从羊肚菌粗多糖中提取单一多糖的方法及其产品 本发明涉及一种利用离子交换柱层析和凝胶柱层析方法，从羊肚菌中提取具有生物活性的一定分子量，官能团结构确定的纯多糖的方法及其产品。
羊肚菌目前被誉为世界上最名贵的食用菌，属于低温型大型食药兼用菌，早在我国《广菌谱》和《本草纲目》中就被列入“菜部”中，称为羊肚菜。其肉质脆嫩，香甜可口，是食用菌中的珍品之一。现代医学临床表明羊肚菌中含有抗癌的有效成份，具有增强免疫力，抗肿瘤，防衰老等方面的作用而越来越被世人重视。食用菌多糖具有独特的生物学特性而日益受到人们亲睐，如：香菇多糖，槐耳多糖等被用于增强免疫功能，治疗肝炎和肿瘤。由于羊肚菌中多糖的复杂性以及分离和分析方法的种种限制，羊肚菌多糖的种类至今尚未探明，其结构也未完全确定，对羊肚菌多糖的结构与它的药理作用关系的报导也很少。人们对羊肚菌的认识和使用上还停留在原汁原味的剂量大，携带和食用均不方便地营养原液阶段，目前，对羊肚菌的分离提纯，拿到有效生物活性的杂多糖，是现代医药学研究的一个问题。
本发明的目的就是利用离子交换柱层析方法和凝胶柱层析等方法，从羊肚菌营养液中提取具有生物活性的一定分子量，官能团结构确定的纯多糖。
本发明的技术方案是这样的：采用去离子水为洗脱液，通过纤维素离子交换柱及凝胶柱，将由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖(摩尔比为0.29∶0.24∶0.61∶0.39)缩合而成，具有β-吡喃糖苷键、分子量为11500的杂多糖从羊肚菌营养液中得到的分子量为1-10万的粗多糖中分离出来。首先装填离子交换纤维素柱，取一定量的DE-52纤维素，将其浸泡在分析纯的三(羟甲基)氨基甲烷和盐酸混配的缓冲液中，使之pH值为9.6，使离子交换纤维素变为OH-型。将浸泡过的DE-52纤维素填入玻璃柱中，用蠕动泵输入三(羟甲基)氨基甲烷和盐酸混配的缓冲液，pH9.6，平衡适当的时间。第二步将用超滤方法从羊肚菌培养液中提取的分子量为1-10万的粗多糖溶于去离子水中，去离子水用量为充分溶解粗多糖为准，将溶解液直接慢慢上于柱头。用蠕动泵将去离子水注入离子交换纤维素柱，流速为0.8-1.2ml/min，时间为6-10小时，温度为室温。用馏分收集器以每5min收集一管，将洗脱液收集，然后用UV250PC紫外可见分光光度计做苯酚-硫酸法检测多糖峰位，合并单一峰多糖，将测定在490nm有最大吸收高峰的洗脱液收集。冷冻干燥后，将此单一多糖溶于蒸馏水中，蒸馏水用量以充分溶解此单一多糖为准，然后将其上柱于Sepharose CL-6B凝胶柱头，用蒸馏水充分洗涤、收集，将收集液再经过苯酚-硫酸法检测多糖峰位，收集在490nm高吸收峰位的收集液，脱盐冷冻干燥后，得到白色棉絮状单一多糖成品。
对单一多糖做如下测定：
单一多糖经KBr压片，按常规测定红外光谱，随后做H-NMR及13C-NMR核磁共振波谱分析。
1.分子量及纯度测定：本实验用高效液相色谱法鉴定多糖纯度，并测定其分子量。高效液相色谱仪为Waters 600，Ultrahydrogel 2000和Ultrahydrogel 500色谱柱串联，Waters 410型示差折光检测器。流动相为0.1mol/l磷酸盐缓冲液，流速为0.6ml/min。
测得单一多糖分子量为11500。
测得单一多糖在Waters HPLC上为单一对称峰。
2.高效毛细管电泳分析
取单一多糖10mg溶于1ml 1mol/L硫酸中，封管水解10h，中和，离心，上清液与α-萘胺衍生后进行HPCE分析。混和单糖标准采用同样方法衍生后进行分析。高效毛细管电泳实验条件：电压18KV，电流46μA，紫外检测波长254nm，硼砂缓冲液100mol/l，pH10.0。经测定此单一多糖是由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖(摩尔比为0.29∶0.24∶0.61∶0.39)等四种单糖残基为重复单元组成的杂多糖。
3.紫外光谱在260nm和280nm处未见蛋白质及核酸的特征吸收峰。元素分析结果为含碳39.11％，含氢为8.98％，不含氮。
