二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A或其盐及其制备与应用技术领域
本发明涉及药物化学，涉及二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯
A或其盐及其在制药中的应用，尤其涉及二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋
覆花内酯A或其盐及其制备与在制备治疗多发性硬化症药物中的应
用。
背景技术
多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)于1868年由法国医生
Charcot首次提出，至今仍是整个医学界未解的难题之一。该病是一
种慢性、自身免疫性疾病，通过破坏脑、脊髓以及视神经的神经纤维
保护层髓磷脂，影响正常的神经传递而导致身体残疾。由于该病具有
极高的复发率和致残率、呈慢性病程和倾向于年轻人罹患，已成为常
见的、重要的神经系统疾病之一。另外，据统计，多发性硬化症的发
病高峰在30岁左右，因此，会严重危害青壮年人口的生产力和生活
质量，也给国家和政府造成极大负担，制约了社会和经济发展。
目前，临床上对多发性硬化症无特效治疗方法，缺乏令人满意的
治疗药物。急性期主要给予糖皮质激素，复发-缓解期主要治疗药物
包括:干扰素-γ，醋酸格拉替雷和单克隆抗体那他珠单抗。重度患者
还可以考虑自体干细胞移植。西医的激素疗法虽然能够缓解急性期症
状，但毒副作用明显，故不推荐长期使用；免疫调节剂干扰素IFN-β、
GA和那他珠单抗等不仅费用昂贵，且长期使用针对单一靶点药物容
易出现耐受。且上述药物均需经静脉、或注射给药，不能有效改善
MS反复复发和髓鞘脱失的根本问题，也即对于多发性硬化症无特效
治疗方法，缺乏令人满意的治疗药物。因此，亟需要积极研发能有效
控制多发性硬化症的复发、改善髓鞘脱失的口服药物，这具有十分重
要的意义。而传统中医药具有多靶点、系统调节的作用特点，已在一
些疑难杂症的治疗上显示了一定的优势。故而，针对多发性硬化症的
复杂性、难治性疾病，探索有效的中药也是学者们研究的方向。
线叶旋覆花内酯A提取自线叶旋覆花[Inula lineariifolia Turcz.
(syn.Inula linariaefolia)]，在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
模型有较好的治疗作用，该模型是多发硬化症药物研究的理想模型，
因此本发明人已申请了中国专利：20120208157.4“线叶旋覆花内酯A
在制备治疗多发硬化症药物中的应用”。然而进一步研究发现线叶旋
覆花内酯A口服生物利用度较低，本发明人对其进行了结构修饰，
制备了一种线叶旋覆花内酯A衍生物：二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋
覆花内酯A。线叶旋覆花内酯A在弱碱性环境下，内酯环会水解，
水解后形成的羧基，会与4位的羟基形成内酯，从而形成线叶旋覆花
内酯A的异构体，降低了线叶旋覆花内酯A的生物利用度，因此首
先将线叶旋覆花内酯A结构上4位的游离羟基乙酰化。此外，线叶
旋覆花内酯A结构上的α-甲基烯-γ-丁内酯结构单元很不稳定，入血
后，很快与半胱氨酸结合，而且这种结合很稳定，降低了线叶旋覆花
内酯A的生物利用度。通过将α-甲基烯-γ-丁内酯与二甲基胺反应，
会使双键打开形成二甲基胺衍生物，该衍生物在中性和弱碱性条件
下，会缓慢脱去二甲基胺，再形成α-甲基烯-γ-丁内酯，发挥药效。
试验证明：该衍生物在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
模型亦有较好的治疗作用具有治疗多发性硬化症的功效，可以用于多
发性硬化症药物；并且与线叶旋覆花内酯A相比较，提高了口服生
物利用度，宜作进一步研发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计线
叶旋覆花内酯A衍生物及其在制药中的应用。
本发明提供一种二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物，
以式Ⅰ所示：
本发明还提供了所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化
合物药学上可接受的盐，以式Ⅱ所示：
所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物药学上可接
受的盐由二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A与酸HX生成。
其中HX为盐酸、硫酸、氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、亚硫
酸、硝酸、碳酸、硼酸、亚硒酸、磷钼酸、亚磷酸、柠檬酸、马来酸、
D-苹果酸、L-苹果酸、DL-苹果酸、D-乳酸、L-乳酸、DL-乳酸、草
酸、磺酸，苯磺酸、取代苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、酞酸、酒
石酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、枸橼酸、苯甲酸或取代苯甲酸。
所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物药学上可接
受的盐，优选为二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A盐酸盐Ⅲ和
