乙醇沉淀法从肝素副产物制备舒洛地特原料的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104017102 A (43)申请公布日 2014.09.03 C N 1 0 4 0 1 7 1 0 2 A (21)申请号 201410274835.6 (22)申请日 2014.06.19 C08B 37/00(2006.01) (71)申请人深圳市海普瑞药业股份有限公司地址 518057 广东省深圳市南山区松坪山朗山路21号 (72)发明人马小来李锂张锦黄洪 (54) 发明名称乙醇沉淀法从肝素副产物制备舒洛地特原料的方法 (57) 摘要本发明公开了一种从肝素副产物分离制备舒洛地特原料的方法，将肝素副产物溶解，以氢氧化钠调节溶液至高pH值，。

2、以适量乙醇做低温沉淀，去沉淀后得到硫酸多糖溶液；以盐酸调该硫酸多糖溶液至低pH值，以适量乙醇做低温沉淀，去沉淀后得到硫酸多糖溶液；再以氢氧化钠调节该溶液至pH中性，以适量乙醇做室温沉淀，取沉淀烘干得到制得的舒洛地特原料。本发明的工艺简单、成本低、容易放大、适于工业化生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页说明书2页附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书2页附图1页 (10)申请公布号 CN 104017102 A CN 104017102 A 1/1页 2 1.一种从肝素副产物分离制备舒洛地特原料的方法，其特征包括以。

3、下步骤： (1) 将肝素副产物溶解为质量浓度为5-15%的溶液，以氢氧化钠溶液调节pH至 10.0-11.5，加乙醇至质量浓度为29-33%，在2-8沉淀1-2小时，离心收集上液得到清除慢肝素后的硫酸多糖溶液； (2) 向经过步骤(1)纯化的硫酸多糖溶液中加纯化水，使乙醇浓度降为24%，以盐酸调节pH至1.5-2.5，补加乙醇至质量浓度为38-42%，在2-8沉淀1-2小时，离心收集上液得到硫酸皮肤素减量后的硫酸多糖溶液； (3) 向步骤(2)得到的溶液中加纯化水，使乙醇浓度为36%，以氢氧化钠溶液调节pH至 5.5-8.5，加固体NaCl至质量浓度为2%，再加乙醇至质量浓度为40-50。

4、%，室温沉淀过夜，转移走上清，得沉淀； (4) 步骤(3)得到的沉淀以60-75烘干，即为舒洛地特药物原料。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1) 中所述肝素副产物溶解为8-12%质量分数的溶液，以氢氧化钠调节pH至11.0，沉淀时体系中乙醇质量浓度为40%。 3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述以盐酸调节pH至2.0，补加乙醇至质量浓度为40%。 4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3) 所述以氢氧化钠调节pH至7.0，加乙醇至质量浓度为45%。 5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)、(2)、(3)分别在碱性、酸性、中性环境执。

5、行乙醇沉淀。 6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)、(2)、(3)使用甲醇或者丙酮做有机溶剂沉淀。权利要求书CN 104017102 A 1/2页 3 乙醇沉淀法从肝素副产物制备舒洛地特原料的方法技术领域 0001 本发明涉及一种制备舒洛地特原料的方法，尤其涉及一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法。背景技术 0002 舒洛地特Sulodexide，商品名为伟素VESSEL DUE F，化学名称为葡糖醛酸基葡糖胺聚糖硫酸盐。由意大利Alfa Wassermann公司原创生产，1974年在意大利首先上市，2003年进入中国市场。适应症为有血栓形成危险的血管疾病。

6、，是一种可口服吸收的抗凝血药。近年显示其对糖尿病肾病的治疗有效果。 0003 舒洛地特由猪肠粘膜提取，是高度纯化的糖胺聚糖，由重复的二糖结构单元组成带有负电荷的长链大分子,二糖单元包含两个改构糖,即N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰葡糖胺及糖醛酸,如葡糖醛酸或艾杜糖醛酸。琼脂凝胶电泳法测得含有80%的快速移动肝素(fast moving heparin, FMH) (基于电泳迁移率) 即低分子肝素(low molecular weight heparin, LMWH) 和20%的硫酸皮肤素( dermatan sulfate, DS) 及少量慢速移动肝素(slow moving heparin。

7、, SMH) (不得大于2%)。其中的LMWH 部分与未分级肝素一样含有二糖聚合结构,但硫酸化程度较低,多糖链的长度较短。未降解DS是由许多不同二糖组成的多糖, 平均相对分子质量25000Da。 0004 肝素生产过程会产生大量副产物，其中含有硫酸软骨素（chondroitin sulfate, CS）、硫酸皮肤素、快移动肝素、慢移动肝素等，是分离制备舒洛地特原料的良好的材料。 0005 专利“一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法（申请号201210064002.8）”给出了一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法，采用醋酸钾沉淀、斑氏试剂沉淀、乙醇沉淀、阴离子交换树脂处理等步骤，从肝素。