4.红外光谱显示在4000cm-1-650cm-1区内具有多糖类物质的一般特征。在3500cm-1的吸收峰是游离OH的伸缩振动峰，在1024cm-1和1039cm-1为吡喃糖环的醚键C-O-C振动吸收峰；在890cm-1附近有β-糖苷键的特征吸收峰，而在840cm-1处没有α-糖苷键的特征吸收峰。在1H-NMR中δ4.80ppm的共振信号，即C1质子区的信号峰在5.0ppm以下，进一步证明糖苷键为β型。
以上实验证明，本发明获得的单一多糖为由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖(摩尔比为0.29∶0.24∶0.61∶0.39)缩合而成的，具有β-吡喃糖苷键的分子量为11500的杂多糖。
用DE-52纤维素离子交换和Sepharose CL-6B，以去离子水为洗脱液，对羊肚菌粗糖进行纯化分离得到四种单糖(木糖、葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖)残基为重复单元缩合而成的，其分子量为11500，具有β-吡喃糖苷键的杂多糖，工艺简单，操作方便，可以得到具有生物活性的一定分子量，官能团结构确定的纯多糖，为下一步研究羊肚菌多糖生物活性和走向更高层次的生化市场打下基础。
图1羊肚菌多糖在DE-52上洗脱曲线。
图2单一多糖凝胶渗透色谱洗脱曲线。
图3高效液相色谱对单一多糖的分子量测定图。
图4标准单糖和单一多糖水解物的高效毛细管电泳图。
图中：1.木糖、2、4.甘露糖、3.葡萄糖、5.阿拉伯糖、6.半乳糖
图5单一多糖的红外谱图。
实施例1
首先制备DE-52纤维素柱，取足够的DE-52纤维素，将其浸泡在分析纯的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，用HCl将其pH值调至9.6，使DE-52纤维素变为OH-型。然后将浸泡好的DE-52纤维素装填入一根Ф2.6×90cm的玻璃柱中，用蠕动泵输入三(羟甲基)氨基甲烷，pH9.6的缓冲溶液对柱中填料平衡二天。通过超滤从羊肚菌培养液中提取分子量为1-10万的粗多糖100mg，溶于1ml的去离子水中溶解，将其直接上样于DE-52纤维素玻璃柱头，用蠕动泵将去离子水注入DE-52纤维素柱，流速为0.93ml/min，洗脱粗多糖9个小时，用馏分收集器将洗脱液以每5分钟收集一管收集起来，用苯酚-硫酸法检测收集液的多糖峰位，仪器为日本岛津UV2501PC紫外分光光度计，收集在490nm有最大吸收高峰的洗脱液，将其冷冻干燥后，得到白色粉末，再将此单一多糖白色粉末溶于1ml蒸馏水中，将其上样于Sepharose CL-6B凝胶柱头，(凝胶柱为Ф1.6×80cm)，过柱，收集。用苯酚-硫酸法检测洗脱液的多糖峰位，收集高吸收值峰位的洗脱液，冷冻干燥，得到一种白色棉絮状单一多糖30.1mg。经KBR压片，按常规测定红外光谱，随后做H-NMR及13C-NMR核磁共振波谱分析，此白色棉絮状单一多糖为木糖、葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖缩合而成的具有β-吡喃糖苷键的分子量为11500的杂多糖。
实施例2
根据实施例1的方法获得1g羊肚菌粗多糖，将其溶于8ml的去离子水中，用实施例1的方法制得Ф2.6×90cm的DE-52纤维素柱，将配液上柱，用去离子水洗脱，流速为1.15ml/min，时间为8小时。用与实施例1同样的方法收集洗脱液，冷冻干燥后得到白色粉沫，将白色粉沫溶于蒸馏水中，经过Sepharose CL-6B凝胶柱的处理，最后得到301mg的棉絮状的单一多糖。经KBr压片，按常规测定红外光谱，做核磁共振波谱分析，此棉絮状单一多糖为木糖、葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖缩合而成的具有β-吡喃糖苷键的分子量为11500的杂多糖。
实施例3
用实施例1同样的工艺方法从羊肚菌粗多糖中提取木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖结实合而成的具有β-吡喃糖苷键的分子量为11500的杂多糖。取羊肚菌粗多糖1000g，DE-52纤维素柱为Ф0.5×2m，去离子水流速为0.8ml/min，时间为10小时，Sepharese CL-6B凝胶柱适当按比例增加体积。最后得到301g白色棉絮状单一多糖。经KBr压片，按常规进行红外光谱，随后做核磁共振波谱分析，此白色棉絮状单一多糖为预提取物。