利用大肠杆菌表达抗菌肽APIDAECIN和制备抗菌肽APIDAECIN的方法.pdf

本发明涉及一种利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin和制备抗菌肽apidaecin的方法，将AP2基因和多角体基因序列polh克隆入重组载体中形成带有polh-AP融合基因片段的重组载体；接着polh-AP融合基因片段克隆入表达载体，将表达载体转化表达宿主细胞，表达宿主细胞经培养表达带有所述抗菌肽AP2的融合蛋白。将表达宿主细胞进行培养，诱导重组蛋白polh-AP的表达，将诱导后的菌株离心收集，重悬后超声波破碎，离心收集不溶性包涵体，纯化收集重组蛋白样品。与现有技术相比，该表达系统培养程序简单，生产成本低，能高效的表达抗菌肽apidaecin，且使得AP2与polh融合表达，不仅有效降低AP2对大肠杆菌的毒性，提高抗菌肽的稳定性，让抗菌肽高水平表达，且方便纯化处活性抗菌肽，提高抗菌肽apidaecin的产量。

1.  一种利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：将如SEQID NO.1所述的AP2基因克隆入重组载体中，形成带有AP2基因的重组载体，然后将表达BmNPV的多角体基因序列polh克隆入所述带有AP2基因的重组载体中AP2基因的上游，即形成带有polh-AP融合基因片段的重组载体；接着polh-AP融合基因片段克隆入表达载体，得到带有polh-AP融合基因片段表达载体，将该带有polh-AP融合基因片段表达载体转化表达宿主细胞，表达宿主细胞经培养，表达带有所述抗菌肽AP2的融合蛋白。

2.  如权利要求1所述的利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：所述克隆载体为pUC57，则所述带有AP2基因的重组载体为pUC57-AP，所述带有polh-AP2融合基因片段的重组载体为pUC57-polh-AP；所述表达载体为pET30，则所述带有polh-AP融合基因片段表达载体为pET-polh-AP。

3.  如权利要求2所述的利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：在所述AP2基因的上游加入羟胺裂解位点编码序列，然后在该基因片段的5’端加入EcoR I，3’端加入Xho I，合成后克隆入所述pUC57。

4.  如权利要求2所述的利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：从BmNPV基因组中PCR所述多角体基因序列polh，PCR克隆的正向引物为带Nco I酶切位点的5’-AACCCATGGATATGCCGGATTATTCATAC-3’，反向引物为带EcoR I酶切位点的5’-TCGTGAATTCATACGCCGGACCAG TG-3’。

5.  如权利要求1～4任一权利要求所述的利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：所述克隆宿主细胞为E.Coli DH5α，所述表达宿主细胞为E.Coli BL21。

6.  一种制备抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：培养如权利要求5所述的E.ColiBL21，直到菌液的OD600达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，诱导重组蛋白polh-AP的表达，将诱导后的菌株离心收集，用pH为7.8的PBS进行重悬，再超声波破碎，把破碎后的菌液离心，收集不溶性包涵体，纯化收集重组蛋白样品。

7.  如权利要求6所述的制备抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：纯化收集重组蛋白样品的过程中，首先使用pH为9的PBS进行重悬浮，震荡溶解30min，离心收集不溶性包涵体，然后将收集的不溶性包涵体继续用pH为12的PBS进行重悬浮，震荡溶解30min，离心收集溶解后的蛋白，将所得蛋白溶液的pH调节到7.8，室温静置2h，离心收集沉淀的蛋白质。

8.  如权利要求7所述的制备抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：将所得重组蛋白的浓度调整为15mg/ml，然后将该重组蛋白溶液与3倍体积的羟氨裂解反应缓冲液混合，55℃孵育24h,polh-AP融合蛋白裂解得裂解反应样品，将该裂解反应样品用20mMPBS透析、离心，获得AP上清，冻干保存。