二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A富马酸盐Ⅳ：
本发明的另一目的是提供所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花
内酯A化合物及其药学上可接受的盐的制备方法。
(一)制备二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物，该
方法包括下列步骤：
(1)取线叶旋覆花内酯A，碱和乙酸酐Ac2O置于反应瓶中，
加入有机溶剂溶解，0～50℃搅拌12～24h，TLC监测待原料反应完全
后，加水淬灭，取有机层；
(2)有机层再加水萃取多次，直至有机层TLC检测反应产物4-O-
乙酰基线叶旋覆花内酯A中无其他杂质，弃去水层，有机层再用饱
和食盐水洗涤，无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，0.01～0.1MPa，20～80℃
减压浓缩至原体积的1/10～1/20；
(3)浓缩液硅胶柱层析，以体积比为15:1～5:1的石油醚/乙酸乙
酯系统梯度洗脱，TLC检测，得4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A；
以下列反应式表示：
(4)取4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A和二甲胺盐酸盐
(CH3NHCH3·HCl)置于反应瓶中，加入有机溶剂溶解，反应瓶置于
-20～0℃冷却槽中，慢慢加入碱，然后将反应体系缓慢升至室温
(25-30℃)，搅拌2～12h，TLC监测反应，待原料反应完全，0.01～0.1MPa
20～80℃减压蒸除溶剂，得粗品，加有机试剂溶解，再加水萃取，弃
去水层，重复此步骤，至有机层TLC监测反应产品二甲基胺4-O-乙
酰基线叶旋覆花内酯A化合物无其他杂质，有机层用饱和食盐水洗
涤，无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，硅胶柱层析，以体积比为15:1～1:1
的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，收集含化合物Ⅰ
的洗脱液，0.01～0.1MPa，20～80℃减压蒸除溶剂，得化合物Ⅰ，
以下列反应式表示：
本发明方法所述步骤(1)线叶旋覆花内酯A，碱和乙酸酐Ac2O
的用量比为1.0eq：1.0～2.0eq：1.0～2.0eq。
所述有机试剂，指和水不互溶的试剂，如乙酸乙酯、二氯甲烷、
三氯甲烷、四氯化碳、乙醚、石油醚、正丁醇、苯、甲苯或四氢呋喃
中的一种或几种混合试剂，优选二氯甲烷。
所述碱为低级三烷基取代胺，如三甲基胺、三乙基胺、三丙基胺、
三丁基胺或吡啶或取代吡啶，优选对二甲基吡啶。
所述步骤(4)4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A：二甲胺盐酸盐：
碱的用量比为1.0eq：1.0～2.0eq：1.0～2.0eq。
所述有机溶剂为低级脂肪醇，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、二
氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、乙醚、石油醚或乙酸乙酯中的一种或
多种组合，优选乙醇。
所述有机试剂指和水不互溶的试剂，如乙酸乙酯、二氯甲烷、三
氯甲烷、四氯化碳、乙醚、石油醚、正丁醇、苯、甲苯或四氢呋喃中
的一种或几种混合试剂，优选二氯甲烷。
所述碱为低级三烷基取代胺，烷基为甲基、乙基、丙基、丁基，
和吡啶、取代吡啶，优选三乙基胺。
(二)制备二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物的盐
化合物Ⅰ(1.0eq)溶于溶剂中，与酸HX(1.0～1.5eq)，在0～50℃下
搅拌反应2～24h，0.01～0.1MPa，20～80℃减压浓缩，得式Ⅱ的盐；
以下列反应式表示：
上述方法中，所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合
物Ⅰ与酸HX的用量比为：1.0eq：1.0～1.5eq。
所述HX为盐酸、硫酸、氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、亚硫
酸、硝酸、碳酸、硼酸、亚硒酸、磷钼酸、亚磷酸、柠檬酸、马来酸、
D-苹果酸、L-苹果酸、DL-苹果酸、D-乳酸、L-乳酸、DL-乳酸、草
酸、磺酸，苯磺酸、取代苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、酞酸、酒
石酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、枸橼酸、苯甲酸或取代苯甲酸，优
选盐酸或富马酸。
所述溶剂为低级脂肪醇，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、二氯甲
烷、三氯甲烷、四氯化碳、乙醚、石油醚或乙酸乙酯中的一种或多种
组合，优选乙醇。
本发明的又一目的是提供所述二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花
内酯A化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗多发性硬化症药物
中的应用。
