一种化学诱导玉米孤雌生殖的处理方法.pdf

一种化学诱导玉米孤雌生殖的处理方法，其特征在于将卷纸加入诱导剂中，经搅拌制成纸浆糊；在吐丝前对雌穗套袋；当花丝抽出时，摘掉纸袋，在雌穗花苞顶部用刀片将基部横向切掉，形成中间是花丝周围是苞叶的圆形断面；用敷料镊夹取纸浆糊，将纸浆糊放在断面上并使其与断面密切接触，填充切后所形成的空间；之后将被扒开的苞叶复回原位，使纸浆糊包在苞叶内。最后将纸袋套回；本发明的积极效果是彻底解决了现有化学诱导处理方法难以解决的花粉污染问题；避免了对人体健康造成的威胁；诱导操作在完全开放条件下进行；诱导率提高；药液损失小；比常规的选育自交系方法选育周期缩短5代以上。

权利要求书1.  一种化学诱导玉米孤雌生殖的处理方法，其特征在于： （1）纸浆糊的制备 采用生活用卷纸，在诱导剂药液中加入卷纸，经搅拌制成纸浆糊；低毒诱导剂的纸浆糊应尽量地稀，以20cm敷料镊能夹取即可；而剧毒诱导剂的纸浆糊剂则以用20cm敷料镊能夹取，但药液又不至滴落为宜； （2）果穗处理：在吐丝前对雌穗套袋；当花丝吐出时，摘掉纸袋，在雌穗花苞顶部、幼穗以上位置将外部的多层苞叶向下扒开，仅剩下花丝和贴近花丝的内层苞叶，之后用刀片将未被扒开部分在基部横向切掉，形成一个中间是花丝周围是苞叶的圆形断面； （3）施入诱导剂：用镊子夹取纸浆糊，将其放在断面上并使其与断面密切接触，填充切后所形成的空间，之后将被扒开的苞叶复回原位，使纸浆糊包在苞叶内；最后将纸袋套回，完成处理过程； （4）操作条件：操作过程在完全开放条件下进行，不需要密封、遮挡、隔离防止花粉污染的措施。

说明书一种化学诱导玉米孤雌生殖的处理方法
技术领域
本发明属于玉米育种技术领域，特别是玉米自交系的选育方法。
背景技术
选育玉米自交系的常规方法，育成一个自交系至少需要经过连续7代以上的自交才能达到基因型纯合，对于遗传背景复杂的材料所需的代数要更多。为了加快自交系的选育速度，缩短育种周期和提高纯度，国内外通常采用的方法主要有Stock 6遗传诱导单倍体法和化学诱导孤雌生殖法：
1.Stock 6诱导法
用遗传诱导系Stock 6给被诱导的对象授粉，诱导玉米产生单倍体种子。之后再用秋水仙素等染色体加倍处理剂将其加倍成二倍体植株。此方法被认为是目前世界上最先进的方法。然而，仍存在以下问题：
(1)诱导产生的少量单倍体种子，需要利用标记性状对整个穗上的种子逐粒进行筛选，从中挑选出真正是通过诱导产生的单倍体种子，淘汰双受精种子。因此，工作量大、效率低、人工挑选枯燥乏味，难以实现机械化；
(2)对于一部分诱导对象，由于遗传背景、成熟度、籽粒形状、果皮厚度等原因，还存在显色效果不佳甚至不显色问题，因此难以辨认；
(3)由于用Stock 6诱导产生的种子属于单倍体，须再经过染色体加倍才能成为正常的二倍体，而加倍过程繁琐、加倍率又低；
(4)在利用秋水仙素对单倍体种子或幼苗进行染色体加倍时，处理后的废液属于剧毒、高致癌物质，需要严格的无害化处理；
(5)使用Stock 6遗传诱导方法，需要用人工授粉来完成。为了使诱导系与被诱导对象的花期相遇，要进行错期播种，调节父、母本的开花时间。但是，往往由于试验材料对光、温的反应不同，或因土壤、肥力差异而常常发生花期不遇。
2.秋水仙素诱导法
在玉米吐丝期，用秋水仙素作为染色体加倍处理剂处理花丝，使其不经过双受精而是通过孤雌生殖直接产生纯合的二倍体种子。
秋水仙素是常用的染色体加倍处理剂，其突出优点是诱导率高，因此在教学和科研中被广泛使用。然而，尽管秋水仙素诱导玉米孤雌生殖已是一种成熟的玉米自交系选育技术。但是该方法主要存在两大问题，使其难以在育种上规模化应用：
一是安全问题。秋水仙素属于剧毒试剂，致癌性强，对人体健康威胁大。因此现有技术均采取涂抹花丝或向花丝注射的方法。但是，涂抹时极易造成刮碰和药液滴落；注射时由于花丝间的空隙很小，用量难以掌握，因此极易造成药液溢出和流淌，对人体健康存在威胁。
