一种1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 【技术领域】
本发明涉及一种具有生理活性的环状氨基酸的合成方法，具体地说是1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法。
背景技术
1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(L-ectoine，CAS号：96702-03-3)是1985年在极端嗜盐外硫红螺菌属地光合紫细菌Halochloris中发现的一种新型环状氨基酸，是耐盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质。随着核磁共振和高效液相等分析技术的应用，越来越多的实验证明1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸不仅是中度嗜盐菌和耐盐菌主要的相容性溶质，在产生放线菌素的微小链霉菌等非嗜盐菌中也可以检测到。
国内外研究表明，1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸能够通过体内合成和体外转运两种途径在细胞内积累，达到调节细胞内外渗透压平衡的作用，在苜蓿中华根瘤菌等菌株中还可以诱导菌株产生一系列与渗透压有关基因的表达，使其合成自身的相容性溶质，如海藻糖、谷氨酸盐等。
在逆境下，1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸对酶、DNA、细胞膜等生物大分子具有很强的保护作用，对一些性质不稳定的酶，如乳酸脱氢酶等保护作用显著，与常见的相容性溶质脯氨酸、甜菜碱相比具有显著的优越性。1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸可以发挥与分子伴侣相似的作用，能够识别错误折叠的蛋白质，并且抑制蛋白质聚合体的形成。
1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的渗透压调节作用及稳定蛋白质水合层，保护酶、DNA等生物大分子和细胞膜结构的作用，可以帮助细胞及动植物抵抗冷冻、干旱、高温、高盐、辐射等各种逆境。在农业、化妆品、食品、医药等领域具有广泛的应用前景。专利文献WO0219978公开了1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸在口腔护理中的应用，专利文献DE102004016129公开了其在皮肤护理及疾病预防中的应用。专利文献WO2006097263公开了其在治疗及预防胃肠道疾病中的应用。
1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸广泛的用途及商业价值受到了广泛关注，其合成方法也得到了不断的改进。其最初的批量生产技术被称为“细菌挤奶”技术，在盐浓度高的环境下诱导细菌合成并蓄积1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，再在低渗透压环境下使其释放1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，通过循环性的升高和降低盐浓度，获得目标产物，产率为3.3g/L/h。该方法工艺复杂，产品收获不具备连续性，较高的盐浓度则对反应容器具有腐蚀性，并且菌株合成的产物均在细胞内，其合成受到1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸浓度阈值的限制，浓度达到一定值，合成即受到抑制。
针对上述问题，Torsten等发明一种利用转基因非嗜盐菌连续合成分泌1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的方法，产率达到40mg/L/h(Continuous Synthesis and Excretion of theCompatible Solute Ectoine by a Transgenic，Nonhalophilic Bacterium.Appl EnvironMicrobiol.2007；73(10)：3343-7)。专利文献CN101314785公开了一种利用盐单胞菌属菌株发酵合成1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的方法。产物大部分分泌至培养基中，可以实现连续培养，并将盐浓度降低了1/2至2/3。
然而，迄今为止，1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的合成方法仍是发酵法，尚无关于1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法。这种利用微生物发酵合成1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的方法具有的共同缺陷是：细胞生长缓慢、制备工艺复杂，产率较低，很难满足需求。急需一种可大规模进行生产的人工合成方法。
【发明内容】
针对上述现有技术，本发明提供了一种1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法，其工艺简单且产率高，可大规模生产，满足社会的需求。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法，包括以下步骤：
(1)N-乙酰化二氨基丁酸的合成反应：
取4-硝基苯酚醋酸酯、无机碱，混合，加入到L-2，4-二氨基丁酸水溶液中进行反应，边反应边搅拌，生成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物，其中，L-2，4-二氨基丁酸、无机碱与4-硝基苯酚醋酸酯的摩尔比为1∶(2.0～5.0)∶(1.0～3.0)，反应温度为20℃～70℃，搅拌速度为50～100rpm，反应时间为8～20小时；
反应完成后，用CH2Cl2进行萃取，得萃取液，然后干燥，减压蒸馏，30℃～70℃下真空干燥，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物；
(2)1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的合成反应：
将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于极性有机溶剂，然后加入三乙胺，三乙胺与L-2，4-二氨基丁酸的摩尔比为2∶1，加热回流36～60小时，减压蒸去有机溶剂，然后用柱层析进行纯化，即得到1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸。合成反应式如下：