本发明人采用EAE动物模型，将二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花
内酯A化合物Ⅰ进行EAE动物模型药效试验。因为EAE动物模型是药
效试验中常规使用于人类多发性硬化(MS)的理想动物模型，常用
于免疫激活和免疫抑制方面的机制研究。通过化合物Ⅰ对小鼠实验性
自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的作用，试验结果表明：化合物Ⅰ
灌胃给药，可明显降低EAE的发病程度(见图1)。模型组EAE小鼠脑
组织炎症细胞浸润，血管、组织排列松散，边缘不清晰；给药组炎症
细胞减少，血管、组织基本恢复正常状态(见图2)，化合物Ⅰ灌胃给
药能较好的阻止EAE的发病过程,提示该化合物对多发性硬化症有较
好的治疗作用，说明二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ
或其盐Ⅱ可用于制备治疗多发性硬化症的药物。
本发明所述制备治疗多发性硬化症的药物为由二甲基胺4-O-乙
酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ或其盐Ⅱ作为活性成分与常规药用
载体制成的药物组合物。
所述药物组合物为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊
剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。
本发明的二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物比线叶
旋覆花内酯A具有更高的口服生物利用度。本发明为治疗多发性硬
化症研发提供了新的药物，有较好的临床应用前景，有较大的社会效
益。
附图说明
图1灌胃给予化合物Ⅰ后小鼠EAE发病评分变化(剂量：30
mg/kg)，纵坐标为“EAE评分”，横坐标为“天”。
(三条线从上到下依次为：EAE+溶剂组、EAE+化合物Ⅰ组、空
白组)。
图2小鼠脑组织切片H&E染色(1空白组、2EAE+溶剂组、3EAE+
化合物Ⅰ组)和脊髓LFB染色(4空白组、5EAE+溶剂组、6EAE+化合
物Ⅰ组)(剂量：30mg/kg)。
具体实施方式
以下实施例使用原料和试剂市售得到。
实施例1线叶旋覆花内酯A的制备
将线叶旋覆花干燥全草50Kg粉碎，以90％乙醇750L回流提取
2次，每次2小时，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏
相当于1ml含线叶旋覆花1.0g，流浸膏加水50L稀释后，以石油醚
每次50L萃取5次，得到石油醚部分。将石油醚部分应用硅胶柱层析，
以体积比为100：0～1：1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层
析检测，收集含线叶旋覆花内酯A的流分，再经C18反相柱层析，以
重量比为50：100-70：100的甲醇/水进行洗脱，薄层层析检测，得线
叶旋覆花内酯A纯品45.3g。
(得到的化合物先采用质谱测定分子量366，分子式C19H26O7，
再进行核磁共振分析得到碳谱、氢谱以及二维谱数据，进行结构解析，
与已知化合物线叶旋覆花内酯A的数据一致得到确证)。
实施例2 4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A的制备
取线叶旋覆花内酯A(10.0g,0.027mol，1.0eq)，对二甲氨基吡啶
(DMAP)(4.0g,0.033mol,1.2eq)和乙酸酐(Ac2O)(3.34g,0.033mol,
1.2eq)置于500mL茄形瓶中，加入200mL无水二氯甲烷(CH2Cl2)，
室温搅拌12h。薄层层析监测反应情况，待原料反应完全后，加水
200mL淬灭，置分液漏斗中，弃去水层，有机层再加水100mL萃取，
弃去水层，重复此步骤，直至有机层中检测不出DMAP(TLC法)，
有机层再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，40℃以
下减压浓缩，硅胶柱层析，以体积比为15:1～5:1的石油醚/乙酸乙酯
系统梯度洗脱，薄层层析检测，得4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A(10.5
g,0.026mol)，产率94％。检测证实为该产品：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.14(dt,J＝3.8,1.1Hz,1H),
5.51(dd,J＝3.2,1.6Hz,1H),5.26–5.19(m,1H),5.15(dt,J＝8.6,1.6
Hz,1H),4.91(t,J＝7.8Hz,1H),4.49–4.42(m,1H),3.01–2.93(m,
1H),2.43–2.36(m,1H),2.08–2.06(m,3H),2.03(q,J＝1.2Hz,3H),
2.00–1.93(m,6H),1.89(dd,J＝12.0,5.9Hz,1H),1.48–1.38(m,1H),
1.08(d,J＝1.2Hz,3H),0.97(dd,J＝6.4,1.4Hz,3H)；13C NMR(125
MHz,Chloroform-d)δ170.7,170.3,169.7,168.9,137.9,121.2,76.1,
75.0,73.7,73.6,52.4,50.3,50.3,43.9,34.2,29.8,21.2,21.1,20.9,20.3,
17.3.
