一种用农杆菌介导对小麦进行基因转化的方法 【技术领域】
本发明涉及生物工程领域中对植物进行基因转化的方法，特别是涉及对小麦进行基因转化的方法，尤其是涉及一种用农杆菌介导对小麦进行基因转化的方法。
背景技术
植物转基因研究源于80年代初期。1983年Zambryski获得了世界上第一例转基因植株，1985年Horch创造了农杆菌转化中的叶盘法，自此以后，分别建立了农杆菌介导法、病毒介导法、PEG介导法、电激穿孔法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法、基因枪法等，转基因成功的物种不断扩大，涉及50多个物种共110多种植物。其中，媒介农杆菌法获得的转基因植物占转基因植物总数的85％以上，基因枪法获得的转基因植物占10％左右。双子叶植物是农杆菌的天然寄主，利用农杆菌Ti质粒介导法，已经建立了多种双子叶植物的基因转移体系，并将一些优良外源基因转入了双子叶植物，育成了转基因品种，但是利用农杆菌介导法对单子叶植物进行基因转化的工作进展相对较慢。
随着对农杆菌感染植物所需环境条件和T-DNA转导机理的深入研究，以及一些强感染力农杆菌菌系(如MOG101、EHA105等)的发现，单子叶植物高效启动子(如玉米Ubil，水稻ActI，大麦Emu等)和适宜选择标记(Bar基因、Hpt基因等)的利用，农杆菌经过一些特殊培养基的预培养(AB、PIM2、AA等)和特殊化学药剂(如乙酰丁香酮、没食子酸、香草醛等)的预处理，在特殊的环境条件下(单糖、低pH值、低温)等，可以感染单子叶植物，如1996年Rhodora等用AB培养基预培养、PIM2培养基(含乙酰丁香酮，AS)预处理农杆菌，以潮霉素为选择剂，将GUS基因、NPTII基因导入了水稻；1996年Hamid等用AA-AS培养基预处理农杆菌，将GUS基因、HPT基因导入了水稻；此外，Chan等(1992)、Hiei(1994，1995)、Rashid等(1996)、Dong等(1996)也获得了转基因水稻，Gould等(1994)、Ishida等(1996)获得了转基因玉米。目前，农杆菌介导的水稻遗传转化技术已非常成功，转化率可达10-40％，农杆菌介导的玉米遗传转化体系也已基本建立。
小麦是最主要地粮食作物之一，但其基因工程育种的研究进程已落后于其它作物。小麦转基因研究开始于80年代初期。1992年Vasil等利用基因枪介导法获得了世界上第一例小麦转基因植株，1994年曾君祉等、成卓敏等利用花粉管通道法分别获得了小麦转基因植株。在以后的几年内，小麦转基因研究基本上借助于基因枪介导法。据统计，到目前为止获得小麦转基因植株的报道中，基因枪法占90％左右，其它方法仅占10％上下。原因在于基因枪介导法的方法相对比较成熟，农杆菌介导法还比较困难。但是，与基因枪介导法相比，农杆菌介导法具有操作简单、成本低、转化效率高、重复性好、可以导入大片段DNA等优点，且导入的基因一般为单拷贝整合，不至于发生基因沉默现象等。然而，小麦农杆菌介导的基因转移一直是世界上的一道难题，虽然Hessd等、Mooney等曾先后做过尝试，但未能获得转基因植株。随着基因分离技术和克隆手段的提高，今后将有更多与小麦改良有关的重要基因被克隆出来。同时，小麦生产中的一些实际问题，如蚜虫、赤霉病、全蚀病、纹枯病、土传病毒病、干旱、盐碱、品质等，基因工程育种可能是最好的解决途径。
病害是小麦生产的主要障碍，小麦的大多数病害属于真菌性病害，将外源抗真菌基因导入小麦是防治小麦病害的途径之一。几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶双价基因GCE控制几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的合成，分别催化几丁质和葡聚糖的水解反应，破坏真菌细胞壁，抑制真菌的生长。核糖体失活蛋白基因RIP促使真菌细胞内的核糖体失去功能，不能合成真菌生长所需要的蛋白质，细胞凋亡抑制蛋白基因IAP和细胞程序化死亡抑制蛋白基因BCL控制生物在受到真菌侵染后迅速产生过敏性坏死，抑制真菌的繁殖和扩展。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种高效、稳定、简便的利用农杆菌介导对小麦进行基因转化的方法。
一种农杆菌介导对小麦进行基因转化的方法，是将小麦愈伤组织与含有Ti质粒载体的农杆菌共培养，所述Ti质粒载体携带一个或多个外源基因，将质粒载体上的外源基因转移到受体基因组中。
所述优选的愈伤组织来自于敏感小麦基因型的幼胚。