利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin和制备抗菌肽apidaecin的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种通过大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin和制备抗菌肽apidaecin的方法。
背景技术
近年来抗生素的大量滥用已使我国畜牧养殖业走向恶性循环，严重威胁着我们的食品安全和人类健康。抗菌肽是由生物体基因之间编码产生的一类能抵抗外界病原体感染的小分子肽，具有理化性质稳定、无免疫原性、抗菌谱广等特性，其抗菌活性和抗菌效应与抗生素非常接近，在替代抗生素方面显示了巨大的潜力。apidaecin是一类富含脯氨酸的抗菌肽，由于其独特的抑菌作用机制而备受关注，研究表明，apidaecin能特异地作用于革兰氏阴性菌，对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌和乙酸钙不动杆菌等致病菌均具有普遍的杀伤作用。因此，apidaecin对解决因革兰氏阴性菌而导致的抗生素抗性危害不断加重的问题具有特殊意义。
目前，抗菌肽可通过以下途径获得：1、从生物体提取纯化；2、化学合成；3、基因工程，其中前两种方法由于成本和技术问题，不适于抗菌肽的工业化生产，基因工程方法是目前最有潜力的途径。Apidaecin已在不同的宿主中表达，如链霉菌、乳酸乳球菌等，Taguchi将apidaecin异构体Hblb(API)的编码基因通过编码Xa特异切割位点的连接子连接于链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂，该融合基因在浅青紫链霉菌菌株中获得了成功的分泌表达；孙超等将apidaecin与泛素融合后在在乳酸乳球菌nisin诱导表达系统中进行表达，纯化后的apidaecin具有抑菌活性；周绪霞等在乳酸乳球菌nisin诱导表达系统中成功分泌表达了具有生物活性的apidaecin。上述表达均存在表达量低，成本昂贵的问题，无法达到实际应用的要求。
大肠杆菌表达系统是一种比较成熟的原核表达系统，apidaecin蛋白在大肠杆菌表达系统中也能获得融合表达，但即使是融合表达，融合状态的apidaecin仍表现出对宿主的毒性，apidaecin表达量越高，宿主细胞的生长越受到限制，即使本底水平表达的apidaecin都会对宿主细胞的生长造成威胁，加上apidaecin分子小，宿主细胞蛋白酶降解导致其绝对产量低，且其在大肠杆菌中过量表达是以包涵体的形式存在，因此其复性、纯化也是难题。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用大肠杆菌高效表达抗菌肽apidaecin的方法。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种产量高的抗菌肽apidaecin的制备方法。
本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：将如SEQID NO.1所述的AP2基因克隆入重组载体中，形成带有AP2基因的重组载体，然后将表达BmNPV的多角体基因序列polh克隆入所述带有AP2基因的重组载体中AP2基因的上游，即形成带有polh-AP融合基因片段的重组载体；接着polh-AP融合基因片段克隆入表达载体，得到带有polh-AP融合基因片段表达载体，该带有polh-AP融合基因片段表达载体转化表达宿主细胞，表达宿主细胞经培养表达带有所述抗菌肽apidaecin的融合蛋白。
上述方案中，所述克隆载体为pUC57，则所述带有AP2基因的重组载体为pUC57-AP，所述带有polh-AP2融合基因片段的重组载体为pUC57-polh-AP；所述表达载体为pET30，则所述带有polh-AP融合基因片段表达载体为pET-polh-AP。