实施例3二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物Ⅰ的制备
取上述4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A(10.0g,0.024mol,1.0eq)，
二甲胺盐酸盐(CH3NHCH3·HCl)(3.0g,0.037mol,1.5eq)置于500mL
茄形瓶中，加入200mL乙醇溶解，反应瓶置于低温冷却槽中，0℃时，
慢慢滴加三乙胺(NEt3)(5.1mL,0.037mol,1.5eq)，然后将反应体系
慢慢升至室温(25℃)，搅拌，薄层层析监测反应，4h后，原料反应
完全，减压蒸除溶剂，得粗品，粗品加200mL二氯甲烷溶解，加水
100mL萃取，弃去水层，重复此步骤，直至有机层检测不出二甲胺盐
酸盐。有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，硅
胶柱层析，以体积比为15:1～1:1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，
薄层层析检测，得到二甲基胺4-O-乙酰基线叶旋覆花内酯A化合物
Ⅰ(10.0g,0.022mol)，产率90％。
1H-NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.27(dd,J＝10.7,8.6Hz,1H),
5.04(d,J＝9.5Hz,1H),4.92(ddd,J＝9.2,6.8,2.1Hz,1H),4.40(ddd,J
＝11.7,10.1,2.8Hz,1H),2.69–2.61(m,2H),2.53(dd,J＝9.3,6.5Hz,
1H),2.45(dd,J＝13.1,5.3Hz,1H),2.36(ddd,J＝13.2,4.5,2.8Hz,1H),
2.18(s,6H),2.08–2.05(m,1H),2.03(s,4H),2.01(s,3H),1.97(s,3H),
1.96–1.87(m,2H),1.40(dt,J＝13.1,11.9Hz,1H),1.12(s,3H),0.97(d,
J＝6.5Hz,3H)；13C-NMR(125MHz,Chloroform-d)δ176.6,170.4,
170.3,169.5,77.2,76.2,76.1,74.9,74.3,57.4,50.0,50.0,48.7,46.9,
46.3,43.8,34.3,29.4,21.1,21.1,20.8,20.16,18.5。
实施例4化合物Ⅲ的制备
实施例1制得的化合物Ⅰ(10.0g，0.022mol)，溶于200mL无水
甲醇中中，通入标准HCl气体500mL，室温(25℃)搅拌反应半小
时，40℃，0.03～0.1MPa减压浓缩得化合物Ⅲ(10.7g，0.022mol)。
1H-NMR(500MHz,D2O)δ5.24–5.16(m,2H),5.02(td,J＝6.8,
4.5Hz,1H),4.93–4.84(m,1H),3.68(dd,J＝13.4,11.5Hz,1H),3.45
(td,J＝11.4,4.0Hz,1H),3.37(s,1H),2.99(dd,J＝13.3,4.0Hz,7H),
2.74(d,J＝11.5Hz,1H),2.44–2.36(m,1H),2.19(s,3H),2.16(d,J＝
6.7Hz,1H),2.14(d,J＝1.0Hz,3H),2.13–2.07(m,2H),2.08(s,3H),
1.53(q,J＝12.2Hz,1H),1.22(s,3H),0.99(d,J＝6.5Hz,3H)；13C NMR
(125MHz,D2O)δ177.20,172.43,171.0(2×C),79.2,77.2(2×C),75.9,
75.2,57.4,49.8,49.8(2×C),49.4,42.3,41.9,33.5,28.5,20.9,20.57,20.6,
19.5,17.4。