所述优选的敏感小麦基因型包括扬麦10号、P187、克丰6号、巴1401051、PM97034和新麦9号。
所述农杆菌优选的是C58c1菌株。
为了使转化效果更高，所述农杆菌在转化前用含下述添加成分的1/10MS培养基进行重悬：4.0mM乙磺酸、100mg/l赖氨酸、50mg/l章鱼碱、2.0g/l谷氨酰胺、2.5g/l脯氨酸、200-500uM乙酰丁香酮、1-5％葡萄糖、4％麦芽糖、0.5-2.0mg/l 2，4-D、0-2.2mg/lpicloram、100mg/l水解乳蛋白。
所述农杆菌感染液浓度以OD650值为0.6-0.8时较好。
共培养过程是，所述小麦愈伤组织与农杆菌在20-24℃条件下黑暗共培养1-3天。
本发明在转化和再生过程中，所述共培养结束后的选择诱导织培养基为含有10.0mg/l G418或3.0mg/l Biolaphos、50mg/l塞孢霉素，50mg/l万古霉素和50mg/lticarcillin的MM培养基；得到的抗性胚性愈伤组织在含有0.5mg/l 2，4-D，25.0mg/lG418或5.0mg/l Biolaphos，50mg/l塞孢霉素，50mg/l万古霉素，50mg/l ticarcillin的MS选择分化培养基上分化；分化的抗性再生芽在含有25.0-50.0mg/l G418或3.0-5.0mg/l Biolaphos，50mg/l塞孢霉素，50mg/l万古霉素，50mg/l ticarcillin的MS选择伸长培养基上伸长。
利用以上建立的农杆菌转化小麦的方法，已经将几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶双价基因GCE、细胞程序化死亡抑制蛋白基因Bcl、细胞凋亡抑制蛋白基因IAP和核糖体失活蛋白基因RIP、新霉素磷酸转移酶基因nptII和草丁膦抗性基因bar导入了扬麦10号、Bobwhite、PM97034和新麦9号等小麦基因型，并对转基因植株进行了PCR、Southern blot、Northern blot、ELISA和叶片涂抹除草剂等检测，转化效率达到了1.5-2.42％。
建立农杆菌介导的高效小麦遗传转化体系，可以大大加快小麦基因工程育种的速度，改变目前基因枪法低效率向小麦转化标记基因或报告基因的局面，加速优良外源基因向小麦中的转移，对改良小麦的抗病性、抗逆性和营养品质等具有重要意义。
下面结合附图对本发明做进一步说明。
【附图说明】
图1为质粒pUbiGCE的物理结构图谱
图2显示获得的转基因植株
图3为RIP基因PCR产物电泳图
图4为质粒pBRI44的物理结构图谱
图5显示转基因植株不同部位GUS基因的表达
图6为基因GCE PCR扩增后的电泳图谱
图7为GCE基因的Southern blot图谱
图8为GCE基因的Northem blot图谱
图9为涂抹了除草剂的转基因植株叶片
图10为nptII基因的ELISA检测结果
图11为基因NPTII PCR扩增后的电泳图谱
图12为Bcl基因PCR扩增后的电泳图谱
图13为Bcl基因的Southern blot图谱
图14为IAP基因的Southern blot图谱
图15为IAP基因的Northern blot图谱
图16为RIP基因的Southern blot图谱
图17为RIP基因的Northern blot图谱
【具体实施方式】
实施例1、用本发明的方法对小麦进行基因转化
1、愈伤组织的获得
将PM97034等小麦品种种植在温室或田间，选取开花后14d左右的未成熟籽粒，70％酒精表面消毒30秒钟，10％次氯酸钠灭菌15分钟，无菌水冲洗3次，剥取大小在1.0-1.5mm的幼胚，平面向上接种在附加2，4-D 0.5-2.0mg/l，picloram 0-2.2mg/l，乙磺酸1.0g/l的MS培养基上，25℃黑暗条件下诱导愈伤组织。
2、基因分离和载体构建
利用常规基因工程的方法将具有控制植物真菌性病害的几丁质酶基因和葡聚糖酶基因串联，以Ubi为启动子，将其插入到质粒pCAMBIA3301(结构图谱如图1所示)上。该质粒上另外含有35S启动子调控的NPTII基因、Bar基因和葡糖苷酸酶基因(GUS)。
3、农杆菌培养
感染前4天从-70℃冰箱中取出农杆菌C58c1，在含有相应抗生素的LB培养基上激活培养3天，然后从LB培养基上刮取少量农杆菌在含有相应抗生素的YEP液体培养基中小量过夜培养，培养温度为28℃，摇床转速为250rpm，然后加入到适量YEP液体培养基中继续振荡培养5-6小时。
4、共培养
