一种草金鱼腹鳍细胞系的构建方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种草金鱼腹鳍细胞系的构建方法。
背景技术
鱼类细胞系经过多年的发展，各种淡水、海水鱼类细胞系已成为多种学科领域重要的体外研究体系，许多重要实验和新技术都需要在鱼类细胞系的基础上进行进一步研究。鱼类细胞系的应用范围日益广泛，已从最初的病毒分离、提纯、鉴定、体外繁殖扩展到环境污染物致毒机理及其监测、鱼类免疫、种质改良、资源保护等诸多领域。鱼类细胞系不但可作为在细胞生物学、鱼类病毒学、鱼类生理学、鱼类免疫学、环境毒理学、鱼类遗传学、药理学等多种学科进行基础研究的良好的体外研究体系，还可在鱼类病毒疫苗研制，环境污染物毒性检测，鱼类基因工程育种，鱼类组织胚胎研究，珍稀鱼类资源保护，天然活性物质开发等领域进行应用研究。无论在理论研究方面，还是实际应用方面，都具有深远意义。
观赏鱼的饲养在我国具有悠久的历史，其中草金鱼是我国观赏鱼中养殖量和出口规模最大的品种之一。草金鱼(Carassius auratus)隶属于鲤型目(Percoiformers)、鲤科(Sparidae)、鲫属(Carassius)。Wolf和Quimby在20世纪60年代建立了世界上第一株鱼类细胞系，即虹鳟鱼生殖腺细胞系RTG-2。目前已经报道的鱼类细胞系有300余种(Lakra W S,Swaminathan T R,Joy K P.Development,characterization,conservation and storage of fish cell lines:a review[J].Fish Physiology and Biochemistry,2011,37(1):1-20)。其中已经报道的金鱼的细胞株主要有GFSK-S1金鱼肾脏细胞系(Dicky L Y,Chow B K C,Chan C B,et al.Molecular cloning and expression studies of a prolactin receptor in goldfish(Carassius auratus)[J].Life sciences,2000,66(7):593-605)，GAKS金鱼鳞片细胞系(Akimoto K,Takaoka T,Sorimachi K.Development of a simple culture method for the tissues contaminated with microorganisms and application to establishment of a fish cell line[J].Zoological science,2000,17(1):61-63)，GFM金鱼肌肉细胞系(Rougée L,Ostrander G K,Richmond R H,et al.Establishment,characterization,and viral susceptibility of two cell lines derived from goldfish Carassius auratus muscle and swim bladder[J].Diseases of aquatic organisms,2007,77(2):127)，GH金鱼心脏细胞系(CGMCC NO.9334)，金鱼尾鳍细胞系(Hashimoto H,Toyohara H,Yokoyama Y,et al.Effects of carp serum on the growth of goldfish fin cells in early passage[J].Journal of fish biology,1997,50(1):201-207)。
细胞培养技术是生命科学领域，细胞工程、基因工程和生物医学工程主要的研究手段。鱼类细胞系的构建为鱼类病毒性疾病的病原学研究和病毒的疫苗研究提供了基础的生物学材料具有重要的研究价值。通过细胞株来鉴定和分离敏感病毒株是世界动物卫生组织Office International Des Epizooties(OIE)推荐的最有效方法，通过建立不同种类的鱼类细胞株为鱼类病毒筛选敏感细胞系提供了丰富的生物学材料。目前，已构建的金鱼细胞系如上所述，而关于草金鱼腹鳍细胞系还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种草金鱼腹鳍细胞系的构建方法。
本发明的第二个目的是，提供所述细胞系的用途