实施例5化合物Ⅳ的制备
实施例1制得的化合物Ⅰ(10.0g，0.022mol)，溶于200mL无水
甲醇中，加入分析纯富马酸(2.6g，0.022mol)，室温(25℃)搅拌反
应半小时，40℃，0.03～0.1MPa减压浓缩除去甲醇得化合物Ⅳ(12.6g，
0.022mol)。
1H-NMR(500MHz,D2O)δ6.72(d,J＝1.1Hz,2H),5.23–5.16(m,
2H),5.00(td,J＝6.8,4.5Hz,1H),4.90–4.84(m,1H),3.66(dd,J＝13.4,
11.5Hz,1H),3.44(td,J＝11.4,4.0Hz,1H),3.36(s,1H),2.98(dd,J＝
13.3,4.0Hz,7H),2.72(d,J＝11.5Hz,1H),2.42–2.36(m,1H),2.17(s,
3H),2.14(d,J＝6.7Hz,1H),2.12(d,J＝1.0Hz,3H),2.11–2.07(m,
2H),2.06(s,3H),1.50(q,J＝12.2Hz,1H),1.20(s,3H),0.98(d,J＝6.5
Hz,3H)；13C-NMR(125MHz,D2O)δ177.18,173.61,173.50,172.41,
170.9(2×C),134.8(2×C),79.0,77.0(2×C),75.7,75.0,57.2,49.6,
49.6(2×C),49.2,42.1,41.7,33.3,28.3,20.7,20.5,20.4,19.3,17.2.
实施例6化合物Ⅰ的动物药效试验
小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型是人类多发性硬化
(MS)的理想动物模型，常用于免疫激活和免疫抑制方面的机制研
究。
6.1 EAE造模方法
C57BL/6小鼠，MOG35-55300μg/只，结核分支杆菌H37Ra 400μg/
只，乳化，100μl，皮下注射；百日咳毒素PT 500ng/只，第0天和第
2天腹腔注射200μl。动物分组，每组6只。
6.2给药方式
式化合物Ⅰ45.3g(实施例1制得)悬于0.5％的CMC-Na(羧甲
基纤维素钠)配制成3mg/ml的溶液中，从免疫第0天开始每天给药
1次，给药剂量30mg/kg，连续给药30天。
6.3实验结果
30mg/kg·d-1(30mg/kg每天1次)化合物Ⅰ灌胃给药，可明显延
迟EAE的发病时间，降低EAE的发病程度(见图1)。模型组EAE
小鼠脑组织炎症细胞浸润，血管、组织排列松散，边缘不清晰；给药
组炎症细胞减少，血管、组织基本恢复正常状态(见图2)。
上述实验重复进行3次。效果同上所述。
6.4毒性
小鼠分别以200mg/kg、600mg/kg、1800mg/kg、5400mg/kg单次
灌胃给药，每个剂量组6只，雌雄各半。200mg/kg、600mg/kg组小
鼠无明显毒性反应，1800mg/kg组死亡一只雌性小鼠，5400mg/kg组
死亡5只小鼠。结果显示化合物Ⅰ安全性较好。
6.5结论
化合物Ⅰ灌胃给药能较好的阻止EAE的发病过程。提示该化合
物对多发性硬化症有较好的治疗作用。说明化合物Ⅰ可用于制备治疗
多发性硬化症的药物。
实施例7 片剂制备
制备方法：化合物Ⅰ、乳糖和玉米淀粉混合，用水均匀湿润，
把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合
物压片，每片重300mg，含式化合物Ⅰ25mg。
实施例8：注射液制备
实施例2制得的化合物Ⅲ 5g
葡萄糖 50g
制备方法：将式化合物Ⅲ和葡萄糖溶解于100L注射用水中，过
滤所得溶液，在无菌条件下装入输液瓶(每瓶100ml)中，每瓶含化
合物Ⅲ5mg。
实施例9：注射用冻干粉针剂制备
实施例3制得的化合物Ⅳ 10g
甘露醇 30g
制备方法：将化合物Ⅳ和甘露醇溶解于2L的注射用水中，过滤
所得溶液，在无菌条件下装入西林瓶(10ml西林瓶，每瓶2ml)中，
冻干，每支含化合物Ⅳ10mg。