C58c1农杆菌液的OD650值达到0.6-0.8时，3500rpm离心10min收集农杆菌，用WCC1液体共培养培养基(1/10MS含4.0mM乙磺酸、100mg/l赖氨酸，50mg/l章鱼碱，2.0g/l谷氨酰胺，2.5g/l脯氨酸，300uM乙酰丁香酮、2％葡萄糖、4％麦芽糖、1mg/l 2，4-D、2mg/l picloram、100mg/l CH，pH值5.0-5.4)重悬农杆菌，使最后的OD值达到0.7。
将预培养4d的小麦幼胚愈伤组织放入到重悬农杆菌液中，22℃条件下感染30min，然后转移到WCC1(2％Gelrite)固体共培养上，22℃条件下黑暗共培养1-3天。
5、愈伤组织选择与植株再生
共培养结束后将愈伤组织转移到选择诱导培养基上(MM培养基含10.0mg/l G418或3.0mg/l Biolaphos，50mg/l塞孢霉素，50mg/l万古霉素，50mg/l ticarcillin)，15-20天后将产生的抗性胚性愈伤组织分割成小颗粒转移到选择分化培养基上(2，4-D用量降低到0.5mg/l，G418或Biolaphos用量相应增加到25.0mg/l或3.0mg/l，其它成分同第一次选择培养基)，22℃光照条件下培养15天后将抗性再生芽分开转移到选择伸长培养基上(无2，4-D，其它成分同第一次选择培养基)，15天后将抗性再生植株转移到选择壮苗培养基上(1/2MS含25.0-50.0mg/l G418或3.0-5.0mg/l Biolaphos、0.15mg/l IBA、0.15mg/l IAA和0.15mg/l NAA)。
6、将经过壮苗培养后的幼苗移栽到温室或田间，得到转基因植株(如图2所示)。
在上述实施例中，小麦的其它品种，如P187、新春9号、克丰6号、巴1401581、高原602、扬麦10号、Bobwhite等均可以通过上述方法获得转基因植株。
在上述实施例中，可以将其它外源功能基因导入小麦染色体上。本发明的发明人根据基因库中核糖体失活蛋白(RIP)基因的序列，利用常规方法设计引物，用PCR扩增法从玉米叶片中分离出了RIP基因(如图3所示)。将RIP基因和细胞凋亡抑制蛋白基因(IAP)构建到了pZP101载体上，其上的NPTII选择标记基因由35S启动子控制，目的基因由Ubi启动子控制。将这2个质粒分别导入到了小麦受体中，得到了转基因植株。本发明的发明人还以PAHC25载体和pIBI121载体为基础，构建了pBRI44(结构图谱如图4所示)和pBRI1120单子叶植物表达载体，其上的选择标记基因bar和NPTII均由Ubi启动子控制，利用这些质粒也得到了转基因植株。本发明的发明人还以pZPl01载体和pIBI121载体为基础，构建了pICBC1904单子叶植物表达载体，其上的NPTII选择标记基因由Ubi启动子控制，GUS报告基因由35S启动子控制，利用该质粒同样得到了转基因植株。
实施例2、转基因植株的GUS表达检测
将实施例1中得到的转基因小麦植株的幼胚、愈伤组织、小穗、叶片、花药及种子浸泡在0.1mM的X-Gluc溶液中，37℃下24小时，然后换入70％酒精中，显微镜下或直接观察GUS基因表达。结果如图5所示，表明GUS基因在转基因植物的幼胚(A)、愈伤组织(B)、小穗(C)、叶片(D)、花药(E)及种子(F)中均得到了稳定表达。
实施例3、NPTII基因的PCR及ELISA检测
按照NPTII基因的序列合成引物，将实施例1中得到的T0代转基因植株进行PCR分析，结果如图11所示，转基因植株具有与阳性对照相同的扩增片段，证明NPTII基因已转入小麦基因组中。
用于nptII ELISA检测的试剂盒由美国agdia公司生产。取100mg叶片，加入5倍体积的蛋白质提取液，充分研磨后用提取液稀释10倍，每个酶标孔中加入100μl，与抗体4℃下反应，24h后洗酶标孔5-6次，充分吸干后加入100μl PBST-MRS酶偶联剂，室温下放置2h，再次洗涤后加入100μl TMB底物反应15min，最后加入50μ13M硫酸终止反应，读取ELISA值。nptII酶作为标准阳性对照，浓度依次为0.10ng/ml，0.19ng/ml，0.38ng/ml，0.75ng/ml，1.50ng/ml和3.00ng/ml。结果如图10所示，证明NPTII基因已在转基因植株内表达。
实施例4、bar基因叶片涂抹除草剂检测
用棉球醮沾25-50mM的Liberty除草剂，涂抹在转基因植株幼嫩叶片的中下部，记号笔予以标记，2-3天后观察，结果证明转基因植株基因组中有bar基因的存在。
实施例5、GCE转基因植株分子检测