二是花粉污染问题。处理时，即使在严格的套袋条件下操作，或遮挡，或避开散粉时间，但花粉污染也非常严重，产生大量假种子，特别是在海南气候条件下。
此外，由于花丝生长紧密，注射时对药液的容纳量少，大量花丝不容易接触到药液。又由于花丝亲水性差，涂抹时难以附着，处理效果不理想；为了安全使用秋水仙素，对处理的要求极其严格，操作十分谨慎。因此，速度慢、效率低，难以规模化应用。
3.低毒的化学试剂诱导法
用低毒的、具有诱导染色体加倍作用的化学试剂替代秋水仙素，诱导孤雌生殖产生二倍体种子。这些试剂主要有氟乐灵、甲基胺草磷、炔苯酰草胺等，解决了秋水仙素诱导对人畜安全的问题。与Stock 6诱导单倍体方法相比，具有程序简化、方法简单、操作容易、成本低、效率高等优点；
但是，这种用低毒化学试剂诱导的方法，虽然避免了秋水仙素对人体健康的安全问题。而在诱导剂的使用方法上，现有技术均采用向花丝注射、涂抹或喷雾的方法。而这些方法必须在严格的、绝对隔离条件下操作，特别是喷雾时要求更高，但实践操作中却难以做到。因此，花粉污染严重，经常产生大量的假种子，使其规模化应用受到限制。此外，也同样存在不是所有花丝都能接触到诱导剂，以及药液容纳量少和诱导剂停留时间短的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题：一是彻底解决在诱导处理操作中大量产生的花粉污染问题，不再产生假种子；二是可使所有花丝都能接触到药液，并延长药 液在花丝上的停留时间，进而提高诱导效果；三是可避免涂抹或注射方法产生的药液大量流淌，以及喷雾造成的药液浪费，降低了成本；四是简化处理程序，提高诱导率，减少诱导剂用量，使操作简单、易于规模化应用。
本发明采用的技术方案如下：
1.配制诱导剂
用低毒的氟乐灵、甲基胺草磷或炔苯酰草胺配制诱导剂，及以其复配而成的诱导剂；或用秋水仙素(COL)配制诱导剂，或以秋水仙素为主与二甲基亚砜(DMSO)复配而成的诱导剂。
2.制备纸浆糊 
采用生活用卷纸，将卷纸和诱导剂药液加入容器中，搅拌成稀的纸浆糊，其稀稠程度以用20cm敷料镊能夹取即可。对于秋水仙素诱导剂则要稠些，以用20cm敷料镊能夹取但药液又不至滴落为宜。
3.诱导前的果穗处理
在吐丝前对雌穗套袋；当大部分花丝吐出时，摘掉纸袋，在雌穗花苞顶部、幼穗以上的位置，将外部的多层苞叶向下扒开，仅剩下花丝和贴近花丝的内层苞叶，之后用刀片将未被扒开部分在基部横向切掉，形成一个中间是花丝周围是苞叶的圆形断面；
4.施入诱导剂
用20cm敷料镊夹取纸浆糊，将其放在断面上并使其与断面密切接触，填充切割后所形成的空间，之后将被扒开的苞叶复回原位，使纸浆糊包在苞叶内。最后将纸袋套回，完成处理过程。
由于纸浆糊充满药液，加之鲜嫩的苞叶保湿保水能力较强，可使花丝较长时间保持与药液接触；又由于花粉遇到处理液后会因吸收药液而膨胀死亡，断面上即使有花粉落入也不会造成任何污染。因此，彻底解决了花粉污染问题，确保种子真实可靠。处理时，不需要密封、遮挡或时间隔离，整个过程在完全开放条件下自由操作。
5.鉴定与繁殖 
种子成熟时收获，即得到基因型纯合的二倍体种子；下一季播种，按常规方法套袋自交，根据表型进行真伪和优劣鉴定，淘伪劣植株，得到单穗。并可以其作父 本提前测配；将收获的果穗继续播种下一代，种成穗行,根据植株、果穗、籽粒等性状的一致性鉴别出纯合穗行，选择符合育种目标的穗行，即获得纯合的玉米自交系。在此世代可进行大量测配。
本发明的积极效果如下：
1.彻底解决了现有化学诱导方法的花粉污染问题
由于半固态的含有大量处理液的纸浆糊覆盖了花丝和整个切面，即使有花粉落入也会因花粉遇到处理液后而膨胀死亡。因此，彻底解决了现有的化学诱导技术中难以解决的花粉污染问题。
2.操作时无需任何隔离
诱导处理时不需要在套袋、遮挡、隔离区或时间隔离条件，可在完全开放条件下和在任何时间里自由操作。