8、副产物中分离出舒洛地特原料。 0006 本专利提供另一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法，分别采用高pH、低 pH、中pH条件下乙醇沉淀法将不同的无效成分分离除去，从而简单快速地从肝素副产物中分离出舒洛地特原料。发明内容 0007 本发明所要解决的技术问题是提供一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法。 0008 在生产肝素的过程中产生大量副产物，其中主要组成是硫酸软骨素、硫酸皮肤素、快移动肝素、慢移动肝素等。本发明中建立了一种新的分离纯化工艺，从肝素副产物分离出舒洛地特原料，本发明包括以下步骤： (1) 将肝素副产物溶解为5-15%（m/m）的溶液，以氢氧化钠调节pH至10.0-11。

9、.5，加乙醇至质量浓度为29-33%，在2-8沉淀1-2小时。离心收集上液得到清除慢肝素后的硫酸多糖溶液。 0009 (2) 向经过步骤(1)纯化的硫酸多糖溶液中加水，使乙醇浓度为24%，以盐酸调节 pH至1.5-2.5，加乙醇至质量浓度为38-42%，在2-8沉淀1-2小时。离心收集上液得到硫说明书CN 104017102 A 2/2页 4 酸皮肤素减量后的硫酸多糖溶液。 0010 (3) 向步骤(2)得到的溶液中加水，使乙醇浓度为36%，以氢氧化钠调节pH至 5.5-8.5，加固体NaCl至质量浓度为2%，再加乙醇至质量浓度为40-50%，8-10沉淀过夜。转移走上清，得沉淀。。

10、 0011 (4) 步骤(3)得到的沉淀以60-75烘干，即为舒洛地特药物原料。 0012 步骤(1)所述的肝素副产物溶液浓度优选为8%-12%，进一步优选为10%，溶液pH 优选为11.0，沉淀时乙醇浓度优选为31%；步骤(2) 溶液pH优选为2.0，沉淀时乙醇浓度优选为40%、(3) 溶液pH优选为7.0，沉淀时乙醇浓度优选为45%。步骤(1)、(2)、(3)使用乙醇做有机溶剂沉淀，但同理也可使用甲醇、丙酮做有机溶剂沉淀，只需将参数做微调即可。 0013 本发明所述制备方法，具有成本低廉、工艺简单、容易放大等特点。用本发明所制得的舒洛地特药物原料用琼脂糖电泳检测发现其组成为DS 20。

11、-30%、快肝素70-80%，符合舒洛地特药物组分要求。附图说明 0014 图1为原料、第一次沉淀后产物、第二次沉淀后产物、第三次沉淀后产物（终产物）琼脂糖凝胶电泳图谱。具体实施方式 0015 下面结合实例对本发明所述内容作进一步阐述。 0016 实施例一将肝素副产物（含CS5%、DS50%、快肝素25%、慢肝素20%，效价41usp u/mg,比旋+15）溶解为10%（m/m）的溶液，以6M氢氧化钠调节pH至11.0，加乙醇至质量浓度为31%，在 2-8沉淀2小时。4000rpm离心30min，收集上液得到清除慢肝素后的硫酸多糖溶液。 0017 向得到的硫酸多糖溶液中加水，使乙醇。

12、浓度为24%，以6M盐酸调节pH至2.0，加乙醇至质量浓度为40%，在2-8沉淀1-2小时。离心收集上液得到硫酸皮肤素减量后的硫酸多糖溶液。 0018 向得到的溶液中加水，使乙醇浓度为36%，以6M氢氧化钠调节pH至7.0，加固体 NaCl至质量浓度为2%，再加乙醇至质量浓度为50%，8-10沉淀过夜。移走上清，得沉淀。 0019 沉淀在烘箱中以70烘干，即为舒洛地特药物原料（DS20%，快肝素80%，效价 69usp u/mg,比旋+35）。 0020 实施例二取实施例一的原料、第一次沉淀后产物、第二次沉淀后产物、第三次沉淀后产物（终产物）等做琼脂糖凝胶电泳分析，方法参照专利“一种玻载电泳法分析粘多糖的方法 200910040788.8”。结果如图1所示，M表示肝素副产物原料，原料中含有CS、DS、快肝素、慢肝素，经过第一次沉淀去除了慢肝素，经过第二次沉淀，将DS含量降低，经过第三次沉淀去除CS，得到最终产物：DS 20-30%、快肝素70-80%。说明书CN 104017102 A 1/1页 5 图1 说明书附图CN 104017102 A 。