按照实施例1的方法，将GCE基因导入到了Bobwhite，根据GCE基因序列合成引物，对T1代转基因植株进行了PCR分析，结果如图6所示，转基因植株具有与阳性对照相同的几丁质酶基因片段。
T1转基因植株的Southern blot(实验方法为常规方法，结果如图7所示)和Northernblot(实验方法为常规方法，结果如图8所示)检测进一证明外源基因已经整合到小麦的基因组中。
实施例6、Bcl转基因植株分子检测
按照实施例1的方法，将Bcl基因导入到扬麦10号中，获得了转基因植株。根据Bcl基因的序列合成引物，对T0代转基因植株进行PCR检测，结果如图12所示，转基因植株具有与阳性对照植株相同的扩增片段，证明Bcl基因已转入小麦基因组中。
T1代Southern blot(实验方法为常规方法，结果如图13所示)表明，外源基因已整合到小麦基因组中。
实施例7、IAP转基因植株分子检测
按照实施例1的方法，农杆菌感染了500个Bobwhite幼胚愈伤组织，经T0代分子检测获得6株转IAP基因植株，转化率为1.20％。T1转基因植株的Southern blot(实验方法为常规方法，结果如图14所示)和Northern blot(实验方法为常规方法，结果如图15所示)检测，进证明外源基因已经整合到小麦的基因组中，并已在转基因植株由DNA转录为RNA。
实施例8、RIP转基因植株分子检测
按照实施例1的方法，Bobwhite转RIP核糖体失活蛋白基因的转化率为1.25％，T1代转基因植株Southern blot(实验方法为常规方法，结果如图16所示)检测和Northern blot(实验方法为常规方法，结果如图17所示)检测分析表明，外源基因已整合到Bobwhite基因组中。
实施例9、转基因植株抗赤霉病鉴定
将转入了GCE及Bcl基因的转基因植株种植在网室大棚内，开花期用微注射管向穗子中部小花注射赤霉病菌混和孢子液(含F4、F15、F17、F34四种高致病菌株)，10uL/小花，1朵/穗，3穗/单株，浓度5000个孢子/mL，自接种后适时弥雾保湿，21天后调查发病小穗数，计算发病小穗率。结果如表1所示，其中，苏麦3号为抗病对照，安农8455为感病对照。从数据中可以看到，GCE-6、GCE-13、GCE-16、GCE-21、Bcl-1、Bcl-18、Bcl-19、Bcl-20、Bcl-21、Bcl-25等对赤霉病具有较强抗性。
表1、 转基因植株接种赤霉病菌鉴定结果
材料 病小穗 总小穗 发病率(％) 材料 病小穗 总小穗 发病率(％)
苏麦3号 186 1123 16.56 Bcl-1 2 19 10.53
安农8455 432 1134 38.1 Bcl-3 7 32 21.88
GCE-1 14 43 32.56 Bcl-5 7 15 46.67
GCE-2 12 21 57.14 Bcl-7 2 15 13.33
GCE-3 19 60 31.67 Bcl-8 3 15 20.00
GCE-5 4 19 21.05 Bcl-9 17 32 53.13
GCE-6 2 19 10.53 Bcl-10 11 31 35.48
GCE-9 18 57 31.58 Bcl-11 9 50 18.00
GCE-10 6 22 27.27 Bcl-14 6 33 18.18
GCE-11 1 21 4.76 Bcl-15 5 36 13.89
GCE-12 2 17 11.76 Bcl-17 9 54 16.67
GCE-13 3 29 7.69 Bcl-18 3 32 9.38
GCE-14 9 21 42.86 Bcl-19 3 32 9.38
GCE-16 1 18 5.56 Bcl-20 2 36 5.56
GCE-18 15 42 35.71 Bcl-21 1 16 6.25
GCE-20 15 36 41.67 Bcl-23 3 15 20.00
GCE-21 2 17 11.76 Bcl-24 2 16 12.50
GCE-22 22 80 27.50 Bcl-25 6 61 9.84
实施例10、转基因植株遗传分析
利用PCR法对GCE转基因植株T1代进行了遗传分析，利用ELISA法分别对Bcl转基因植株T1代和IAP转基因植株T1代进行了遗传分析，结果如表2所示。分离比例为2.00-2.33∶1，平均为2.18∶1。说明用本发明的方法得到的转基因植株可以稳定遗传。
表3转基因植株T1代遗传分析
转基因后代 检测株数 阳性株数 阴性株数 分离比例
GCE 60 40 20 2.00∶1
Bcl 56 38 18 2.11∶1
IAP 100 70 30 2.33∶1