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种草金鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)组织块的处理：剪取草金鱼腹鳍组织，于浓度为1000IU/ml青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30m分钟，以75％酒精消毒处理，用浓度为2.5ug/ml的两性霉素B的D-PBS冲洗3次，无菌条件下将腹鳍组织剪成1mm3的组织块，将组织小块浸泡在在0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA中消化10min后，再用0.5％透明质酸酶消化1h；
2)原代培养：将组织块移植到底面积为25cm2的培养瓶中，保持温度为26℃，于组织块移植后的第15小时加入2ml增殖培养液，第24小时加入3ml增殖培养液，每天半量更换培养液一次；
3)传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入胰蛋白酶静置消化，然后用增殖培养液悬起细胞，以1:2进行传代，于26℃进行传代培养。
所述增殖培养液为含有18v/v％胎牛血清、15ng/ml人碱性成纤维生长因子、2ng/ml表皮生长因子、1ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、200IU/ml青霉素、200ug/ml链霉素、0.5ug/ml两性霉素B、10mM 2-巯基乙醇的M199培养液。
所述步骤3中加入的胰蛋白酶浓度为0.25％，消化时间为2min。
分瓶传代后，将培养瓶置于26℃的无二氧化碳的培养箱中培养5天即可长满；稳定传代后，细胞呈典型的成纤维形态；该细胞系是一种特性稳定、成分均一的中国草金鱼腹鳍细胞系，是研究水产动物病毒学和免疫学的良好材料。
进一步地，所述金鱼腹鳍细胞系具有以下生物学特性：
a.原代分离自组织块附近的细胞，呈上皮样细胞，传代稳定后呈纤维样细胞的形态特点；
b.细胞增殖能力强，每一个组织块在处理后3d左右均能分离出大量细胞，均具有连续传代的能力；
c.该细胞系培养条件为26℃恒温细胞培养箱，无需二氧化碳。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的草金鱼腹鳍细胞系在检测疱疹病毒CyHV-2中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明针对草金鱼腹鳍细胞的特征，优化出适合该细胞生长增殖的培养基及适宜的培养条件，成功构建了草金鱼腹鳍细胞系；该细胞繁殖能力强，分瓶传代后培养5天即可长满培养瓶。目前，该细胞系已连续传代至60代以上，可提供大量的草金鱼腹鳍来源细胞。本发明的方法不仅可用于构建腹鳍组织细胞系，该方法还可适用于构建其他部位的鳍组织细胞系(如胸鳍、背鳍、尾鳍等)。
2、本发明所构建的腹鳍细胞系为分子细胞水平上展开鱼类病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等提供了基础。
附图说明
附图1为显微镜下的中国草金鱼腹鳍组织块附近迁移出的细胞(原代培养第3天)。
附图2为显微镜下稳定传代后的中国草金鱼腹鳍细胞系。
附图3为含鲫鱼疱疹病毒Ⅱ感染实验结果。其中，图3(A):正常的草金鱼腹鳍细胞系,scale bar.＝100μm；(B、C)感染鲫鱼疱疹病毒Ⅱ(CyHV-2)的草金鱼腹鳍细胞系scale bar.＝100and 50μm；(D)感染鲫鱼疱疹病毒Ⅱ(CyHV-2)的草金鱼腹鳍细胞系出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE),scale bar.＝100。
附图4为PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
(1)组织块的处理：剪下草金鱼腹鳍，放入浓度为1000IU/ml青霉素-链霉素双抗溶液中(蒸馏水配置)中，放置30min后，于75％酒精中消毒2分钟，进行首次消毒；接着用含2.5ug/ml的两性霉素B的D-PBS冲洗3次，进行二次消毒；冲洗后，在无菌的条件下用剪刀将腹鳍剪成约1mm3的小块，将组织小块浸泡在在0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA中消化10min后，再用0.5％透明质酸酶消化1h；