所述步骤(1)中，无机碱选自NaOH、KOH、Ca(OH)2中的任一种。
所述步骤(1)中，反应温度为25℃～35℃，反应时间为10～16小时。
所述步骤(2)中，极性有机溶剂选自正丁醇、乙醇、甲醇中的任一种。
所述步骤(2)中，加热回流的温度为80℃～120℃。
所述步骤(2)中，柱层析的流动相为正丁醇/乙酸/水，体积比为12∶3∶5。
所述步骤(2)中，柱层析的吸附剂为200～300目硅胶。
本发明的基本原理是：首先利用4-硝基苯酚醋酸酯与L-2，4-二氨基丁酸反应生成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸，然后通过2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸反应生成1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸。
本发明的合成工艺步骤简单，环境污染小，收率可达50％～70％，适于工业化生产。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1 人工合成制备1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，步骤如下：
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(3.62g，20mmol)与NaOH(1.68g，40mmol)混合，加入到200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0.1mmol/ml)，25℃下80rpm搅拌14小时，反应完成后，以CH2Cl2进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH2Cl2及剩余的4-硝基苯酚醋酸酯，50℃下真空干燥4小时，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物。
(2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于80ml正丁醇，加入2g三乙胺，80℃加热回流48小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸/水(体积比为12∶3∶5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。
采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，数据如下：
1H NMR(300MHz，D2O)：2.23ppm(s，3H，CH3-C＝N)，2.09ppm(m，2H，-CH2-CH-N)，3.42ppm(m，2H，NH-CH2-)，4.16ppm(t，1H，N-CH-CO2H)；
13C NMR(300MHz，D2O)：17.4ppm(q，CH3)，21.8ppm(t，CH2-CH-N，1JCH＝130Hz)，38.3ppm(t，NH-CH2-，1JCH＝145Hz)，51.4ppm(d，CH-CO2H)，167.23ppm(s，C＝N)，179.4ppm(s，C＝O)；
ESI-MS(M/Z)：142(M+.)，97(M+.-CO2H)。
高效液相色谱对1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)，流速为1.0ml/min，吸收波长为210nm，测得产率为54％，纯度为95％。
实施例2 人工合成制备1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，步骤如下：
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(5.43g，30mmol)与KOH(2.25g，40mmol)混合，加入到200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0.1mmol/ml)，25℃下80rpm搅拌12小时，反应完成后，以CH2Cl2进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH2Cl2及剩余的4-硝基苯酚醋酸酯，50℃下真空干燥4小时，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物。
(2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于100ml乙醇，加入2g三乙胺，120℃加热回流48小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸/水(体积比为12∶3∶5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。
采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，数据如下：
1H NMR(300MHz，D2O)：2.23ppm(s，3H，CH3-C＝N)，2.09ppm(m，2H，-CH2-CH-N)，3.42ppm(m，2H，NH-CH2-)，4.16ppm(t，1H，N-CH-CO2H)；
13C NMR(300MHz，D2O)：17.4ppm(q，CH3)，21.8ppm(t，CH2-CH-N，1JCH＝130Hz)，38.3ppm(t，NH-CH2-，1JCH＝145Hz)，51.4ppm(d，CH-CO2H)，167.23ppm(s，C＝N)，179.4ppm(s，C＝O)；
ESI-MS(M/Z)：142(M+.)，97(M+.-CO2H)。
高效液相色谱对1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)，流速为1.0ml/min，吸收波长为210nm，测得产率为62％，纯度为87％。
实施例3 人工合成制备1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，步骤如下：
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(5.43g，30mmol)与NaOH(1.68g，40mmol)混合，加入到200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0.1mmol/ml)，30℃下80rpm搅拌14小时，反应完成后，以CH2Cl2进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH2Cl2及剩余的4-硝基苯酚醋酸酯，50℃下真空干燥4小时，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物。
