11.4 0095 0096 对比实验2、 0097 如表2所示，在接种扩展青霉Penicillium expansum后第20天，对照组与各浓度 说 明 书CN 104054819 A 7/8页 9 处理组的发病率都很高，虽然各处理组发病率略低于对照组，但结果无显著差异。在病斑 直径上，0.10.5的几丁质悬浊液对病害的发展有一定的抑制作用，但效果不大。总体 上，在冷藏条件下，0.10.5的几丁质悬浊液对梨果实青霉病的抑制作。
30、用远没有0.1 0.5的胶体几丁质溶液效果好。 0098 表2冷藏条件下几丁质悬浊液对梨果实青霉病的影响(第32天) 0099 1对照：无菌水95.24.8 22.30.8 2 0.1几丁质悬浊液90.54.8 21.80.8 3 0.2几丁质悬浊液90.54.8 21.90.8 4 0.5几丁质悬浊液90.54.8 21.90.8 0100 对比实验3、 0101 整果浸泡诱导后，同样在接种扩展青霉Penicillium expansum后第3天，具体结果 如表3所示。 0102 因此，几丁质悬浊液整果处理的抑制效果远不如实验3中的胶体几丁质溶液。 0103 表3几丁质悬浊液整果处理对梨果实。
31、青霉病的影响 0104 处理号处理发病率()病斑直径(mm) 1对照：无菌水1000.0 8.00.2 2 0.1几丁质悬浊液88.95.6 6.50.9 3 0.2几丁质悬浊液1000.0 7.40.3 4 0.5几丁质悬浊液94.45.6 7.20.7 0105 对比实验4、 0106 整果浸泡诱导后，同样在接种扩展青霉Penicillium expansum后第10天，如表4 所示。 0107 因此，冷藏条件下几丁质悬浊液整果处理的抑制效果远不如实验4中的胶体几丁 质溶液。 0108 表4冷藏条件下几丁质悬浊液整果处理对梨果实青霉病的影响 0109 处理号处理发病率()病斑直径(mm) 。
32、1对照：无菌水1000.0 7.90.4 2 0.1几丁质悬浊液1000.0 8.00.4 说 明 书CN 104054819 A 8/8页 10 3 0.2几丁质悬浊液1000.0 7.90.5 4 0.5几丁质悬浊液1000.0 7.90.5 0110 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书CN 104054819 A 10 1/4页 11 图1 说 明 书 附 图CN 104054819 A 11 2/4页 12 图2 说 明 书 附 图CN 104054819 A 12 3/4页 13 图3 说 明 书 附 图CN 104054819 A 13 4/4页 14 图4 说 明 书 附 图CN 104054819 A 14 。