(2)原代培养：收集消化后的组织小块，移植到底部为25cm2的细胞培养瓶中，保持底部温度为25℃。15小时后，加入2ml草金鱼腹鳍细胞专用增殖培养液(培养液配方为含有18v/v％胎牛血清、15ng/ml人碱性成纤维生长因子、2ng/ml表皮生长因子、1ng/mlI性胰岛素样细胞生长因子、200IU/ml青霉素、200ug/ml链霉素、0.5ug/ml两性霉素B、10mM 2-巯基乙醇的M199培养液)；24小时后，加入3ml草金鱼腹鳍细胞专用增殖培养液，之后每天更换50％的新鲜培养液。
启动原代培养的第3天，显微镜下可以观察到组织块周围有细胞迁出，迁出的细胞数量多，均质透亮，有明显的增殖现象，分裂增殖旺盛(图1)。
(3)传代培养：待原代培养的草金鱼腹鳍细胞单层铺满培养瓶后，吸管清除旧培养液，用PBS清洗两遍，加入1毫升浓度含为0.25％胰蛋白酶，静置消化2min，待显微镜下观察细胞变圆后，加入10ml配置好的专用增殖培养液，反复吹打，制成细胞悬液，以1:2进行传代，加入专用增殖培养液5ml/瓶，放入26℃培养箱中进行传代。
分瓶传代后，于无二氧化碳的培养箱中培养5天即可长满，该细胞系具有较强的繁殖能力。显微镜下观察(图2)，细胞呈典型的成纤维形态，该细胞系是一种特性稳定、成分均一的中国草金鱼腹鳍细胞系，是研究水产动物病毒学和免疫学的良好材料。目前，该草金鱼腹鳍细胞系已传代60代，细胞能稳定增殖，具有连续传代的能力。
对比例1
一、实验方法
1、最适合培养基的确定
将已接种腹鳍组织块的培养瓶中加入含18％胎牛血清(体积比)的L-15、DMEM和M199培养基至5ml/瓶，置于26℃下启动培养，观察细胞的形态、贴 壁性、生长分裂情况。
2、不同培养温度对细胞生长的影响
将已经接种腹鳍组织块的培养瓶中加入含18％胎牛血清(体积比)的M199培养基，分别置于22℃、24℃、26℃、28℃培养箱中进行原代培养，观察不同温度下细胞的迁出、贴壁及增殖情况。
3、不同浓度FBS对细胞生长的影响
为了检测不同浓度的FBS对草金鱼腹鳍细胞生长的影响，在已接种腹鳍组织块的培养瓶中分别加入浓度为14％、16％、18％、20％、22％FBS的M199培养基，置于26℃下启动培养，观察细胞的形态、贴壁性、生长分裂情况。
4、不同生长因子对细胞生长的影响
为了检测不同生长因子对腹鳍细胞生长的影响，在M199的基础上，配置了如下4种含不同培养基，3天后观察不同培养基中细胞的迁出、贴壁及增殖情况。
培养基1：18％FBS(体积比)+15ng/ml bFGF+2ng/ml EGF+1ng/ml IGF；
培养基2：18％FBS(体积比)+15ng/ml bFGF+1ng/ml EGF+1ng/ml IGF；
培养基3：18％FBS(体积比)+15ng/ml bFGF+1ng/ml IGF；
培养基4：18％FBS(体积比)+10ng/ml bFGF+2ng/ml EGF+1ng/ml IGF；
培养基5：18％FBS(体积比)+15ng/ml bFGF+2ng/ml EGF+10mM 2-巯基乙醇+1ng/ml IGF。
二、结果
(1)草金鱼腹鳍细胞组织在分别在L-15、DMEM和M199三种不同培养基中启动原代培养3天后，结果显示(表1)，培养在M199培养基中的的腹鳍组织有大量细胞迁出，迁出的细胞占瓶底面积的12％以上，生长速度快；而培养在L-15和DMEM培养基中的腹鳍组织细胞迁出的数量和细胞生长速度较低。可见M199培养基更适于草金鱼腹鳍细胞系的体外培养。
表1
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注：+表示6天后组织块周围迁出的细胞占培养瓶底面面积的2％。
(2)草金鱼腹鳍组织在不同温度中启动原代培养3天后，结果显示(表2)，在M-199培养基中培养的腹鳍组织在26℃时细胞迁出的数量最多，细胞增殖最 快，明显优于培养于22℃、24℃和28℃的腹鳍组织。可见培养温度为26℃更适合于草金鱼腹鳍组织细胞的体外培养。
表2
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注：+表示6天后组织块周围迁出的细胞占培养瓶底面面积的2％。
(3)草金鱼腹鳍组织在不同FBS浓度的M199培养基中启动原代培养3天后，结果显示(表3)，在浓度为18％FBS的培养基中培养腹鳍组织细胞迁出的数量最多，增殖速度最快，明显由于浓度为14％、16％、20％、22％的FBS培养基。可见培养基中FBS浓度为18％最适合于草金鱼腹鳍组织细胞的体外培养。
表3
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注：+表示6天后组织块周围迁出的细胞占培养瓶底面面积的2％。