(2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于80ml正丁醇，加入2g三乙胺，120℃加热回流36小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸/水(体积比为12∶3∶5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。
采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，数据如下：
1H NMR(300MHz，D2O)：2.23ppm(s，3H，CH3-C＝N)，2.09ppm(m，2H，-CH2-CH-N)，3.42ppm(m，2H，NH-CH2-)，4.16ppm(t，1H，N-CH-CO2H)；
13C NMR(300MHz，D2O)：17.4ppm(q，CH3)，21.8ppm(t，CH2-CH-N，1JCH＝130Hz)，38.3ppm(t，NH-CH2-，1JCH＝145Hz)，51.4ppm(d，CH-CO2H)，167.23ppm(s，C＝N)，179.4ppm(s，C＝O)；
ESI-MS(M/Z)：142(M+.)，97(M+.-CO2H)。
高效液相色谱对1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)，流速为1.0ml/min，吸收波长为210nm，测得产率为67％，纯度为99％。
实施例4 人工合成制备1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，步骤如下：
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(5.43g，30mmol)与NaOH(1.68g，40mmol)混合，加入到200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0.1mmol/ml)，30℃下80rpm搅拌20小时，反应完成后，以CH2Cl2进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH2Cl2及剩余的4-硝基苯酚醋酸酯，60℃下真空干燥4小时，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物。
(2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于80ml正丁醇，加入2g三乙胺，80℃加热回流60小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸/水(体积比为12∶3∶5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。
采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，数据如下：
1H NMR(300MHz，D2O)：2.23ppm(s，3H，CH3-C＝N)，2.09ppm(m，2H，-CH2-CH-N)，3.42ppm(m，2H，NH-CH2-)，4.16ppm(t，1H，N-CH-CO2H)；
13C NMR(300MHz，D2O)：17.4ppm(q，CH3)，21.8ppm(t，CH2-CH-N，1JCH＝130Hz)，38.3ppm(t，NH-CH2-，1JCH＝145Hz)，51.4ppm(d，CH-CO2H)，167.23ppm(s，C＝N)，179.4ppm(s，C＝O)；
ESI-MS(M/Z)：142(M+.)，97(M+.-CO2H)。
高效液相色谱对1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)，流速为1.0ml/min，吸收波长为210nm，测得产率为67％，纯度为97％。
实施例5 人工合成制备1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，步骤如下：
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(3.62g，20mmol)与NaOH(1.68g，40mmol)混合，加入到200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0.1mmol/ml)，30℃下80rpm搅拌14小时，反应完成后，以CH2Cl2进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH2Cl2，60℃下真空干燥4小时，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物。
(2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于100ml甲醇，加入2g三乙胺，110℃加热回流60小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸/水(体积比为12∶3∶5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。
采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，数据如下：
1H NMR(300MHz，D2O)：2.23ppm(s，3H，CH3-C＝N)，2.09ppm(m，2H，-CH2-CH-N)，3.42ppm(m，2H，NH-CH2-)，4.16ppm(t，1H，N-CH-CO2H)；
13C NMR(300MHz，D2O)：17.4ppm(q，CH3)，21.8ppm(t，CH2-CH-N，1JCH＝130Hz)，38.3ppm(t，NH-CH2-，1JCH＝145Hz)，51.4ppm(d，CH-CO2H)，167.23ppm(s，C＝N)，179.4ppm(s，C＝O)；
ESI-MS(M/Z)：142(M+.)，97(M+.-CO2H)。
高效液相色谱对1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)，流速为1.0ml/min，吸收波长为210nm，测得产率为59％，纯度为94％。