3.诱导率提高 
使所有花丝的断面都能与药液接触，避免了注射法和涂抹法与药液接触少的问题。又使药液停留时间延长，因而提高了诱导率。
4.可规模化应用 
程序简便，操作简单容易，不受隔离区限制，因此可规模化应用。
5.节省药液
药液集中，不发生注射法、涂抹法和喷雾法的药液流淌、滴落、雾滴飘散等药液浪费，降低了用药成本。
6.程序简单
直接形成二倍体种子。不需要Stock 6诱导单倍体技术的染色体加倍、种子鉴别程序，不存在种子鉴别难的问题。
7.选育速度快 
比常规玉米自交系选育方法的选育周期缩短5代以上。由于可确保诱导结籽的真实性，因此从单株世代开始就可以其作父本提前测配，杂交种选育速度比Stock 6诱导技术还要提前1代。
具体实施方式
实施例1
(1)配制诱导剂
选用市场上销售的48％浓度氟乐灵，用水稀释成80μmol/L浓度的诱导剂。
(2)制备纸浆糊 
采用市场上出售的生活用卷纸，将适量的卷纸和诱导剂药液加入容器中，搅拌成稀的纸浆糊，其稀稠程度以用20cm敷料镊能夹取即可。
(3)选择处理材料 
处理对象为玉米杂交种“辽单565”。
(4)处理果穗
在吐丝前对雌穗套袋；当花丝完全吐出时，摘掉纸袋，在雌穗花苞顶部、幼穗以上位置将外部的多层苞叶向下扒开，仅剩下花丝和贴近花丝的内层苞叶，之后用刀片将其未被扒开部分在基部横向切掉，形成一个中间是花丝周围是苞叶的圆形断面。
(5)施入诱导剂 
用20cm敷料镊夹取纸浆糊，将尽量多的纸浆糊放在断面上并使其与断面密切接触，填充切后形成的空间，之后将被扒开的苞叶复回原位，使纸浆糊包在苞叶内。最后将纸袋套回，完成处理过程。处理50穗。
(6)收获
成熟时收获果穗，收获90粒种子，做好标记。
(7)鉴定与繁殖 
在下一季将种子单粒播种，淘汰不符合选育目标的单株，套袋自交，获得70个果穗。同时以其作父本进行测配；将收获的果穗继续播种下一代，种成70个穗行，每穗行50株,套袋自交。同时进行测配。根据植株、果穗、籽粒等性状的整齐度，性状是否符合选育目标，以及测配结果而选优。选留50个穗行，即50份纯合的玉米自交系材料。至此完成自交系的选育过程。
实施例2
(1)配制诱导剂
选用市场上销售的氟乐灵，将48％浓度氟乐灵用水稀释成90μmol/L浓度的诱导剂。
(2)制备纸浆糊 
采用市场上出售的生活卷纸，将卷纸和诱导剂药液加入容器中，搅拌成稀的纸浆 糊，其稀稠程度以用20cm敷料镊能夹取为宜。
(3)选择处理材料 
处理对象为糯玉米杂交种“沈糯3号”。
(4)处理果穗
在吐丝前对雌穗套袋；当大部分花丝完全吐出时，摘掉纸袋，在雌穗花苞顶部、幼穗以上位置将外部的多层苞叶向下扒开，仅剩下花丝和贴近花丝的内层苞叶，之后用刀片将其未被扒开部分在基部横向切掉，形成一个中间是花丝周围是苞叶的断面。
(5)施入诱导剂 
用20cm敷料镊夹取纸浆糊，将尽量多的纸浆糊放在断面上并使其与断面密切接触，填充切后形成的空间，之后将被扒开的苞叶复回原位，使纸浆糊包在苞叶内。最后将纸袋套回，完成处理过程；处理50穗。
(6)收获
成熟时收获果穗，获得70粒种子，做好标记。
(7)鉴定与繁殖 
在下一季将种子单粒播种，淘汰不符合选育目标的单株，套袋自交，获得50个果穗。同时以其作父本进行测配；将收获的果穗继续播种下一代，种成50个穗行，每穗行50株,套袋自交。同时进行测配。根据植株、果穗、籽粒等性状的整齐度，性状是否符合选育目标，以及以及测配结果而选优。选留40个穗行，即40份纯合的玉米自交系材料。至此完成自交系的选育过程。
实施例3
(1)配制诱导剂
选用市场上销售的含量50％炔苯酰草胺可湿性粉剂，用水稀释成浓度为40μmol/L的诱导剂。
(2)制备纸浆糊 
采用市场上出售的生活用卷纸，将卷纸和诱导剂药液加入容器中，搅拌成稀的纸浆糊，其稀稠程度以用20cm敷料镊能夹取为宜。
(3)选择处理材料 