(4)草金鱼腹鳍组织在上述不同培养基中启动原代培养3天后，结果显示(表4)，在培养基1和培养基5中培养的腹鳍组织细胞迁出的数量最多，细胞增殖最快，明显优于其它培养基，说明本发明中的增殖培养基不仅能满足草金鱼腹鳍细胞生长，且能有效促进细胞分裂及快速增殖。
表4
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注：+表示3天后组织块周围迁出的细胞占培养瓶底面面积的5％。
对比例2
(1)组织块的处理：方法同实施例1，经胰蛋白酶消化10min后，不经透明质酸酶消化。
(2)原代培养：收集消化后的组织小块，移植到底部为25cm2的细胞培养 瓶中，保持底部温度为25℃。15小时后，加入2ml草金鱼腹鳍细胞专用增殖培养液；24小时后，加入3ml草金鱼腹鳍细胞专用增殖培养液，之后每天更换50％的新鲜培养液。
启动原代培养的第3天，仅有很少的组织块周围有细胞迁出，迁出细胞数量极少，形态与实施例1中迁出的细胞形态略有不同，并且基本观察不到细胞增殖。
实施例2该细胞系应用于鲫鱼疱疹病毒Ⅱ(CyHV-2)的检测
一、实验方法
1、病毒的感染
将已培养好的草金鱼腹鳍细胞系传至6孔板中，隔夜贴壁生长。分别将待检测阳性样品(含鲫鱼疱疹病毒Ⅱ，CyHV-2)和阴性样品(碱性磷酸盐缓冲液，PBS)取500μl感染细胞，孵育1小时后弃去上清，用PBS洗3次，加入完全培养基500μl放置在培养箱中培养，每天观察细胞生长情况。
2、病毒DNA的提取
(1)加入等体积的PBS缓冲液，混合均匀，以8000rpm离心5分钟，弃上清；
(2)加入20μL蛋白酶k.在56℃水浴中保温3小时；
(3)8000rpm离心5分钟，取750μL上清液中于一新离心管中，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)；以50转/分钟的速度混合10分钟，再以8000转/分钟离心5分钟，取650μL上清液于一新离心管中；重复1次；
(4)取600μL上清液于一新离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)。以50转/分钟速度混合10分钟，8000转/分钟离心5分钟；
(5)取480μL上清液于一新离心管中，加入40μL 3mol/L的醋酸钠和960μL4℃的冷却乙醇；轻摇，可见白色絮状物；
(6)在零下20℃放置20-30分钟，后以12000转/分钟离心10分钟，弃去上清液；
(7)用200ul 75％的乙醇洗涤，14000转/分钟离心5分钟，弃上清；重复做一次；
(8)晾干10分钟后用50ul的超纯水洗涤，于零下20℃保存。
3、PCR检测
(1)PCR扩增引物：(根据已报道的CyHV-2病毒系列GenBank号 为:JQ067603.1设计的引物)；
上游引物CyHV-2F(5’-3’)：CTTTAGCGTCAGGTCCATAGAGG
下游引物CyHV-2R(5’-3’)：CGTCAGTCCCTGGCAGAAATAAG
反应体系：
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(2)PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃复性30s，72℃延伸1min，34个循环，最后72℃延伸10min；
(3)琼脂糖凝胶电泳
配置：1.0％琼脂糖胶(50mL TAE buffer，0.5g琼脂糖粉)摇匀，微波炉1min左右沸腾，室温放置2min左右倒至跑胶板中，放置好梳子，室温至胶凝固；
制样：PCR样品5μL；染料(SYBR GREEN)1μL；loading buffer(2×)2.5μL，混匀放置30s左右；
上样：将样品对应加入上样孔中，记录好顺。
(4)跑胶100V 30min左右。
(5)观察拍照记录结果。
4、实验结果
如图3A所示，阴性感染组(未感染病毒)细胞生长良好；图3B，C，感染病毒12天左右收缩形成空泡样；图3D，感染15天左右细胞形成明显的病毒病变现象(CPE)。
PCR检测结果见图4，阳性样品均能扩增得到片段为640bp左右的PCR条带。
以上检测结果表明：该草金鱼腹鳍细胞系能够应用于鲫鱼疱疹病毒Ⅱ(CyHV-2)的检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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