进一步，所述AP2基因的上游加入羟胺裂解位点编码序列，然后在该基因片段的5’端加入EcoR I，3’端加入Xho I，合成后克隆入所述pUC57。
进一步，从BmNPV基因组中PCR克隆所述多角体基因序列polh（Gene ID:787288），PCR的正向引物带Nco I酶切位点：5’-AACCCATGGATATGCCGGATTATTCATAC-3’，反向引物带EcoR I酶切位点：5’-TCGTGAATTCATACGCCGGACCAG TG-3’。
进一步，所述克隆宿主细胞为E.coli DH5α，所述表达宿主细胞为E.coli BL21。
本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：培养带pET-polh-AP克隆的E.coli BL21，直到菌液的OD600达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，诱导重组蛋白polh-AP的表达，将诱导后的菌株离心收集，用pH7.8的PBS进行重悬，再超声波破碎，把破碎后的菌液4℃下15000rpm离心30min，收集不溶性包涵体，纯化收集重组蛋白样品。
上述方案中，纯化收集重组蛋白样品的过程中，首先使用pH9的PBS进行重悬浮，震荡溶解30min，离心收集不溶性包涵体，然后将收集的不溶性包涵体继续用pH12的PBS进行重悬浮，震荡溶解30min，离心收集溶解后的蛋白，将所得蛋白溶液的pH值调节到pH7.8，室温静置2h，离心收集沉淀的蛋白质。
进一步，将所得重组蛋白的浓度调整为15mg/ml，然后将该重组蛋白溶液与3倍体积的羟氨裂解反应缓冲液混合，55℃孵育24h，polh-AP融合蛋白裂解得裂解反应样品，将该裂解反应样品用20mM PBS透析、离心，获得AP上清，冻干保存。
与现有技术相比，本发明的优点在于：与其他原核表达系统相比，大肠杆菌表达系统培养程序简单，生产成本低，能高效地表达抗菌肽apidaecin，且在AP2基因片段上游加入BmNPV的多角体基因序列polh，使得AP2与polh融合表达，不仅有效降低AP2对大肠杆菌的毒性，提高抗菌肽的稳定性，让抗菌肽高水平表达，且利用多角体蛋白的碱溶解性方便纯化处活性抗菌肽，提高抗菌肽apidaecin制备的产量。
附图说明
图1为本发明实施例1中pET-polh-AP表达载体的构建路线图；
图2为本发明实施例2中polh-AP在E.coli BL21中的表达情况示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
材料：
AP2基因片段由上海生工生物工程有限公司合成；
E.coli DH5α和E.coli BL21感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司；
质粒pUC57、pET30和E.coli K88菌株为浙江大学动物科学学院李卫芬教授实验室保存；
IPTG购于上海生工生物工程有限公司。
实施例1：pET-polh-AP表达载体的构建
化学合成AP2基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述，该基因表达的AP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述，合成时在其5’端加入EcoR I位点和羟胺裂解位点编码序列（Asn-Gly），3’端加入Xho I位点。如图1所示，将上述片段嵌入到pUC57中，得到含有AP基因的重组质粒pUC57-AP（生工提供）。从BmNPV基因组中PCR克隆得到多角体基因序列polh（Gene ID:7872889），PCR克隆的正向引物为5’-AACGAATTCATATGCCGGATTATTCATAC-3’（Nco I），反向引物为5’-TCGTGAATTCATACGCCGGACCAGTG-3’（EcoR I）。
扩增体系为：