摘要
申请专利号：	CN201410274835.6	申请日：	2014.06.19
公开号：	CN104017102A	公开日：	2014.09.03
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	专利权人的姓名或者名称、地址的变更IPC(主分类):C08B 37/00变更事项:专利权人变更前:深圳市海普瑞药业股份有限公司变更后:深圳市海普瑞药业集团股份有限公司变更事项:地址变更前:518057 广东省深圳市南山区松坪山朗山路21号变更后:518057 广东省深圳市南山区松坪山朗山路21号\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C08B 37/00申请日:20140619\|\|\|公开
IPC分类号：	C08B37/00	主分类号：	C08B37/00
申请人：	深圳市海普瑞药业股份有限公司
发明人：	马小来; 李锂; 张锦; 黄洪
地址：	518057 广东省深圳市南山区松坪山朗山路21号
优先权：
专利代理机构：		代理人：
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内容摘要

本发明公开了一种从肝素副产物分离制备舒洛地特原料的方法，将肝素副产物溶解，以氢氧化钠调节溶液至高pH值，以适量乙醇做低温沉淀，去沉淀后得到硫酸多糖溶液；以盐酸调该硫酸多糖溶液至低pH值，以适量乙醇做低温沉淀，去沉淀后得到硫酸多糖溶液；再以氢氧化钠调节该溶液至pH中性，以适量乙醇做室温沉淀，取沉淀烘干得到制得的舒洛地特原料。本发明的工艺简单、成本低、容易放大、适于工业化生产。

权利要求书

权利要求书
1.  一种从肝素副产物分离制备舒洛地特原料的方法，其特征包括以下步骤：
(1) 将肝素副产物溶解为质量浓度为5-15%的溶液，以氢氧化钠溶液调节pH至10.0-11.5，加乙醇至质量浓度为29-33%，在2-8℃沉淀1-2小时，离心收集上液得到清除慢肝素后的硫酸多糖溶液；
(2) 向经过步骤(1)纯化的硫酸多糖溶液中加纯化水，使乙醇浓度降为24%，以盐酸调节pH至1.5-2.5，补加乙醇至质量浓度为38-42%，在2-8℃沉淀1-2小时，离心收集上液得到硫酸皮肤素减量后的硫酸多糖溶液；
(3) 向步骤(2)得到的溶液中加纯化水，使乙醇浓度为36%，以氢氧化钠溶液调节pH至5.5-8.5，加固体NaCl至质量浓度为2%，再加乙醇至质量浓度为40-50%，室温沉淀过夜，转移走上清，得沉淀；
(4) 步骤(3)得到的沉淀以60-75℃烘干，即为舒洛地特药物原料。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1) 中所述肝素副产物溶解为8-12%质量分数的溶液，以氢氧化钠调节pH至11.0，沉淀时体系中乙醇质量浓度为40%。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述以盐酸调节pH至2.0，补加乙醇至质量浓度为40%。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3) 所述以氢氧化钠调节pH至7.0，加乙醇至质量浓度为45%。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)、(2)、(3)分别在碱性、酸性、中性环境执行乙醇沉淀。