处理对象为爆裂玉米杂交种“沈爆3号”。
(4)处理果穗
在吐丝前对雌穗套袋；当大部分花丝完全吐出时，摘掉纸袋，在雌穗花苞顶部、幼穗以上位置将外部的多层苞叶向下扒开，仅剩下花丝和贴近花丝的内层苞叶，之后用刀片将其未被扒开部分在基部横向切掉，形成一个中间是花丝周围是苞叶的圆形断面。
(5)施入诱导剂 
用镊子夹取纸浆糊，将纸浆糊放在断面上并使其与断面密切接触，填充切后所形成的空间，之后将被扒开的苞叶复回原位，使纸浆糊包在苞叶内。最后将纸袋套回，完成处理过程。处理60穗。
(5)收获
成熟时收获果穗，获得65粒种子，做好标记。
(6)鉴定与繁殖 
在下一季将种子单粒播种，淘汰不符合选育目标的单株，套袋自交，获得55个果穗。同时以其作父本进行测配；将收获的果穗继续播种下一代，种成55个穗行，每穗行50株,套袋自交。同时进行测配。根据植株、果穗、籽粒等性状的整齐度，性状是否符合选育目标，以及测配结果而选优。选留40个穗行，即40份纯合的玉米自交系材料。至此完成自交系的选育过程。
实施例4
(1)配制诱导剂
选用市场上销售的48％浓度的氟乐灵，将其用水稀释成100μmol/L浓度的诱导剂。
(2)制备纸浆糊 
采用市场上出售的生活用卷纸，将卷纸和诱导剂药液加入容器中，搅拌成稀的纸浆糊，其稀稠程度以用20cm敷料镊能夹取为宜。
(3)选择处理材料 
处理对象为玉米杂交种“先玉335”。
(4)处理果穗
在吐丝前对雌穗套袋；当花丝完全吐出时，摘掉纸袋，在雌穗花苞顶部、幼穗以上位置将外部的多层苞叶向下扒开，仅剩下花丝和贴近花丝的内层苞叶，之后用 刀片将其未被扒开部分在基部横向切掉，形成一个中间是花丝周围是苞叶的圆形断面。
(5)施入诱导剂 
用20cm敷料镊夹取纸浆糊，将尽量多的纸浆糊放在断面上并使其与断面密切接触，填充切后所形成的空间，之后将被扒开的苞叶复回原位，使纸浆糊包在苞叶内。最后将纸袋套回，完成处理过程。处理60穗。
(6)收获
成熟时收获果穗，收获75粒种子，做好标记。
(7)鉴定与繁殖 
在下一季将种子单粒播种，淘汰不符合选育目标的单株，套袋自交，获得60个果穗。同时以其作父本进行测配；将收获的果穗继续播种下一代，种成60个穗行，每穗行40株,套袋自交。同时进行测配。根据植株、果穗、籽粒等性状的整齐度，性状是否符合选育目标，以及测配结果而选优。选留40个穗行，即40份纯合的玉米自交系材料。至此完成自交系的选育过程。
实施例5
(1)配制诱导剂
以浓度0.2％秋水仙素和浓度2％二甲基亚砜复配成诱导剂处理液。
(2)制备纸浆糊 
采用市场上出售的卷纸，将卷纸和诱导剂药液加入容器中，搅拌成纸浆糊。由于秋水仙素剧毒，因此纸浆糊则应稍稠些，以用20cm敷料镊能夹取但药液又不至滴落为宜。
(3)选择处理材料 
处理对象为玉米杂交种“郑单958”。
(4)处理果穗
在吐丝前对雌穗套袋；当花丝完全吐出时，摘掉纸袋，在雌穗花苞顶部、幼穗以上位置将外部的多层苞叶向下扒开，仅剩下花丝和贴近花丝的内层苞叶，之后用刀片将其未被扒开部分在基部横向切掉，形成一个中间是花丝周围是苞叶的断面。
(4)施入诱导剂 
由于秋水仙素有剧毒，用20cm敷料镊小心夹取纸浆糊，将尽量多的纸浆糊放在断面上并使其与断面密切接触，填充切后所形成的空间，之后将被扒开的苞叶复回原位，使纸浆糊包在苞叶内。最后将纸袋套回，完成处理过程；处理50穗。
(5)收获
成熟时收获果穗，取下65粒种子，做好标记。
(6)鉴定与繁殖 
在下一季将种子单粒播种，淘汰不符合选育目标的单株，套袋自交，获得60个果穗。同时以其作父本进行测配；将收获的果穗继续播种下一代，种成60个穗行，每穗行45株,套袋自交。同时进行测配。根据植株、果穗、籽粒等性状的整齐度，性状是否符合选育目标，以及测配结果而选优。选留35个穗行，即35份纯合的玉米自交系材料。至此完成自交系的选育过程。
上述各实施例中选用的处理材料玉米种子均为市场销售。