扩增条件为：94℃预变性5min，然后进入如下循环：
94℃变性50sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，循环重复30次，最后72℃延伸7min，整个反应在4℃停止。扩增的PCR产物经清洗后TA克隆入pMD19T，得到pMD19T-polh。
pMD19T-polh和pUC57-AP分别进行酶切处理并连接，酶切体系为：pUC57-AP/pMD19T-polh DNA10μg，EcoR I1.5μl，10×H buffer10μl，加ddH2O至总体积为100μl。将反应体系置于37℃，酶切2h，割胶回收pUC57-AP和polh的酶切片段，16℃连接5h。连接产物直接热击转化DH5α感受态细胞，具体步骤为：将10μl连接混合物加入到200μl感受态细胞中，混匀，冰上放置30min，置于42℃水浴热击45s，迅速置于冰上2min，然后加入800μlS.O.C培养基，37℃摇床振摇1h，取200μl涂布在含有氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养板上，37℃培养过夜。挑取单克隆菌斑，酶切鉴定筛选得到具有正确连接的重组质粒pUC57-polh-AP。
重组质粒pUC57-polh-AP和pET30同时进行Nco I/Xho I双酶切处理，割胶回收pUC57-polh-AP中的polh-AP片段连接进入pET30中的相应位点，连接条件同上。转化入E.coli DH5α感受态细胞，采用上述热击转化方法。热击后取200μl菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/ml）的LB培养板上，37℃培养过夜。挑取单克隆菌斑，酶切鉴定筛选得到具有正确连接的重组质粒pET-polh-AP，最后进行测序鉴定。
实施例2：polh-AP融合蛋白的表达
将实施例1中所得的表达载体pET-polh-AP转化入E.coli BL21感受态细胞，在含有卡那霉素（50μg/ml）的LB培养板上，37℃培养过夜。挑取单克隆菌斑，置于5ml LB培养试管中，37℃震荡培养10h，作为表达培养的种子。按照1:100的比例放大培养，条件为37℃，150rpm震荡培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，诱导重组蛋白polh-AP的表达。37℃，150rpm震荡培养5h结束表达，并进行SDS检测，结果如图2所示，泳道1为IPTG诱导后5h表达谱，泳道2为未诱导表达谱，泳道3为Mark蛋白表达谱，其中a为polh-AP融合蛋白。
实施例3：polh-AP融合蛋白的纯化和裂解
4℃下，5000rpm离心10min收集实施例2中所得的表达polh-AP融合蛋白的E.coliBL21细胞，用PBS（pH7.8）重悬浮，超声破碎后高速离心（15000rpm，20min）分离不溶性包涵体。所得沉淀接着用PBS（pH9）重悬浮，冰上震荡溶解30min，高速离心 （15000rpm，20min）收集不溶性包涵体，所得沉淀接着再用PBS（pH12）重悬浮，冰上震荡溶解30min，离心收集溶解后的蛋白（离心上清），最后将蛋白溶液用1M盐酸调节pH值至pH7.8，静置2h，离心（15000rpm，20min）收集沉淀的蛋白质。
将得到的重组蛋白样品用PBS（pH12）溶解至终浓度为15mg/ml，将该重组蛋白溶液与3倍体积的羟氨裂解反应缓冲液混合，55℃孵育24h，在此条件下，Polh-AP融合蛋白裂解，形成AP蛋白。然后将裂解反应样品用20mM PBS（pH7.8）4℃透析过夜、离心（15000rpm，20min），polh蛋白形成多角体沉淀，获得含有AP的上清，冻干保存，样品进行抗菌活性检测鉴定。
实施例4：AP2粗制品的抗菌活性检测
挑取E.coli K88单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡，过夜培养至细胞密度为10⁸CFU/mL时，用新鲜灭菌的LB培养基稀释10⁴倍待用。然后取2ml备好的菌液，加入200μl供试蛋白溶液，37℃，200r/min振荡，培养约5h，测OD600，以菌液加200μl无菌的PBS作为阴性对照。以上每个处理设置3个重复，取平均数。
上述供试蛋白包括标准合成的AP2（浓度为5μg/ml），实施例3中获得的AP2粗制品，细胞超声后分离离心步骤获得的可溶性上清（S）和不溶性样品（IS）。检测结果如表1所示，由表1可知AP2粗制品和标准合成的AP2具有抗菌活性，且两者的抗菌活性相近，而S和IS不具有抗菌活性。
实验结果表明，在大肠杆菌表达系统中，与杆状病毒多角体蛋白融合的重组AP2可以高效的表达，且具有简单高密度细胞培养程序、低生产成本、易于对分离包涵体进行纯化等优点，同时与杆状病毒多角体蛋白融合可宿主细胞免受产物毒性，又可以避免蛋白降解，利于纯化。
表1