6.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)、(2)、(3)使用甲醇或者丙酮做有机溶剂沉淀。

说明书

说明书乙醇沉淀法从肝素副产物制备舒洛地特原料的方法
技术领域
本发明涉及一种制备舒洛地特原料的方法，尤其涉及一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法。
背景技术
舒洛地特Sulodexide，商品名为伟素VESSEL DUE F，化学名称为葡糖醛酸基葡糖胺聚糖硫酸盐。由意大利Alfa Wassermann公司原创生产，1974年在意大利首先上市，2003年进入中国市场。适应症为有血栓形成危险的血管疾病，是一种可口服吸收的抗凝血药。近年显示其对糖尿病肾病的治疗有效果。
舒洛地特由猪肠粘膜提取，是高度纯化的糖胺聚糖，由重复的二糖结构单元组成带有负电荷的长链大分子,二糖单元包含两个改构糖,即N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰葡糖胺及糖醛酸,如葡糖醛酸或艾杜糖醛酸。琼脂凝胶电泳法测得含有80%的快速移动肝素(fast moving heparin, FMH) (基于电泳迁移率) 即低分子肝素(low molecular weight heparin, LMWH) 和20%的硫酸皮肤素( dermatan sulfate, DS) 及少量慢速移动肝素(slow moving heparin, SMH) (不得大于2%)。其中的LMWH 部分与未分级肝素一样含有二糖聚合结构,但硫酸化程度较低,多糖链的长度较短。未降解DS是由许多不同二糖组成的多糖,平均相对分子质量25000Da。
肝素生产过程会产生大量副产物，其中含有硫酸软骨素（chondroitin sulfate, CS）、硫酸皮肤素、快移动肝素、慢移动肝素等，是分离制备舒洛地特原料的良好的材料。
专利“一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法（申请号201210064002.8）”给出了一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法，采用醋酸钾沉淀、斑氏试剂沉淀、乙醇沉淀、阴离子交换树脂处理等步骤，从肝素副产物中分离出舒洛地特原料。
本专利提供另一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法，分别采用高pH、低pH、中pH条件下乙醇沉淀法将不同的无效成分分离除去，从而简单快速地从肝素副产物中分离出舒洛地特原料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从肝素副产物分离舒洛地特原料的方法。
在生产肝素的过程中产生大量副产物，其中主要组成是硫酸软骨素、硫酸皮肤素、快移动肝素、慢移动肝素等。本发明中建立了一种新的分离纯化工艺，从肝素副产物分离出舒洛地特原料，本发明包括以下步骤：
(1) 将肝素副产物溶解为5-15%（m/m）的溶液，以氢氧化钠调节pH至10.0-11.5，加乙醇至质量浓度为29-33%，在2-8℃沉淀1-2小时。离心收集上液得到清除慢肝素后的硫酸多糖溶液。
(2) 向经过步骤(1)纯化的硫酸多糖溶液中加水，使乙醇浓度为24%，以盐酸调节pH至1.5-2.5，加乙醇至质量浓度为38-42%，在2-8℃沉淀1-2小时。离心收集上液得到硫酸皮肤素减量后的硫酸多糖溶液。
(3) 向步骤(2)得到的溶液中加水，使乙醇浓度为36%，以氢氧化钠调节pH至5.5-8.5，加固体NaCl至质量浓度为2%，再加乙醇至质量浓度为40-50%，8-10℃沉淀过夜。转移走上清，得沉淀。
(4) 步骤(3)得到的沉淀以60-75℃烘干，即为舒洛地特药物原料。
步骤(1)所述的肝素副产物溶液浓度优选为8%-12%，进一步优选为10%，溶液pH优选为11.0，沉淀时乙醇浓度优选为31%；步骤(2) 溶液pH优选为2.0，沉淀时乙醇浓度优选为40%、(3) 溶液pH优选为7.0，沉淀时乙醇浓度优选为45%。步骤(1)、(2)、(3)使用乙醇做有机溶剂沉淀，但同理也可使用甲醇、丙酮做有机溶剂沉淀，只需将参数做微调即可。
本发明所述制备方法，具有成本低廉、工艺简单、容易放大等特点。用本发明所制得的舒洛地特药物原料用琼脂糖电泳检测发现其组成为DS 20-30%、快肝素70-80%，符合舒洛地特药物组分要求。
附图说明
图1为原料、第一次沉淀后产物、第二次沉淀后产物、第三次沉淀后产物（终产物）琼脂糖凝胶电泳图谱。
具体实施方式
下面结合实例对本发明所述内容作进一步阐述。
实施例一
将肝素副产物（含CS5%、DS50%、快肝素25%、慢肝素20%，效价41usp u/mg,比旋+15°）溶解为10%（m/m）的溶液，以6M氢氧化钠调节pH至11.0，加乙醇至质量浓度为31%，在2-8℃沉淀2小时。4000rpm离心30min，收集上液得到清除慢肝素后的硫酸多糖溶液。
向得到的硫酸多糖溶液中加水，使乙醇浓度为24%，以6M盐酸调节pH至2.0，加乙醇至质量浓度为40%，在2-8℃沉淀1-2小时。离心收集上液得到硫酸皮肤素减量后的硫酸多糖溶液。
向得到的溶液中加水，使乙醇浓度为36%，以6M氢氧化钠调节pH至7.0，加固体NaCl至质量浓度为2%，再加乙醇至质量浓度为50%，8-10℃沉淀过夜。移走上清，得沉淀。
沉淀在烘箱中以70℃烘干，即为舒洛地特药物原料（DS20%，快肝素80%，效价69usp u/mg,比旋+35°）。
实施例二
取实施例一的原料、第一次沉淀后产物、第二次沉淀后产物、第三次沉淀后产物（终产物）等做琼脂糖凝胶电泳分析，方法参照专利“一种玻载电泳法分析粘多糖的方法 200910040788.8”。结果如图1所示，M表示肝素副产物原料，原料中含有CS、DS、快肝素、慢肝素，经过第一次沉淀去除了慢肝素，经过第二次沉淀，将DS含量降低，经过第三次沉淀去除CS，得到最终产物：DS 20-30%、快肝素70-80%。